Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Spectral confocal Imaging av fluorescently tagget nikotinreseptorene i Knock-in Mus med kronisk Nikotin Administrasjon

Published: February 10, 2012 doi: 10.3791/3516
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Victoria

Summary

Vi har utviklet en ny metode for å kvantifisere nikotin acetylkolin reseptor endringer innenfor subcellulære regioner i bestemte undergrupper av CNS neurons å bedre forstå mekanismene for nikotinavhengighet ved hjelp av en kombinasjon av tilnærminger, inkludert fluorescerende protein merking av reseptoren med knock-in tilnærming og spektrale confocal bildebehandling.

Abstract

Ligand-gated ionekanaler i sentralnervesystemet (CNS) er innblandet i en rekke tilstander med alvorlige medisinske og sosiale konsekvenser. For eksempel, er avhengighet av nikotin via tobakksrøyking en ledende årsak til for tidlig død på verdensbasis (World Health Organization) og er sannsynligvis forårsaket av en endring av ionekanal fordeling i hjernen en. Kronisk nikotin eksponering i både gnagere og mennesker gir økte antall nikotin acetylkolinreseptorer (nAChRs) i hjernevev 1-3. Tilsvarende har endringer i de glutamatergic GluN1 eller GluA1 kanaler vært innblandet i å utløse overfølsomhet mot andre avhengighetsskapende stoffer som kokain, amfetamin og opiater 4-6.

Derfor er evnen til å kartlegge og kvantifisere distribusjon og uttrykk mønstre av spesifikke ionekanaler kritisk viktig å forstå mekanismene for avhengighet. Studiet av hjernen region-spesifikk efvirkningene av enkelte legemidler ble fremmet ved ankomsten av teknikker som radioaktive ligander. Imidlertid hindrer lav romlig oppløsning av radioaktivt ligand binding muligheten til å kvantifisere ligand-gated ionekanaler i bestemte undergrupper av nerveceller.

Genetisk kodet fluorescerende reportere, som for eksempel grønn fluorescerende protein (GFP) og sine mange fargevarianter, har revolusjonert innen biologi 7. Ved genetisk tagging en fluorescerende reporter til en endogen protein man kan visualisere proteiner in vivo 7-10. En fordel med fluorescently tagging proteiner med en sonde er eliminering av antistoff bruk, som har spørsmål om nonspecificity og tilgjengelighet til målet protein. Vi har brukt denne strategien for å fluorescently label nAChRs, som gjorde studiet av reseptoren montering bruke Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i transfekterte dyrkede celler 11. Mer nylig har vi brukt knock-i tilnærming til ingeniør mus med gul fluoriserende protein tagget α4 nAChR subenheter (α4YFP), slik at nøyaktig kvantifisering av reseptoren ex vivo ved submicrometer oppløsning i CNS nevroner via spektral konfokalmikroskopi 12. Den målrettede fluorescerende knock-in mutasjon er innlemmet i den endogene locus og under kontroll av sin opprinnelige arrangøren, produserer normale nivåer av uttrykk og regulering av reseptoren i forhold til ukodede reseptorer i hvete mus. Dette knock-in tilnærming kan utvides til fluorescently tagge andre ionekanaler, og tilbyr en kraftig tilnærming av visualisere og kvantifisere reseptorer i CNS.

I dette notatet beskriver vi en metode for å kvantifisere endringer i nAChR uttrykk i spesifikke CNS nevroner etter eksponering til kronisk nikotin. Våre metoder omfatter mini-osmotisk pumpe implantasjon, intrakardiale perfusjon fiksering, bildebehandling og analyse av fluorescently merket nikotinsyre receptor subenheter fra α4YFP knock-in mus (Fig. 1). Vi har optimalisert fiksering teknikken for å minimere autofluorescens fra fast hjernen tissue.We beskrive i detalj vår avbildning metodikk ved hjelp av en spektral confocal mikroskop i forbindelse med en lineær spektral unmixing algoritme for å trekke autofluoresent signal for å oppnå nøyaktig α4YFP fluorescens signal. Til slutt viser vi resultater av kronisk nikotin-indusert oppregulering av α4YFP reseptorer i den mediale perforant banen til hippocampus.

Protocol

1. Pump implantasjon

  1. Før pumpen implantasjon, fyll og forberede Alzet mini-osmotiske pumper (Alzet, 2002 Modell, Cupertino, USA) er forsiktig å ikke innføre luftbobler. Denne modellen av mini-osmotisk pumpe leverer løsningen med en rate på 0,5 mL / t i 14 dager. Sørg for sterile forhold. Vei tomme og fylt pumper. Ved avslutningen av forsøket (10 dager etter implantasjon), kan de resterende væske i pumpen fjernes med en sprøyte og kanyle og veide for å beregne volumet pumpes.
  2. Pumper med kontroll løsning inneholde saltvann (0,9% w / v, Teknova, S5819, Hollister, USA). For å forberede nikotin løsning, en 1 M stamløsning av (-)-Nikotin hydrogen tartrate salt (Sigma, katt # N5260) fortynnes i saltvann (0,9% w / v) og sterilisert ved filtrering gjennom et 0,22 mikrometer sprøyte-end filter. Vi har tidligere administrert nikotin på 0,4 og 2 mg / kg / time (regnet som fri base av nikotin) i 10 dager.
  3. Forbered tre saltvann bad (tre10 cm saltvann fylt petriskåler). Når pumpen er fylt og avsluttes, vaske pumpe grundig i hver påfølgende saltvann bad for å fjerne alle spor av stoffet på det ytre skallet. Dypp fylt pumper i saltvannsoppløsning for oppbevaring til kirurgi, holde kontrollen og nikotin pumper i separate saltvann beholdere.
  4. Å stimulere til en sunn utvinning og redusere risikoen for postoperativ infeksjon, ha rene bur forberedt for langsiktig utvinning.
  5. For kortsiktige utvinning umiddelbart etter operasjonen, forberede et bur som inneholder en varmepute og en varmelampe.
  6. For å undersøke kroniske nikotin effekter vi har 5-6 homozygot α4YFP knock-in mus (2-3 måneder gammel) i hver gruppe (kontroll eller nikotin). Den α4YFP knock-in mus linje har blitt backcrossed i 10 generasjoner til C57BL/6J musen belastningen. Vi sørger for alder og kjønn på alle mus er de samme for studien, og at alle operasjoner utføres på samme dag for å minimere variasjonen. For å hindre hypothermia til musene under og etter operasjonen, utstyre kirurgisk bord med en varmepute dekket i sterile kirurgisk drapere.
  7. Indusere α4YFP knock-in mus med 3 L / min oksygen og 3% isofluran og deretter opprettholde anestesi ved 2,5 l / min oksygen og 1% isofluran. Vi foretrekker isofluran anestesi fordi på ferdigstillelse av kirurgi isofluran fjerner systemet raskt og musene er bevisste og mobile innenfor ~ 2 min. Bruk øyedråper umiddelbart (Tear-Gel, Novartis) for å unngå hornhinneskader.
  8. Pumper er implantert subkutant gjennom en hud snitt på baksiden av halsen og pumpen er skjøvet caudally ned dorsal del av ryggen. Tørk området på ryggen mellom forbein med 95% etanol til matt pels. Klem huden med 0,8 Græfe tang (Fine Science Verktøy, 11050-10) og lage en 1 cm sentral laterale snitt bruker iris saks (Fine Science Verktøy, 14060-10).
  9. For å opprette en subkutan plass til pumpen, setter standard mønster scissors (Fine Science Verktøy, 14101-14) i snitt, og presse dem forsiktig mot kaudal enden av dyret.
  10. Bruker 1,0 mm Græfe tang (Fine Science Verktøy, 11650-10), fjerne pumpen fra saltvann. Hold Snittet åpne ved hjelp av pinsett og sette pumpen i snittet med den osmotiske pumpe lokket vendt mot bakre enden av dyret og skyv pumpen til kaudal slutt.
  11. Pinch viklet stenge bruker 0,8 pinsett og bruke en tilstrekkelig mengde Vetbond (3M, katt # 1469SB) lim. Hold inntil såret er forseglet.
  12. Ta dyret fra isofluran maske, injiserer med smertestillende, meloksikam (0,1 mg / kg sc), og plass til en kortsiktig bedring bur inntil bevisst og mobil. Deretter i en langsiktig recovery bur med mat og vann tilgjengelig ad libitum.

2. α4YFP knock-in mus fiksering av intrakardiale perfusjon

  1. Gjør løsninger en dag før prosedyre og la ved 4 ° C. For å redusere variabiliteten alle musvil bli perfused på samme dag og med samme batch av løsninger.
  2. Utfør perfusjon fikseringer i et godt ventilert område. Flush linje peristatic pumpe (Masterflex Easy Load, 7518-00; Masterflex Pump Controller, 60 648) med DDH 2 O.
  3. Legg ~ 0.0015g av heparin (Sigma, katt # H4784), en antikoagulant, til 20 ml PBS pH 7,6 (Invitrogen, katt # 70011).
  4. Anesthetize α4YFP knock-in mus ved å injisere intramuskulært en blanding av ketamin (25 mg / kg, Wyeth Animal Health) og medatomidine hydroklorid (0,25 mg / kg, Pfizer) i bakbenet muskel og umiddelbart plassere dyret tilbake i sitt hjem buret.
  5. Pin dyr til en styrofoam lokk settes inn i en metall skuffen. Tørk thorax med 95% etanol. Pinch hud med adson tang (Fine Science Verktøy, 91106-12) og klipp åpne brysthula med iris saks. Klem brystkasse med en ultra fin hemostat (Fine Science Verktøy, 13021-12) og utsette hjertet.
  6. Begynn å pumpe PBS ved 4 ml / min og jegnsert en 23G sommerfugl nål (Becton Dickinson, 367 253) inn i venstre hjertekammer av dyret. Umiddelbart avklipt høyre forkammer å tillate blod og perfusate å rømme.
  7. Perfuse 20 ml PBS (pH 7,6), deretter 30 ml av 4% paraformaldehyde (pH 7,6, fortynnet med PBS fra en 16% PFA lager, elektronmikroskopi Sciences, katt # 15710), deretter 20ml av 5% sukrose (pH 7,6) . Vi fant at over fiksering øker autofluorescens. Perfusjon med 5% sukrose skyller gjenværende PFA fra hjernen, noe som senker autofluorescens.
  8. Ta hjerne og butikk i 30% sukrose i 3 dager.
  9. For å fryse hjerner for coronal seksjonering, avskåret lillehjernen med et barberblad og sted hjernen i en plast embedding mold (VWR, katt # 18986-1) rostral side opp og senk i oktober Montering Compound (Tissue-Tek, katt # 4583) . Frys i tørris og oppbevares ved -20 ° C før du skjærer.
  10. § hjerner (30 mikrometer tykk) på en cryostat og deretter overføre til belagte lysbilder. Oppbevar hjernen seksjonene ved -20 &grader; C i slide boksene inneholder en vannfri kalsiumsulfat stein. Raset boksen skal være i en zip-lås pose forseglet for å unngå fukt og påfølgende fryser brenne når den lagres ved -20 ° C.

3. Imaging fluorescerende nAChRs med spektral konfokalmikroskopi

  1. Sørg for lysbilder ha minimal eksponering til noen lyskilde for å minimere photobleaching.
  2. Dekkglass hjernen delen lysbildene med en montasje medium som ikke hemmer fluorescerende protein fluorescens. Vi har god suksess med Mowiol 4-88 (pH 8,5 i Tris-HCl og glyserol, EMD-Calbiochem, katt # 475904), som stivner etter noen timer. Pass på at Mowiol equilibrates til romtemperatur før dekselet sklir for å unngå luftbobler. Ikke bruk neglelakk når dekke slipping som det vil slukke YFP fluorescens.
  3. Bildene er kjøpt ved hjelp av en Nikon C1si spektral confocal mikroskop system. Detaljer om metoden for spektral confocal bildebehandling og lineær unmixing er gid. andre steder 13-15. Begrunnelsen for bruk av en spektral confocal mikroskop er at fast hjernevev har iboende autofluorescens. Spectral confocal bildebehandling på Nikon C1si bruker en rekke av 32 photomultiplier tube detektorer som prøve en spesifisert rekke bølgelengder av fluorescerende lyset, brytes romlig inn i sine ulike bølgelengder via en rist dispersiv element akkurat som et prisme refracting hvitt lys inn i en regnbue av farger 16. Hva er samlet er en lambda bunke med bilder - bilder som samles inn ved ulike bølgelengder av lys, slik at en emisjon spektrum samles for hver piksel av en lambda bunke bilder. Siden YFP og vev autofluorescens hver har karakteristiske spektrale signaturer, kan lambda stakken skal deconvolved hjelp av en lineær unmixing algebraisk algoritmen i separate YFP og autofluorescent signaler (Fig. 2). Dermed kan svært nøyaktig tallfesting av YFP fluorescens bestemmes selv i vev med betydelige nivåer av autofluorescence.
  4. Forskjellige innstillinger kan justeres for å optimalisere bildekvaliteten og fluorescens samling effektivitet. Vi vil rapportere innstillingene vi vanligvis bruker, men disse innstillingene kan justeres avhengig av prøven og confocal mikroskop. For nøyaktig kvantifisere endringer i α4YFP subenhet uttrykk med kronisk nikotin sikrer vi at den grå skala nivå intensitet av signalene fra alle pikslene er under mette verdi (<4095 for 12 bit grå skala). Videre imøtekomme vi for potensiell økning i signal på grunn av reseptor oppregulering ved å justere confocal innstillingene slik at pikslene er rundt en tredjedel av mette verdi (~ 1300-1400) eller mindre. Når innstillingene er optimalisert, blir innstillingene opprettholdes identisk for alle imaging økter og prøver.
  5. Vi bruker følgende innstillinger for bildebehandling α4YFP med en 60X olje CFI Plan Apo VC objektiv (1,40 NA, 0,13 mm arbeidsavstand): 488 nm laser line på 15% maksimal overføring av en 40 mW Argon laser, Spektral detektor gevinst på 220, spektralområdet fotografert fra 496,5 nm til 656.5 nm på 5 nm oppløsning, 512 x 512 piksler over en 50 mikrometer x 50 mikrometer område, et medium pinhole størrelse (60 mikrometer diam), en 4,08 pixel holdetid, midling over to skanninger og 12 biter av grå skala.

4. Lineær unmixing av spektrale confocal og bildeanalyse

  1. For å utføre lineær spektral unmixing på en prøve bilde tatt med en spektral confocal mikroskop, må man først skaffe seg en referanse spektrum for YFP og en referanse spektrum for vev autofluorescens.
  2. En viktig forutsetning for enhver referanse spektrum er å oppnå en høy signal til støy fluorescens spektrum avbildes med samme laser linje brukes for avbildning av dine prøver. Selv om 514 nm laser linje av Argon har en høyere eksitasjon effektivitet å opphisse YFP vi foretrekker å avbilde YFP med 488 nm laser linje fordi det er bedre atskillelse fra toppen utslipp av YFP og 488 nm linjen er mindre likely å forvrenge toppen og man kan få hele YFP utslipp spekteret, inkludert opphav til topp. Vi bilde løselig YFP tilført i en cellelinje slik at et sterkt YFP signal oppnås og den resulterende YFP spekteret er lagret i vårt bibliotek med referanse spektra. Transfekterte α4YFP enn uttrykt i cellelinjer kan også brukes, da det vil også gi en høy signal til bakgrunn spektrum.
  3. For å få en referanse spekter av autofluorescens vi bilde autofluorescens fra en hvete mus hjerne avsnitt fra de ulike områder av hjernen som vi akter å bilde fra α4YFP musen og få deres tilsvarende spektra. Vi bruker den samme laseren linje, 488 nm, og bildet med nesten identiske parametre, selv om vi kan endre detektoren gevinst, laser intensitet eller utføre gjennomsnitt tenkelig å maksimere signal til støy.
  4. Etter å ha fått en spektral confocal bilde fra en hjerne region av α4YFP musen, blir bildet da deconvolved inn i sin YFP og autofluorescence signaler ved å bruke en lineær spektral unmixing algoritmen bruker referanse spekteret av YFP og referansen spekteret av hvete mus autofluorescens fra samme hjernen regionen.
  5. Den ublandet α4YFP Bildet kan så åpnes i en bildeanalyse programvare som ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) og deretter gjennomsnittlig pikselintensiteten beregnes for regionen av interesse. En plugin for ImageJ kalt "loci_tools.jar" ( http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej ) kan brukes til å importere Nikon ics / ids confocal filer.
  6. Vi gjentar den samme lineære spektral unmixing og analyse for å hvete mus i samme hjernen regionen for å få en bakgrunn restverdi.
  7. Så en får korrigert gjennomsnittlig α4YFP intensitet ved å trekke bakgrunnen restverdi (4.6) fra bety ukorrigert α4YFP verdi (4,5).

5. Representative Resultater

Vi viser en representativ ekte farge projeksjon av en lambda bunke bilder av den mediale habenula fra en homozygot α4YFP mus (Fig. 3A) tatt med en spektral confocal mikroskop. Vi viser også utslipp spekteret fra et område av interesse inneholder α4YFP positive nevroner fra samme lambda stabelen bilde (Fig. 3B). En tydelig utslipp topp er tydelig ved ~~~HEAD=NNS 527 nm, som er den høyeste fluorescens utslipp av YFP. Regionen nabolandet mediale habenula viser en emisjon spektrum mangler en spektral topp på 527 nm, noe som indikerer fravær av α4YFP nAChR subenheter. Etter lineær spektral unmixing hjelp referanse spektra av YFP og mus hjernen autofluoresence med betydelige overlapp av utslipp (Fig. 4), separasjon av YFP og autofluorescent signal er mulig ettergivende en α4YFP ublandet bilde, en autofluorescent ublandet bilde og en rest kanal. Klar lokalisering av α4YFP influensaorescence kan identifiseres i tettpakket soma av medial habenula (Fig. 4).

I hippocampus α4YFP er lokalisert hovedsakelig i mediale perforant bane, Tempero-ammonic banen og alveus 12. Disse er alle glutamatergic innervasjon av hippocampus. Vi undersøkte effekten av kronisk nikotin på α4YFP uttrykk i hippocampus perforant banen (Fig. 5). Kronisk bruk av nikotin (2 mg / kg / time i 10 dager) resulterte i en betydelig økning (69 ± 14%) i α4YFP fluorescens fra kontroll saltvann behandlede mus til kroniske nikotin behandlede mus (p = 0,001, Wilcoxon rank sum test) ( fig. 5).

Figur 1
Figur 1. Flytskjema som viser fremgangsmåten til bildet endres i α4YFP nAChR subenheter med kronisk nikotin. Mini-osmotiske pumper er fylt med enten saltvann eller nikotin og implantert subkutant i & alpha; 4YFP homozygote mus. Etter 10 dager mus perfused og festes med 4% paraformaldehyde og musa hjerner er seksjonert (30 mikrometer tykk) på lysbilder. Hjernen delen er fotografert på en spektral confocal mikroskop (Nikon C1si) og spectrally ublandet inn YFP og autofluorescent bilder. Deretter α4YFP bildene ble analysert videre med ImageJ programvare.

Figur 2
Figur 2. En prinsippskisse av en lambda stabel fotografert fra en spektral confocal mikroskop og lineært ublandet i sine spektral komponenter. (A) En lambda bunke bilder er samlet inn. (B) En lambda bunke består av bilder innsamlet ved ulike bølgelengder av lys, slik at en emisjon spektrum samles for hver piksel over hele stabelen. (C) Siden YFP og vev autofluorescens hver har karakteristiske spektrale signaturer, kan lambda stakken skal deconvolved hjelp av en lineær unmixing algebraisk algoritme til separate YFP og autofluorescent signaler. Dermed kan svært nøyaktig tallfesting av YFP fluorescens bestemmes selv i vev med høy autofluorescens.

Figur 3
Figur 3. Spectral confocal bilde av en hjerne region uttrykke α4YFP nAChRs. (A) En ekte farge projeksjon av en lambda bunke bilder av den mediale habenula fra en α4YFP mus tatt med en Nikon C1si spektral confocal mikroskop. (B) plott av spektra fra et område av interesse, som inkluderer α4YFP inneholder nevroner (grønn), og en region av interesse utenfor den mediale habenula (rød).

Figur 4
Figur 4. Lineær spektrale unmixing av mediale habenula. (A) Bilder av ublandet α4YFP og (B) autofluorescens etter lineær spektral unmixing. (C) Referanse spektra av YFP (grønn trivinkler) og autofluorescens (gule sirkler) som brukes for spektral unmixing.

Figur 5
Figur 5. Oppregulering av α4 nAChRs i hippocampus av α4YFP knock-in mus eksponert for kronisk nikotin. (A) En flislagt montasje av α4YFP fluorescens fra hippocampus. De to stiplede merkede områder er omtrentlige steder på mindreverdig lem av perforant banen til hippocampus, der analyser ble utført for hver mus. (B) α4YFP fluorescens var signifikant høyere i perforant vei mus eksponert for kronisk nikotin enn kronisk saltvann (*, p = 0,001, Wilcoxon rank sum test). Resultater representerer gjennomsnitt ± SEM fra n = 20 målinger for både saltvann og kroniske nikotin behandlede mus (5 mus for hver behandling gruppe).

Figur 6
Figur 6. Bedre depth uttrykk for α4YFP sammenlignet med antistoff merking. XZ ortogonale utsikt α4YFP fluorescens (A) og VGlut2 antistoff med Cy5 som en sekundær etikett (B). (C) Tomter som viser større fluorescens signal intensitet degradering enn dybde for antistoff farging (svarte firkanter) sammenlignet med α4YFP (åpne sirkler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Anthony Renda ble støttet av en University of Victoria Graduate Fellowship Award. Denne forskningen ble støttet av en Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant, en NARSAD Young Investigator Award (til RN), en Victoria Foundation - Myre og Winifred sim Fund, en kanadisk Foundation for Innovation bevilgning, en British Columbia Kunnskap utviklingsfond og en Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Research Verktøy og Instrumentation Grant. Vi takker Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald og Daniel Morgado for utmerket mus underhaldande.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mini-osmotic pumps Alzet model 2002
saline TEKnova, Inc. S5819
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt Sigma-Aldrich N5260
eye drops Novartis AG Tear-Gel
Vetbond glue 3M 1469SB
heparin sodium salt Sigma-Aldrich H4784
10x PBS Invitrogen 70011
ketamine Wyeth Animal Health 0856-4403-01
medatomidine hydrochloride Pfizer Pharma GmbH 1950673
23G butterfly needle BD Biosciences 367253
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
plastic embedding mold VWR international 18986-1
O.C.T. Mounting Compound Tissue-Tek 4583
Mowiol 4-88 EMD Millipore 475904 pH 8.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).
  2. Schwartz, R. D., Kellar, K. J. Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo. Science. 220, 214-216 (1983).
  3. Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).
  4. Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse. Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).
  5. Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents. J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).
  6. Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons. Neuron. 37, 577-5782 (2003).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  8. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  9. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  10. Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  11. Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).
  12. Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional α4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
  13. Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).
  14. Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E. Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. Periasamy, A., Day, R. N. , Oxford University Press. 180-192 (2005).
  15. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
  16. Larson, J. M. The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed. Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).
  17. Melvin, N. R., Sutherland, R. J. Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs. J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).
  18. Jones, I. W., Wonnacott, S. Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out. Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).
  19. Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures. J. Neurochem. , (2007).
  20. Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression. The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).
  21. Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).
  22. Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment. Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).
  23. King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration. Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).
  24. Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine. Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).
  25. Sparks, J. A., Pauly, J. R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice. Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).
  26. Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study. Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).
  27. Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391, 173-177 (1998).
  28. Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. Nature. 471, 597-601 (2011).
  29. Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436, 103-107 (2005).
  30. Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research. Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).
  31. Lang, T., Rizzoli, S. O. Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures. Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).

Tags

Nevrovitenskap nikotinavhengighet knock-i mus spektral confocal bildebehandling gul fluoriserende protein nikotin acetylkolinreseptorer
Spectral confocal Imaging av fluorescently tagget nikotinreseptorene i Knock-in Mus med kronisk Nikotin Administrasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Renda, A., Nashmi, R. Spectral… More

Renda, A., Nashmi, R. Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration. J. Vis. Exp. (60), e3516, doi:10.3791/3516 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter