Summary
生きた細胞の原形質膜における蛍光タンパク質の脂質ラフトのパーティショニングを調べるための手法が説明されています。これは、脂質ラフトの内側または外側に位置するタンパク質の拡散時間に格差を利用しています。買収は、コントロール条件でまたは薬物を添加した後、動的に実行することができます。
Abstract
過去15年間で、細胞膜が均一ではありませんし、その機能を発揮するマイクロドメインに依存している概念は広く受け入れられるようになっています。脂質ラフトは、コレステロールとスフィンゴ脂質に富んだ細胞膜マイクロドメインである。彼らはこのようなシグナル伝達などの細胞生理学的プロセスにおいて役割を果たしており、人身売買の1,2だけでなく、ウイルスや細菌感染症や神経変性疾患の3を含むいくつかの疾患の主要なプレーヤーであると考えられている。
まだ彼らの存在は依然として論争4,5の問題です。確かに、脂質ラフトの大きさは、このように彼らのダイレクトイメージングを排除し、はるかに、従来の顕微鏡の分解能の限界（200 nm付近）の下で、約20 nmの6であると推定されている。現在までに、脂質ラフト内の目的タンパク質のパーティションを評価するために使用される主な技術は、界面活性剤耐性膜（ラフト）抗体を用いた分離と共同パッチでした。でも広く使われているbeca彼らは、むしろ簡単な実装を使用して、これらの技術は工芸品に傾向があったので、7,8を批判した 。技術的な改良は、したがって、これらの工芸品を克服し、生きた細胞における脂質ラフトのパーティションを調べることができるように必要であった。
ここでは、生きた細胞の細胞膜に蛍光タグタンパク質や脂質の脂質ラフトパーティションの高感度分析手法を提案する。このメソッドは、蛍光相関分光法（FCS）と呼ばれる、脂質ラフトの内側または外側に位置する蛍光プローブの拡散時間の格差に依存しています。実際には、人工膜や細胞培養の両方で明らかなように、プローブは、はるかに高速外緻密な脂質ラフト9,10の内側よりも拡散するだろう。拡散時間を決定するために、分蛍光変動がある（ 図共焦点顕微鏡で細胞の細胞膜に位置し、焦点体積（約1フェムトリットル）内の時間の関数として測定される1）。自己相関曲線は、これらの変動から引き出され、適切な数学的拡散モデル11に取り付けることができます。
FCSは、それらが蛍光標識されている限り、様々なプローブのパーティショニング脂質ラフトを決定するために使用することができます。蛍光タグは、蛍光融合蛋白質の発現によって、または蛍光リガンドの結合によって達成することができます。また、FCSは、最近12を説明したように、人工の膜と細胞株でも初代培養だけでなく使用することができます。また、薬剤の添加や膜脂質組成の変化12の後にパーティショニング脂質ラフトの動態を追跡するために使うことができます。
Protocol
1。 FCSセットアップのキャリブレーション
- 温度とCO 2制御のための共焦点顕微鏡、レーザー、コンピューター、インキュベーターを開始します。
- SPAD（単一光子アバランシェダイオード）が上にあり、SPAD内部の蛍光フィルターはよくあなたのサンプルに適していることを確認してください。 SPADは、時間で同期されていることを確認します。あなたのSPAD設定が取得の準備ができているに一度だけあなたのFCSのソフトウェアを起動するために注意してください。
- 1μg/ mlの（17.5 nm）の濃度に到達するためにPBSで希釈したコレラ毒素-Alexa488の新鮮な溶液を調製します。
- 顕微鏡の内部検出を使用したソリューションの共焦点イメージングを最適化します。
- スキャンモードを指し、溶液試料中のポイントを選択するスイッチ。レーザー照射の時間は（> 5分）あなたのFCSの買収を実行するために十分な長さであることを確認してください。
- SPADによる外部検出およびFCSのソフトウェアに切り替えます。あなたの蛍光シグナルを監視し、それがよく隋であることを確認してくださいSPADのテッド（十分な信号がない彩度、10 000 50 000までカウント/ sで結構です）。必要であれば、z位置、利得および/または適切な蛍光シグナルを達成するためにレーザーパワーを変更します。
- 30秒測定の10セットを取得します。アクイジション時間（最高サンプリングと退色の問題の間の妥協点）をサンプル用に最適化する必要があります。
- 図 （（約0.2ミリ）が溶液中に拡散1蛍光種に対応する自己相関曲線（ 図の式2）を持っていることを確認して、フィッティング後に得られる拡散時間が正しいことをする（ステップ4を参照）データを分析する3）。
2。脂質ラフトマーカーと共に生きた細胞の染色
- ポリ-L-リジン（1mg/ml）の接着が正しいことを確認するために、イメージングの前日で被覆された8ウェルLabteks上にプレートしたHEK293細胞。蛍光シグナルのない摂動がないことを確認するにはフェノールレッドを含まない培地を使用しています。
- HBSS（ハンクス緩衝塩溶液）で細胞を2回洗浄します。
- 37℃で30分間細胞に500μlのHBSSでコレラ毒素-Alexa488（1μg/ ml）を/ BSA（0.1％）を追加℃、コレラ毒素は、優先的に脂質ラフトに分割することが知られているガングリオシドGM1に結合するであろう。
- HBSS（ハンクス緩衝塩溶液）で細胞を2回洗浄します。
3。生きている細胞にFCSデータ·アクイジション
- 顕微鏡ステージ上で染色した細胞を配置します。温度とCO 2の条件は、これは拡散時間の工芸品につながる可能性がありそうでなければ最適であることを確認してください。
- 顕微鏡内部の検出（ 図4）を使用して、目的の細胞の共焦点イメージングを最適化します。
- スキャンモードを指し、目的の細胞の原形質膜内のポイントを選択して切り替えます。細胞が取り込み中に移動されていないことを確認するには、セル1-2のライブ映像を実行します。
- SPADすることにより、外部検出に切り替えて、FCSソフトにウェア。あなたの蛍光シグナルを監視し、それがよく（十分な信号がない彩度、10 000から50 000カウント/ sは結構です）SPADに適していることを確認してください。必要であれば、z位置、利得および/または適切な蛍光シグナルを達成するためにレーザーパワーを変更します。これが十分でない場合は、染色条件を変えると考えるかもしれません。
- 30秒測定の10サンプルを取得します。ほとんどの細胞は自動蛍光性であるように、自家蛍光フェージングに起因する、最初の買収時の蛍光の減少が表示されることがあります。
4。 FCSデータ解析
- 相関間隔を設定し、FCSのソフトウェアとの自己相関曲線を生成します。相関間隔は一般的に最大の相関時間は合計捕捉時間に近づくと最短解決の遅れ時間から最大可能な最長時間に（測定の統計はますます不十分になると、最大遅延時間が80％に制限されている範囲になりますPicoqua上に捕捉時間NTソフトウェア）。
- それぞれのサンプルについては、時間の関数としての蛍光の変動と自己相関に対応するファイルをエクスポートします。
- データ分析と、そのようなファイルをインポートするには、Originのプロとしてフィッティングソフトウェアを使用しています。
- それぞれのサンプルについては、蛍光が30秒の間に安定したまま、すなわち全く退色は、取得時に存在しないことを確認してください。これは人工的な長い拡散時間の原因となりますので退色が表示され、任意の測定値を破棄します。
- 残りのFCSカーブの形状は（ 図5参照）が正しいことを確認します。平均FCSカーブを決定します。
- 適切な数学モデル（ 図2）カーブに合う。このフィットは、あなたの拡散時間（s）と、この（ESE）の拡散時間（s）と拡散分子の割合を与える。
5。代表的な結果
コレラ毒素Alexa488ソリューションとFCSのキャリブレーションの例を図3に示されている図3A）を示す個人やFCSカーブを算出したわけではありませんでした。 FCSカーブは様々な拡散モデル（ 図2の例）に対応する方程式を装備したを意味します。古典的なフィットの質を決定すると考えパラメータは、決定係数R 2である。 R 2に近い優れた、1に適合している。このケースでは、平均FCSカーブに合わせて、最も正確なモデルが3次元（ 図2および図3Bの式1）で自由に拡散する蛍光分子の集団を記述するものです。フィットから派生した拡散時間は0.32ミリ秒です。カーブフィッティング（ 図3C）およびR 2は係数（0.99906）からの残差はフィットの品質の推定値を与える。
コレラ毒素Alexa488で染色HEK2のFCS解析の例93細胞は、 図5に示します。多面平均FCSカーブの形状が異なる拡散時間で蛍光分子の集団の存在を明らかにする。妨げ拡散（膜面内の2つの次元の拡散）の2次元および3次元で自由に拡散します（ 図2と図5の式（2））：この曲線のベストフィットは、蛍光プローブの3つの集団を持つモデルに対応。この後者の集団は、分泌物やリサイクル経路を介して膜に到達するか、エンドサイトーシスによって細胞膜を残し、それらの膜ターゲットへのバインディングまたはアンバインドのいずれかの膜面、すなわち、外に移動する蛍光分子に対応しています。 GM1に結合したコレラ毒素に対応した膜で2つの拡散時間は、脂質ラフトの外に拡散に対応した2つのMS（分子の25％）と、脂質ラフトの拡散に対応する75ミリ秒（分子の50％）であった。すべての光退色に注意してください買収時のINGは、人工的な長い拡散時間はこうしておそらく脂質ラフトドメインのGM1の局在化に向かってバイアスを作成することにつながるでしょう。
図1。FCSセットアップ（Marquerらから変更された画像12）の模式図
図2拡散モデルと自己相関曲線をフィットするために使用される対応する式の例を次に示します。構造パラメータSはS = Z 0 / W、Z 0 0 1 / e 2の強度で光軸に沿って効果的な焦点の半径とW0効果的なアラカルトのように書くことができます1 / e 2の強度でteralフォーカル半径。これらの値は、古典的な点広がり関数（PSF）の測定から抽出することができます。
図3 FCSキャリブレーション用溶液中でのコレラ毒素Alexa488の拡散時間の評価。 30秒の買収の代表例の時間の関数としてA）蛍光変動。 B）式（1）を装備し、30秒の取得の10サンプル（図2を参照）。C）曲線の当てはめからの残差から得られる自己相関曲線を意味します。
図4：HEK-293細胞は、コレラ毒素-Alexa488で染色した。細胞は内部488nmのレーザーラインでSP5共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ、ヴェッツラー、ドイツ）上に結像された。蛍光は500〜X60プランアポクロマートの油浸対物レンズで集められた650 nmである。
図5。HEK293細胞の細胞膜におけるコレラ毒素-Alexa488の拡散時間の評価。 A）（ 図2を参照）、式（2）を装備し、自己相関曲線を意味します。 Bカーブフィッティングから）残差。 （Marquerらから変更された12）
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Discussion
ここで紹介するFCS法は、生きた細胞への関心の蛍光プローブの分割脂質ラフトの高感度で迅速な分析を可能にします。 FCSは、単一光子計数の感度を持つ共焦点顕微鏡の局在化の精度を兼ね備えています。 FCS、標準的な生化学的手法の主な違いは、ラフトの分離又は共パッチの場合のようにFCSがターゲットの脂質ラフトのパーティションではなく、相対的なパーティションの絶対的な決定を可能にすることです。
FCSデータの取得は、各サンプルのために約5分（30秒10の買収）を取り、通常の生化学的手法に比べて、したがって、非常に急速である。この速度は、それが可能な時間に薬物添加に起因するかもしれない脂質ラフトのパーティショニングの摂動を追跡することができます。フィッティングのためにさまざまなモデルを決定するために介して閲覧する必要がありますしかし、自己相関曲線の分析は少しトリッキーなことができます。最も正確なもの。また、取得時に退色することにより、このアーティファクトにつながる可能性がありますので避けなければなりません。
ガングリオシドGM1（ 図5）：ここで我々は、脂質のパーティショニング脂質ラフトを描くことができる例について説明します。このような研究は、タンパク質だけに適用できる標準的な生化学的手順では不可能でした。 FCSはかかわらず、脂質に限定されるものではなく、また、いずれかの蛍光リガンド（例えばトランスフェリン-Alexa555は、トランスフェリン受容体に結合し、ラフト9の外側に配置することが知られている）でタグ付きまたは蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現、タンパク質を使用することができます（例えば、APP-YFPまたはBACE1-GFP 9、アルツハイマー病の2つの重要なタンパク質の選手）。それは、このようにターゲットの広い範囲に使用することができます。さらに、FCSは、ここで説明したように細胞株ではなく、初代培養9だけでなく実装することができます。
コレラ毒素について、あなたは心に留めておくべきそれはそれは、このように、ネイティブの脂質ラフトとは異なる場合があります細胞膜マイクロドメインを作成し、五量体に集約GM1への傾向があります。あなたが興味のあるタンパク質は、内部または外部のラフトのかどうかを判断するためにコレラ毒素とcolocalisationを使用することはできません理由です。コレラ毒素（75ミリ秒）で観察されたものと非常によく似たようなAPP-YFPとBACE1-GFP、60から80ミリ秒9の拡散時間と脂質ラフトのびまん性としてそれにもかかわらず、膜タンパク質、。したがって、コレラ毒素はあなたのセットアップをキャリブレーションして、高速および低速拡散時間を区別することができることを確認するために使用することができます。
FCSはまた、蛋白質15またはリガンド/受容体の薬理学的研究16のオリゴマー状態の判定として、他の多くのアプリケーション13,14に適しています。それはまた、全内部反射蛍光（全反射）17,18または誘導放出枯渇（STED）19などの他の顕微鏡技術に結合させることができる。確かに、STED-FCSは、19分割脂質ラフトのさらに正確な測定を使用できますが、現在までに、STED顕微鏡はまだ高価なため、広範囲ではありません。
FCSの主な限界は蛍光体が励起ボリュームを離れる前に退色しないよう蛍光物質の低濃度（ナノモル範囲内）と高速拡散時間の必要性があります。タンパク質の拡散を評価するための補完的な技術はFRAP（光退色後蛍光回復）とICS（画像相関分光法）技術を（20に日）が含まれています。
FRAPでは、高強度のレーザ光は、セルの領域を退色するために使用され、退色後蛍光回復はして監視されています。この回復は無漂白の分野から漂白された領域に蛍光体の拡散に由来します。したがって、拡散時間は、回復の速度論から抽出することができます。 FRAPは、高濃度のOで使用することができますF蛍光体とその結果FCSには、相補的な製造、拡散時間の広い範囲にアクセスできます。 FRAPは、蛍光色素がmajoritarily内部またはラフト21,22の外側にあったかどうかを評価するために使用されるが、それでも興味のあるエリア内の蛍光物質拡散の内側または外側のラフトの割合を定量化するためではなく、バルク法であるされています。
ICSは、空間的な相関関係が与えられた画像23のピクセルごとに計算されているFCSの画像アナログです。それが徐々に拡散蛍光プローブの研究に従順であるという利点を持っていますが、2次元解析に限定されています。この制限は、時空間ICS（STICS）24と呼ばれるICの開発によって克服されました。 STICS画像のスタック上に蛍光プローブの時空間相関を可能にし、それは計算の実装の多くを必要とし、FCSよりも低い時間分解能を持っていますがこのように強力な手法です。実際には、ICSとSTICS両方が非常に遅く目を処理するために制限されていますつの画像フレームの取得時間。 ICSの別の拡張子は、25,26は、多数の商用共焦点顕微鏡で利用可能なラスタースキャンモードを利用して高速拡散過程の解析を可能にするラスターICS（RICS）と呼ばれる。それは大規模な拡散範囲（μsからミリ秒まで）に使用することができますが、その実装（スキャンパラメータは、データ処理）が煩雑になる可能性がありますようにRICSは汎用性があります。我々は、脂質ラフト27-29勉強するICSおよびその派生技術の使用を報告して文学の多くの論文を見つけることができませんでした。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、AFP通信国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ChoAD）からの助成金によってサポートされていました。我々はまた、財政支援のための財団ICM（研究所·デュ·CerveauらデラMoelle）に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 µm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 | |
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
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