Summary
Eine Technik, um die Lipidfloß Partitionierung von fluoreszierenden Proteinen an der Plasmamembran von lebenden Zellen Sonde beschrieben. Es nutzt die Unterschiede in der Verbreitung Zeiten von Proteinen innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. Acquisition können dynamisch in Kontrollbedingungen oder nach dem Medikament zusätzlich durchgeführt werden.
Abstract
In den letzten fünfzehn Jahren die Vorstellung, dass die Zellmembranen nicht homogen sind und sich auf Mikrodomänen, um ihre Funktionen ausüben, hat sich weitgehend akzeptiert. Lipid Rafts sind Mikrodomänen in Cholesterin und Sphingolipiden angereichert. Sie spielen eine Rolle bei der zellulären physiologischen Prozessen, wie Signal-, und Menschenhandel 1,2 sind aber auch gedacht, um wichtige Akteure in mehreren Krankheiten, darunter viralen oder bakteriellen Infektionen und neurodegenerativen Erkrankungen 3 sein.
Doch ihre Existenz ist noch immer umstritten 4,5. In der Tat hat Lipidfloß Größe geschätzt auf rund 20 nm 6 sein, weit unter der Auflösungsgrenze des konventionellen Mikroskopie (ca. 200 nm) und somit kein Direct Imaging. Bis jetzt waren die wichtigsten Techniken verwendet, um die Partition von interessierenden Proteinen in Lipid Rafts beurteilen Waschmittel resistenten Membranen (DRM) Isolierung und Co-Patching mit Antikörpern. Obwohl weit verbreitet becaNutzung ihrer eher einfache Implementierung, waren diese Techniken anfällig für Artefakte und damit 7,8 kritisiert. Technische Verbesserungen seien daher notwendig, um diese Artefakte zu überwinden und in der Lage, Lipid Rafts-Partition in lebenden Zellen zu untersuchen.
Hier präsentieren wir eine Methode für die empfindliche Analyse der Lipid Rafts Partition von fluoreszenz-markierte Proteine oder Lipide in der Plasmamembran von lebenden Zellen. Diese Methode, genannt Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS), stützt sich auf die Unterschiede in der Diffusionszeit von fluoreszierenden Sonden innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. In der Tat, da in beiden künstlicher Membranen und Zellkulturen nachgewiesen, würde Sonden diffundieren viel schneller außen als von innen dichten Lipidflößen 9,10. Um die Diffusion Zeiten zu bestimmen, winzigen Fluoreszenzfluktuationen als Funktion der Zeit in einem Fokalvolumen (etwa 1 Femtoliter) gemessen wird, liegt an der Plasmamembran von Zellen mit einem konfokalen Mikroskop (Abb.1). Die Autokorrelation Kurven kann dann aus diesen Schwankungen gezogen werden und mit geeigneten mathematischen Modellen Diffusion 11.
FCS kann die Lipidfloß Partitionierung der verschiedenen Sonden, solange sie fluoreszierend markiert sind zu bestimmen. Fluoreszenzmarkierung kann durch Expression von fluoreszierenden Fusionsproteine oder durch Bindung von fluoreszierenden Liganden erreicht werden. Darüber hinaus kann nicht nur in FCS künstlicher Membranen und Zelllinien, sondern auch in primären Kulturen verwendet werden, wie kürzlich beschrieben 12. Es kann auch verwendet werden, um die Dynamik des Lipidfloß Unterteilung nach Drogenabhängigkeit oder Membranlipid Änderung der Zusammensetzung 12 folgen werden.
Protocol
1. Die Kalibrierung des FCS-Setup
- Starten Sie den konfokalen Mikroskop, Laser, Computer, Inkubator für Temperatur und CO 2-Steuerung.
- Sicherstellen, dass die SPAD (Single Photon Avalanche Diode) ist und die Fluoreszenz-Filter innerhalb des SPAD ist gut, dass Ihre Probe geeignet. Prüfen, ob die SPAD in der Zeit synchronisiert wird. Vorsicht vor, um nur starten Sie Ihre FCS-Software, sobald Ihr SPAD Einstellungen bereit für den Erwerb sind.
- Eine frische Lösung von Cholera-Toxin-Alexa488, verdünnt in PBS auf eine Konzentration von 1 pg / ml (17,5 nM) zu erreichen.
- Optimieren konfokale Bildgebung der Lösung unter Verwendung interner Erkennung des Mikroskops.
- Wechseln Sie zu Scan-Modus zeigen und wählen Sie einen Punkt in der Lösung Probe. Achten Sie darauf, die Dauer der Laser-Beleuchtung ist lang genug, um Ihre FCS Akquisitionen durchführen (> 5 Minuten).
- Umschalten auf externe Erfassung durch die SPAD und dem FCS-Software. Überwachen Sie Ihre Fluoreszenz-Signal und stellen Sie sicher, es ist gut suiTed auf die SPAD (genug Signal, aber keine Sättigung, 10 000 bis 50 000 Counts / s ist in Ordnung). Falls erforderlich, ändern z-Position, Verstärkung und / oder Laserleistung, um eine korrekte Fluoreszenzsignal zu erzielen.
- Erwerben Sie 10 Sets von 30 Sekunden-Messungen. Acquisition Zeit sollte für Ihre Probe optimiert werden (am besten Kompromiss zwischen der Probenahme und Ausbleichen Probleme).
- Analysieren Sie Ihre Daten (siehe Schritt 4), um sicherzustellen, dass Sie eine Auto-Korrelation Kurve entsprechend einer fluoreszierenden Spezies diffundieren in Lösung (Gleichung in Abb. 2) haben und dass die Diffusion der Zeit nach der Montage erhalten korrekt ist (ca. 0,2 ms) (Abb. . 3).
2. Die Färbung von lebenden Zellen mit Lipid Rafts Marker
- Platte HEK293-Zellen auf 8-Well-Labteks mit Poly-L-Lysin (1mg/ml) am Tag zuvor Bildgebung, um sicherzustellen, dass ihre Haftung korrekt ist beschichtet. Verwendung Medium ohne Phenolrot, um sicherzustellen, dass keine Störung des Fluoreszenzsignals.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (Hanks-gepufferte Salzlösung).
- In Choleratoxin-Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) in 500 ul HBSS zu den Zellen für 30 Minuten bei 37 ° C Das Cholera-Toxin wird an Gangliosid GM1, bekannt, um vorzugsweise in Lipid Rafts partitioniert werden, zu binden.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (Hanks-gepufferte Salzlösung).
3. FCS Data Acquisition an lebenden Zellen
- Legen Sie die gefärbten Zellen auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie sicher, Temperatur und CO 2-Bedingungen sind optimal, da es sonst zu Artefakten in Diffusionszeiten führen.
- Optimieren konfokale Bildgebung von einer Zelle von Interesse unter Verwendung interner Erkennung des Mikroskops (Abb. 4).
- Wechseln Sie zu Scan-Modus zeigen und wählen Sie einen Punkt in der Plasmamembran der Zelle von Interesse. Führen Sie 1-2 Live-Bilder der Zelle, um sicherzustellen, dass die Zelle sich nicht bewegt, während der Akquisition.
- Umschalten auf externe Erfassung durch die SPAD und dem FCS weichenware. Überwachen Sie Ihre Fluoreszenzsignal und sicherzustellen, dass es gut ist mit dem SPAD geeignet (genug Signal, aber keine Sättigung, 10 000 bis 50 000 Counts / s ist in Ordnung). Falls erforderlich, ändern z-Position, Verstärkung und / oder Laserleistung, um eine korrekte Fluoreszenzsignal zu erzielen. Ist dies nicht genug ist, können Sie in Erwägung ziehen Färbungsbedingungen.
- Erwerben 10 Proben von 30 Sekunden Messungen. Da die meisten Zellen autofluoreszierende sind, können Sie eine Abnahme der Fluoreszenz in den ersten Akquisitionen zu sehen, durch Auto-Fluoreszenz Fading.
4. FCS Data Analysis
- Stellen Sie die Korrelation Intervall und erzeugen Autokorrelation Kurven mit dem FCS-Software. Die Korrelation Intervall wird in der Regel von der kürzeste auflösbare Zeitverzögerung bis die längste Zeit möglich ist (wie die Statistik der Messung wird mehr und mehr unzureichend, wenn maximale Korrelation Zeit nähert gesamte Messzeit, die maximale Zeitverzögerung wird zu 80% der begrenzten Reichweite Erfassungszeit auf der PicoquaNT-Software).
- Für jede Probe Exportieren von Dateien entsprechend Fluoreszenzfluktuationen und Auto-Korrelation als eine Funktion der Zeit.
- Verwenden Sie eine Datenanalyse und Anpass-Software, wie zum Beispiel Origin Pro, um die Dateien zu importieren.
- Für jede Probe stellen Sie sicher, es gibt keine Ausbleichen während der Akquisition, dh die Fluoreszenz bleibt während der 30 Sekunden stabil. Entsorgen Sie alle Maßnahmen, die Anzeige Photobleaching als diese künstliche Diffusion mal mehr verursachen können.
- Prüfen Sie, ob die Form des verbleibenden FCS Kurven korrekt ist (siehe Abb. 5). Bestimmen Sie die mittlere FCS-Kurve.
- Setzen Sie die Kurve mit den entsprechenden mathematischen Modells (Abb. 2). Diese Passform wird Ihnen die Diffusionszeit (n) und den Anteil der Moleküle diffundieren mit diesem (ESE) Diffusionszeit (n).
5. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für ein FCS-Kalibrierung mit einem Cholera-Toxin-Alexa488-Lösung wird in 3 gezeigt (3A), individuellen und durchschnittlichen FCS Kurven wurden berechnet. Mittlere FCS-Kurven wurden mit Gleichungen, die den verschiedenen Diffusionsmodelle (Beispiele in 2) angebracht ist. Der Parameter klassisch als die Qualität der Passung zu bestimmen, ist der Koeffizient der Bestimmung R 2. Je näher R 2 Anspruch 1, desto besser ist die Anpassung. In diesem Fall ist die genaueste Modell, um die mittlere FCS Kurvenanpassung die eine Beschreibung einer Population von fluoreszierenden Moleküle diffundieren frei in drei Dimensionen (Gleichung 1 in 2 und 3B). Die Diffusionszeit von der Passung abgeleitet beträgt 0,32 ms. Rückstände aus Kurvenanpassung (3C) und R 2-Faktor (0,99906) eine Schätzung der Qualität der Anpassung.
Ein Beispiel für FCS-Analyse für Cholera-Toxin-Alexa488 gefärbt HEK293 Zellen ist in 5 gezeigt. Die mehrphasige FCS mittlere Kurvenverlauf zeigt die Existenz von Populationen von fluoreszierenden Molekülen mit verschiedenen Diffusionszeiten. Die beste Anpassung für diese Kurve entspricht einem Modell mit drei Populationen von fluoreszierenden Sonden: zwei mit einem gehinderten Diffusion (Diffusion in zwei Dimensionen, wie in der Membran-Ebene) und ein frei diffundierenden in drei Dimensionen (Gleichung 2 in Abbildung 2 und Abbildung 5) . Diese letztere Bevölkerung entspricht fluoreszierende Moleküle sich außerhalb der Ebene der Membran, dh entweder Bindung oder Übermittlungsentgelt ihre Membrantargets, erreicht die Membran durch die Sekretion oder Recycling-Weg, oder aus der Membran durch Endozytose. Die beiden Diffusionszeiten an der Membran, entsprechend Choleratoxin gebunden an GM1, wurden 2 ms (25% der Moleküle), entsprechend der Diffusion außerhalb von Lipidflößen und 75 ms (50% der Moleküle), entsprechend der Diffusion in Lipidflößen . Bitte beachten Sie, dass jede PhotobleichmittelsIng. während der Akquisition wird die künstliche Diffusion mal länger damit möglicherweise die Schaffung eine Neigung zur Lokalisierung von GM1 in Lipid Rafts führen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des FCS Set-up (Bild aus Marquer et al modifiziert. 12)
Abbildung 2. Beispiel der Diffusion Modellen und entsprechenden Gleichungen verwendet werden, um Autokorrelationskurven passen. Die Struktur des Parameters S als S = z 0 / w 0 mit z 0 der effektiven Brennweite Radius entlang der optischen Achse bei 1 / e 2-Intensität und w0 die effektive la geschrieben werdenTeral Fokusradius bei 1 / e 2-Intensität. Diese Werte können von einem klassischen Point Spread Function (PSF) Messung extrahiert werden.
Abbildung 3. Bewertung der Diffusionszeit von Cholera-Toxin-Alexa488 in Lösung für FCS-Kalibrierung. A) Fluoreszenz Schwankungen als Funktion der Zeit für ein repräsentatives Beispiel einer 30 Sekunden Aufnahmezeit. B) Die mittlere Kurve Autokorrelation aus 10 Proben von 30 Sekunden Erwerb Gleichung 1 eingesetzt (siehe Abbildung 2). C) Rückstände aus Kurvenanpassung erhalten.
Abbildung 4. HEK-293 Zellen mit Cholera-Toxin-Alexa488 gefärbt. Die Zellen wurden auf einer SP5 konfokalen Mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) mit dem internen 488nm Laser-Linie abgebildet. Fluoreszenz wurde mit einem x60 Plan Achromat Ölimmersionsobjektiv zwischen 500 gesammeltund 650 nm auf.
Bild 5. Bewertung der Diffusionszeit von Choleratoxin-Alexa488 an der Plasmamembran der HEK293-Zellen. A) Mittlere Autokorrelation Kurve mit der Gleichung 2 eingesetzt (siehe Abbildung 2). B) Residuen aus Kurvenanpassung. (Ab Marquer et al modifiziert. 12)
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Discussion
Der FCS hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sensitive und schnelle Analyse der Lipid Raft Partitionierung von fluoreszierenden Sonden von Interesse in lebenden Zellen. FCS kombiniert die Genauigkeit der Lokalisierung der konfokalen Mikroskopie mit der Empfindlichkeit des Einzelphotonenzählung. Der Hauptunterschied zwischen FCS und biochemischen Standardtechniken ist, dass die FCS absolute Bestimmung der Lipid-Rafts Partition des Ziels und nicht die relative Partition ermöglicht wie es der Fall für DRM-Systeme isoliert oder Co-Patching.
Erwerb von FCS-Daten dauert etwa 5 Minuten (10 Akquisitionen von 30 Sekunden) für jede Probe und ist somit recht schnell als zu üblichen biochemischen Methoden verglichen. Diese Geschwindigkeit ist es möglich, in der Zeit folgen die Störung in Lipidfloß Partitionierung, die von Drogenabhängigkeit führen kann. Allerdings kann die Analyse von Autokorrelationskurven ein bisschen schwierig, da die verschiedenen Modelle für die Montage durch durchsucht werden, um das festzustellen, habenpräziseste. Darüber hinaus Ausbleichen während der Aufnahme ist zu vermeiden, da dies zu Artefakten führen kann.
Hier beschreiben wir ein Beispiel, wo wir die Lipidfloß Unterteilen eines Lipid abzugrenzen kann: Gangliosid GM1 (Abb. 5). Eine solche Studie wäre nicht mit Standard-biochemische Verfahren, die nur auf Proteine angewendet werden können, nicht möglich gewesen. FCS wird keine Lipide wenn beschränkt und kann auch für Proteine verwendet werden, entweder mit einem fluoreszierenden Liganden (zB Transferrin-Alexa555 bindet an den Transferrin-Rezeptor bekannt außerhalb von Flößen 9 angeordnet sein) oder exprimiert als ein Fusionsprotein mit einem fluoreszierenden Protein markiert (zB APP-YFP oder BACE1-GFP 9, zwei wichtige Spieler Protein bei Alzheimer-Krankheit). Es kann somit für eine Vielzahl von Targets verwendet werden. Ferner kann nicht nur in FCS-Zelllinien durchgeführt werden, wie hier beschrieben, sondern auch in primären Kulturen 9.
In Bezug auf Cholera-Toxin, sollten Sie im Hinterkopf behaltendass es eine Tendenz zur Aggregation GM1 in Pentamere, wodurch Membran-Mikrodomänen, die sich von nativen Lipidflößen kann. Deshalb können Sie nicht verwenden können Kolokalisation mit Cholera-Toxin, um festzustellen, ob Ihr Protein von Interesse ist, innerhalb oder außerhalb der Flöße. Dennoch diffundieren Membranproteine, wie APP-YFP und BACE1-GFP, in Lipid Rafts mit Diffusionszeiten von 60-80 ms 9, sehr ähnlich, was wurde mit Cholera-Toxin (75 ms) beobachtet. So Choleratoxin können Sie Ihre Set-up zu kalibrieren und prüfen Sie, ob Sie die Wahl zwischen schnellen und langsamen Diffusion Zeiten zu unterscheiden.
FCS ist auch für viele andere Anwendungen wie z. B. 13,14 Bestimmung der Oligomerisierung eines Proteins 15 oder Ligand / Rezeptor-pharmakologischen Studien 16 geeignet. Es kann auch zu anderen Mikroskopie-Techniken wie Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) 17,18 oder Stimulated Emission Depletion (STED) 19 gekoppelt werden.In der Tat ermöglicht STED-FCS eine noch genauere Bestimmung der Lipid Raft Partitionierungs-19 aber bis jetzt ist, ist die STED-Mikroskopie noch teuer und somit nicht weit verbreitet.
Die wichtigsten Grenzen des FCS sind die Notwendigkeit für niedrige Konzentrationen von Fluorophoren (im nanomolaren Bereich) und schnelle Diffusion Zeiten, so dass Fluorophore wird nicht Photobleichmittels vor dem Verlassen der Anregung Volumen. Ergänzende Techniken, um die Diffusion von Proteinen zu beurteilen sind FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) und ICS (Image Correlation Spectroscopy)-Techniken (Übersicht in 20).
In FRAP, wird eine hohe Intensität Laserstrahl verwendet, um einen Bereich einer Zelle und der Regeneration der Fluoreszenz nach Ausbleichen wird dann überwacht, Photobleichmittel. Diese Erholung kommt von der Diffusion der Fluorophore aus Nicht-gebleichten Bereiche der gebleichten Bereich. So sind die Diffusionszeiten können von den-Kinetik, extrahiert werden. FRAP mit hohen Konzentrationen verwendet werden of Fluorophore und können auf großen Bereich von Diffusionszeiten, wodurch es komplementär zu FCS. FRAP wurde verwendet, um festzustellen, ob ein Fluorophor mehrheitlich, innerhalb oder außerhalb von Flößen 21,22 war, aber es ist noch ein recht Bulk-Methode, um den Anteil von Fluorophoren Diffundieren innerhalb oder außerhalb Flößen in dem Bereich von Interesse zu quantifizieren.
ICS ist ein bildgebendes analogen von FCS, bei dem räumliche Korrelation Pixel berechnet wird, indem Pixel für ein Bild 23. Es hat den Vorteil, dass offen für die Untersuchung der langsam diffundierenden fluoreszierenden Sonden jedoch auf 2D-Analyse beschränkt. Diese Grenze wurde durch die Entwicklung der sogenannten ICS Räumlich-zeitliche ICS (STIKEN) 24 zu überwinden. STIKEN können räumlich-zeitliche Korrelation der fluoreszierenden Sonden auf einem Stapel von Bildern und ist somit eine leistungsfähige Technik wenn es eine Menge rechnerische Umsetzung erfordert und eine geringere zeitliche Auflösung als FCS. In der Tat sind sowohl ICS und STIKEN beschränkt zu viel langsamer ten Prozeßder Erwerb ein Mal von einem Bildrahmen. Eine weitere Verlängerung des ICS als Rasterdaten ICS (RICS) 25,26 ermöglicht die Analyse von schnellen Diffusion durch die Ausnutzung des Raster-Scan-Modus auf den meisten handelsüblichen konfokalen Mikroskopen. RICS ist vielseitig, wie es für eine große Verbreitung Bereich (von us bis ms), aber seine Umsetzung (Scan-Parameter, Datenverarbeitung) verwendet werden kann, kann mühsam sein. Wir fanden nicht viele Papiere in der Literatur die Berichterstattung über die Verwendung von ICS und die davon abgeleiteten Techniken zu studieren Lipid Rafts 27-29.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von Agence Nationale de la Recherche (ChoAD) unterstützt. Wir sind auch dankbar, dass der Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) für ihre finanzielle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 µm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 | |
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
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