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Biology

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

doi: 10.3791/3513 Published: April 6, 2012

Summary

살아있는 세포의 플라즈마 막의 형광 단백질 지질 뗏목의 파티션을 알아내기 위해 기술이 설명되어 있습니다. 그것은 지질 보트 내부 또는 외부에있는 단백질의 확산시기에 불균형을 이용합니다. 취득이 통제 조건이나 약물 이외 후에 동적으로 수행할 수 있습니다.

Abstract

한 것 같아요 년 동안 세포 점막이 동질하지 않습니다 그들의 기능을 발휘하기 위해 microdomains에 의존하는 개념이 널리 인정되고있다. 지질 보트는 콜레스테롤과 sphingolipids에 풍부한 멤브레인 microdomains입니다. 그들은 같은 신호 전달과 같은 셀룰러 생리적 과정에 역할을하고, 인신 매매 1,2뿐만 아니라 바이러스성 또는 세균성 감염과 neurodegenerative 질병 등 여러 질병의 주요 선수가 될 것으로 생각됩니다.

그러나 그들의 존재는 아직 논란 4,5의 문제입니다. 사실, 지질 뗏목 크기 때문에 그들의 직접적인 이미지를 precluding, 지금까지 기존의 현미경 (200 nm의 정도)의 해상도 제한을, 약 20 nm의 6 것으로 추정되었습니다. 지금까지 지질 보트 내부에 관심 단백질의 파티션을 평가하는 데 사용되는 주요 기술은 세제 강한 세포막 (DRMs) 항체와 고립과 공동 패치했다. 비록 널리 사용 베카자신보다는 쉬운 구현의 사용,이 기술은 유물하는 경향이 있었다 그래서 7,8를 비난했다. 기술 개선 따라서 이러한 유물을 극복하는 생활 세포에 지질 보트 파티션을 알아내기 수있을 필요가 있었다.

여기에서 우리는 살아있는 세포의 플라즈마 막의 fluorescently 태그가 추가된 단백질 또는 lipids의 지질 보트 파티션의 민감한 분석 방법을 제시한다. 이 방법은, 형광 상관 분광학 (FCS) 되나, 지질 보트 내부 또는 외부에있는 형광 프로브의 확산 시간의 차이에 의존합니다. 사실, 같은 인공 세포막과 세포 배양 모두에서 입증, 프로브는 훨씬 빠르게 외부 조밀한 지질 보트 9,10 내부보다는을 무마 것이다. 확산 시간을 확인하려면, 분 형광 변화는 (그림 공촛점 현미경으로 세포의 플라즈마 막에 위치, 초점 부피 (약 1 femtoliter)에서 시간의 함수로 측정1). 자기 상관 곡선 그러면 이러한 변화에서 그려진하고 적절한 수학적 확산 모델 11가 장착되어 수 있습니다.

FCS는 그들이 fluorescently 태그만큼 다양한 프로브의 파티션 지질 뗏목을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 태그는 형광등 융합 단백질의 표현이나 형광 리간드의 바인딩에 의해 형성될 수 있습니다. 또한, FCS는 등 최근 12 설명된 인공 세포막과 세포 라인에서뿐만 아니라 차 문화에서뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 또한 약물 외에이나 멤브레인 지질 조성의 변화 12 이후 지질 뗏목 파티션의 역학을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

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1. FCS 설치의 보정

  1. 공촛점 현미경, 레이저, 컴퓨터, 온도에 대한 보육 및 CO 2 제어를 시작합니다.
  2. SPAD는 (단일 광자의 애벌 란시 다이오드)에 있고 SPAD 내부의 형광 필터가 잘 샘플에 적합되어 있는지 확인하십시오. SPAD는 시간에 동기화되었는지 확인합니다. 당신의 SPAD 설정이 인수 준비에 한번에만 FCS 소프트웨어를 시작합니다 조심하십시오.
  3. 1 μg / ML (17.5 NM)의 농도에 도달하기 위해 PBS에 희석 콜레라 독소-Alexa488의 새로운 솔루션을 준비합니다.
  4. 현미경의 내부 검색을 사용하여 솔루션의 공촛점 이미징을 최적화합니다.
  5. 스캔 모드를 가리 키와 솔루션 예제에서 지점을 선택하여 전환합니다. 레이저 조명의 기간은 (> 5 분)하여 FCS의 인수를 수행할 충분히 있는지 확인하십시오.
  6. SPAD에 의한 외부 감지와 FCS 소프트웨어로 전환합니다. 당신의 형광 신호를 모니터링하고 잘 수이인지 확인SPAD에 테드 (충분한 신호 그런데 채도, 10 50 000 카운트로 000 / s는 상관 없습니다.) 필요한 경우, Z 위치, 이득 및 / 또는 정확한 형광 신호를 달성하기위한 레이저 전원을 수정합니다.
  7. 삼십초 측정의 10 세트를 취득. 수집 시간 (최고 샘플링과 photobleaching 문제 사이의 절충) 샘플에 최적화되어야합니다.
  8. 당신 솔루션에서 diffusing 한 형광 종이에 대응하는 자동 상관 관계 곡선 (그림. 2의 방정식)가 있는지 확인하고 피팅 후 얻은 확산 시간 (그림 (약 0.2 MS)가 올바른지하는 데이터를 (4 단계 참조) 분석 . 3).

2. 지질 보트 마커로 살아있는 세포의 염색법

  1. 폴리-L-라이신 (1mg/ml)은 접착이 올바른지 확인하기 위해 이미징 전날 코팅 8도 Labteks에 플레이트 HEK293 세포. 형광 신호에 대한 불안의 원인이 없다는 보장 페놀 레드 않고 매체를 사용하십시오.
  2. HBSS (행크의 버퍼 식염수)로 두 번 세포를 씻으십시오.
  3. 37시 30 분 세포를 500 μl HBSS에 콜레라 독소-Alexa488 (1 μg / ml) 쇼핑 / BSA (0,1 %)를 추가 ° C. 콜레라 독소는 우선적 지질 보트에 분할 것으로 알려져 ganglioside GM1,에 바인딩됩니다.
  4. HBSS (행크의 버퍼 식염수)로 두 번 세포를 씻으십시오.

3. 리빙 셀에 FCS 데이터 수집

  1. 현미경 스테이지에있는 스테인드 세포를 놓습니다. 조건이 확산 시대 유물로 이어질 수도 달리 최적 있는지 온도 및 CO를 확인하십시오.
  2. 현미경의 내부 검출 (그림 4)를 사용하여 관심있는 셀 공촛점 이미징을 최적화합니다.
  3. 스캔 모드를 지정과 관심의 세포의 플라즈마 막에서 지점을 선택하여 전환합니다. 세포가 인수하는 동안 움직이지 않고지지 않도록하기 위해 세포에서 한두 라이브 이미지를 수행합니다.
  4. SPAD에 의해 외부 감지로 전환하여 FCS 소프트에야키. 당신의 형광 신호를 모니터링하고 그것을 잘 (충분한 신호 그런데 채도, 10 000-50 000 건의 / s는 상관 없습니다) SPAD에 적합해야합니다. 필요한 경우, Z 위치, 이득 및 / 또는 정확한 형광 신호를 달성하기위한 레이저 전원을 수정합니다. 이것이 충분하지 않다면, 당신은 염색법 상태를 변경해 볼 수도 있습니다.
  5. 삼십초 측정 10 표본을 습득. 대부분의 세포가 자동 형광있는 바와 같이, 당신은 자동 형광 페이딩으로 인해, 첫 번째 인수 중에 형광의 감소를 볼 수 있습니다.

4. FCS 데이터 분석

  1. 상관 관계 간격을 설정하고 FCS 소프트웨어와 자동 상관 관계 곡선을 생성합니다. 상관 간격은 일반적으로 짧은 확인할 지연 시간에서 최대 가능한 최장 시간 (측정의 통계가 점점 더 불충 분한 최대 상관 관계 시간이 총 획득 시간에 도달하면되면서, 최대 지연 시간의 80 %로 제한됩니다로 다양합니다 Picoqua의 획득 시간NT 소프트웨어).
  2. 각 샘플의 경우, 시간의 함수로 형광 변동 및 자동 상관 관계에 해당하는 파일을 내보냅니다.
  3. 데이터 분석과 같은 파일을 가져올 프로 유래 등의 맞춤 소프트웨어를 사용합니다.
  4. 각 샘플의 경우 형광이 삼십초 동안 안정적으로 유지 즉, 아무런 photobleaching가 수집하는 동안이 없습니다 있는지 확인하십시오. 이것이 인공 더 이상 확산 시간을 일으킬 수 있으므로 photobleaching 표시하는 어떠한 조치를 폐기하십시오.
  5. 남은 FCS 곡선의 모양은 (그림 5 참조)이 올바른지 확인합니다. 평균 FCS 곡선을 결정합니다.
  6. 적절한 수학적 모델 (그림 2)와 함께 커브를 맞습니다. 이 맞는 사람에게 확산 시간 (s)이 (ESE) 확산 시간 (s)와 diffusing 분자의 비율을 제공합니다.

5. 대표 결과

콜레라 독소-Alexa488 솔루션 FCS 교정의 예제는 그림 3에 나와 있습니다 (그림 3A), 개별을 표시하고 FCS 곡선 건 아니었지만 확인 후 계산되었다. 민 FCS 곡선은 다양한 확산 모델 (그림 2의 예제)에 해당하는 방정식으로 장착되었다. 고전적인 발작의 품질을 결정하는 것으로 간주 매개 변수는 결정 계수 R 2입니다. 가까이 R 2는 더 적합, 1입니다. 이 경우 평균 FCS 곡선에 맞게 가장 정확한 모델은 세 가지 차원 (그림 2 및 그림 3B의 방정식 1) 자유롭게 diffusing 형광 분자의 인구를 설명하는 하나이다. 맞춤에서 파생된 확산 시간은 0.32 MS입니다. 커브 - 피팅 (그림 3C) 및 R 2 요인 (0.99906)에서 Residuals는 적합의 품질의 견적을 제공합니다.

콜레라 독소-Alexa488 스테인드 HEK2위한 FCS 분석의 예93 전지는 그림 5에 표시됩니다. multiphasic 평균 FCS 곡선의 모양이 서로 다른 확산 시간과 형광 분자의 인구의 존재를 보여준다. 방해 확산 (막 비행기에서와 같이 2 차원 확산) 및 3 차원에 자유롭게 diffusing 한 (그림 2와 그림 5의 방정식 2) 두 :이 커브를위한 최고의 경우엔 형광 프로브 세 인구와 모델에 해당합니다 . 이 후자의 인구 분비이나 재활용 경로를 통해 세포막에 도달하거나, endocytosis에 의해 세포막을 떠나는 그들의 멤브레인 목표에 바인딩하거나 unbinding 중 막 비행기, 즉 밖으로 나간 형광 분자에 해당합니다. GM1에 바인딩 콜레라 독소에 해당하는 멤브레인에서 두 확산 번, 지질 보트의 외부 확산에 대응하는 두 석사 (분자의 25 %), 그리고 지질 보트의 확산에 대응하는 75 MS (분자의 50 %), 있었다 . 유의하십시오 어떤 photobleach인수 기간 동안 ING는 인공 더 이상 확산 시간이 있으므로 가능한 지질 뗏목 도메인에서 GM1의 국산화 향해 편견을 만드는 이어질 것입니다.

그림 1
그림 1. FCS 설정 (Marquer 외으로부터 수정한 그림. 12)의 도식 표현

그림 2
그림 2. 확산 모델과 상관 곡선에 맞게 사용하는 해당 방정식의 예. 구조 매개 변수 S는 1 / E 2 농도와 w0 효과 라의 광학 축을 따라 S = Z와 z는 0 / w 0 0 유효 초점 반경과 같이 쓸 수1 / E 2 농도에서 teral 초점 반경. 이 값은 고전 점 확산 함수 (PSF) 측정에서 추출 할 수 있습니다.

그림 3
그림 3. FCS 보정을위한 솔루션에서 콜레라 독소-Alexa488의 확산 시간 평가. 30 초 인수의 대표적인 예를 들어 시간의 함수로) 형광 변동. B) 방정식 1 들으며 삼십초 취득 10 샘플 (그림 2 참조). C) 커브 피팅에서 Residuals에서 얻은 상관 곡선을 뜻합니다.

그림 4
그림 4. HEK-293 세포는 콜레라 독소-Alexa488 물들일. 전지는 내부 488nm 레이저 라인 SP5 공촛점 현미경 (Leica 이크로, Wetzlar, 독일)에 몇 군데 있었다. 형광 500 사이 x60 계획 고차 색지움 기름 침지 목표로 수집되었습니다와 650 nm의.

그림 5
그림 5. HEK293 세포의 플라즈마 막에서 콜레라 독소-Alexa488의 확산 시간 평가. ) (그림 2 참조) 방정식이 장착되어 상관 곡선을 뜻합니다. B 커브 피팅에서) Residuals. (Marquer 외에서 수정했습니다. 12)

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Discussion

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FCS 메서드는 여기에 제시된 것은 살아있는 세포에 대한 관심의 형광 프로브의 지질 뗏목 파티션의 민감하고 빠른 분석을 가능하게합니다. FCS는 단일 광자 계수 장치의 감도와 공촛점 현미경의 국산화에의 정확성을 결합한 제품입니다. FCS 및 표준 생화 학적 기법의 주요 차이점은 DRMs 절연 또는 공동 패치의 경우는 같이 FCS가 대상의 지질 보트 파티션이 아닌 상대적인 파티션의 절대적인 판단을 가능하게한다는 것입니다.

FCS 데이터의 수집은 각 샘플에 대해 약 5 분 (30 초 10 인수) 소요되며 일상 생화 학적 기법에 비해 따라서 상당히 빠른 속도이다. 이 급속도는 가능한 시간에 약물뿐만 아니라 인해 발생할 수있는 지질 뗏목 파티션의 섭동를 따릅니다 수 있습니다. 피팅에 대한 서로 다른 모델을 결정 훑어해야 그러나 상관 곡선의 분석은 조금 까다롭습 될 수 있습니다가장 정확한 하나. 또한, 수집하는 동안 photobleaching 것은이 유물을 초래할 수 있으므로 피해야한다.

ganglioside GM1 (그림 5) : 여기 우리는 지방질의 파티션 지질 뗏목을 윤곽을 그리다 수있는 예제를 설명합니다. 이러한 연구는 단백질에 적용할 수있는 표준 생화학 절차를 수 없었을 거에요. FCS는하지만 lipids로 제한되지 않으며 또한 단백질에 사용할 수 역시 형광 리간드 (예 트랜스페린-Alexa555는 보트 9 밖에있는 것으로 알려져 트랜스페린 수용체에 바인딩)이나 형광 단백질과의 융합으로 표현을 적었 (예 : APP-YFP 또는 Bace1-GFP 9, 알츠하이머 질환의 두 가지 핵심 단백질 플레이어). 그것은 따라서 대상의 광범위한 사용하실 수 있습니다. 또한, FCS는 차 문화 9 또한 여기에서 설명된대로, 세포 라인에서뿐만 아니라 구현하지만, 할 수 있습니다.

콜레라 독소에 관해서, 당신은 염두에 두어야 할그게 따라서 멤브레인 원시 지질 보트와 다를 수 마이크로 도메인을 만들 pentamers의 집계 GM1하는 경향이있다. 관심의 단백질이 내부 또는 외부 보트에 있는지 확인하기 위해 콜레라​​ 독소로 colocalisation를 사용할 수없는 이유입니다. 그럼에도 불구하고, 그러한 APP-YFP 및 Bace1-GFP와 같은 멤브레인 단백질은 어떤 콜레라 독소 (75 MS)와 함께 관찰되었다에 MS 9, 매우 유사 60-80의 확산 시간과 지질 보트에 확산. 따라서 콜레라 독소는 설정을 교정하고 빠르고 느린 확산 시대 구분 수 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

FCS는 또한 단백질 15 리간드 / 수용체 pharmacological 연구 16 oligomerisation 상태의 결정과 같은 많은 다른 응용 프로그램 13,14에 적합합니다. 그것은 또한 총 내부 반사의 형광 (TIRF) 17,18 또는 자극 방출 고갈 (서도 전혀 두려움을 모르는 강인한) 19과 같은 다른 현미경 기술을 결합하여 할 수 있습니다.사실,서도 전혀 두려움을 모르는 강인한-FCS는 19를 파티션 지질 뗏목의 더욱 정확한 판단이 가능하지만, 지금까지,서도 전혀 두려움을 모르는 강인한 현미경은 여전히 비용 때문에 확산되지 않습니다.

FCS의 주요 한계는 fluorophores의 낮은 농도 (nanomolar 범위에서)과 빠른 확산 시간에 대한 필요성이 있습니다 그래서 fluorophores 여기 볼륨을 이동하기 전에 photobleach되지 않습니다. 단백질의 확산을 평가하기위한 보완 기술 FRAP (Photobleaching 후 형광 복구) 및 ICS (이미지 상관 분광학) 기술 (20에서 검토)가 있습니다.

FRAP에는 고휘도 레이저 광선은 photobleaching 그때 모니터링 후에 전지 및 형광의 복구 영역을 photobleach하는 데 사용됩니다. 이것은 복구가 아닌 표백 분야에서 표백된 지역 fluorophores의 확산에서 유래. 따라서 확산 시간은 복구 속도론에서 추출 할 수 있습니다. FRAP은 높은 농도 O와 함께 사용할 수 있습니다F의 fluorophores이 때문에 FCS에 그것이 보완하고, 확산 회 넓은 범위를 액세스할 수 있습니다. FRAP는 형광단가 majoritarily 내부 또는 보트 21,22 밖이었다 여부를 파악하기 위해 사용될 수 있지만 여전히 관심 분야의 fluorophores diffusing 내부 또는 외부 보트의 비율을 계량하기보다는 대량 방법입니다되었습니다.

ICS는 공간적 상관 관계가 주어진 이미지를 23 픽셀로 픽셀 계산되는 FCS의 영상 아날로그입니다. 그것은 천천히 diffusing 형광 프로브의 연구 의무가 될 수있는 장점을 가지고 있지만 2D 분석으로 제한됩니다. 이 제한은 Spatio-시간적 ICS (STICS) 24 되나 ICS의 발달에 의해 극복되었다. STICS 이미지의 스택에 형광 프로브 spatio-시간적 상관 관계를 가능하게하고 전산 구현이 많이 필요하며 FCS보다 낮은 시간 해상도를 가지고 있지만 따라서 강력한 기술입니다. 사실, 모두 ICS와 STICS은 훨씬 느린 일을 처리하는 데 제한됩니다하나의 이미지 프레임의 획득 시간. ICS의 또 다른 확장 25,26 가장 상업 공촛점 현미경에서 사용 가능한 래스터 스캔 모드를 활용하여 빠른 확산 과정의 분석을 가능하게 래스터 ICS (RICS)을했다. 그것이 성가신 될 수 있습니다 넓은 확산 범위 (MS까지 μs에서)하지만, 그것의 구현 (매개 변수, 데이터 처리를 스캐닝)에 사용될 수있는 RICS는 다목적입니다. 우리는 지질 보트에게 27-29를 공부하는 ICS과 그 파생 기법의 사용을보고 문학에 많은 논문을 찾지 못했습니다.

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Disclosures

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 회사 직원 Nationale 드 라 공들인 (ChoAD)에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 또한 그들의 재정 지원을위한 Fondation ICM (Institut 뒤 Cerveau 동부 표준시 드 라 Moelle)에 감사를드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera toxin subunit B-Alexa 488 Invitrogen C-34775 MW (pentamer) = 57 kg/mol
Confocal microscope Leica Microsystems SP5
Incubator for temperature and CO2 control Life imaging services The Cube and the Box
SPAD (Single Photon Avalanche Diode) MPD (Micro Photon Devices) PDM serie (100 µm sensitive area)
High pass 488 nm filter Semrock 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25
FCS detection unit Picoquant Picoharp 300 module
Acquisition and auto-correlation software Picoquant SymPhoTime
Fitting software OriginLab OriginPro8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Marquer, C., Lévêque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J. Vis. Exp. (62), e3513, doi:10.3791/3513 (2012).More

Marquer, C., Lévêque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J. Vis. Exp. (62), e3513, doi:10.3791/3513 (2012).

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