Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie

Published: February 10, 2012 doi: 10.3791/3516
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Victoria

Summary

We hebben een nieuwe techniek van het kwantificeren van nicotine acetylcholine receptor veranderingen binnen subcellulaire regio's van specifieke subtypes van CNS neuronen beter de mechanismen van de nicotine verslaving te begrijpen met behulp van een combinatie van benaderingen waaronder fluorescerend eiwit tagging van de receptor met behulp van de knock-in aanpak en spectrale confocale beeldvorming.

Abstract

Ligand-gated ionkanalen in het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn betrokken bij tal van aandoeningen met ernstige medische en sociale gevolgen. Bijvoorbeeld, de verslaving aan nicotine via het roken van tabak is een belangrijke oorzaak van vroegtijdig overlijden wereldwijd (World Health Organization) en wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een wijziging van ionkanaal distributie in de hersenen 1. Chronische blootstelling aan nicotine in zowel knaagdieren als mensen resulteert in een verhoogd aantal nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) in het hersenweefsel 1-3. Ook hebben veranderingen in de glutamaterge GluN1 of GluA1 kanalen zijn betrokken bij het ​​ontstaan ​​van overgevoeligheid voor andere verslavende drugs zoals cocaïne, amfetamines en opiaten 4-6.

Bijgevolg is de mogelijkheid om in kaart te brengen en te kwantificeren distributie en expressie patronen van specifieke ionkanalen is van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van verslaving. De studie van de hersenen regiospecifieke effecten van individuele geneesmiddelen werd voorgeschoten door de komst van technieken zoals radioactieve liganden. De lage ruimtelijke resolutie van radioactieve ligand verhindert de aan ligand ionen kanalen kwantificeren specifieke subtypen van neuronen.

Genetisch gecodeerd fluorescerende verslaggevers, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) en de vele kleur varianten, hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van de biologie 7. Door genetisch tagging een tl-reporter is een endogeen eiwit kan men eiwitten visualiseren in vivo 7-10. Een voordeel van fluorescent tagging eiwitten met een sonde is de eliminatie van antilichaam gebruik, die vraagstukken van nonspecificity en de toegankelijkheid van het doelwit eiwit hebben. We hebben gebruik gemaakt van deze strategie om fluorescent label nAChRs, die de studie van receptor montage met behulp van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) in getransfecteerde gekweekte cellen 11 ingeschakeld. Meer recent hebben we de knoc gebruiktk-in benadering van de ingenieur muizen met geel fluorescerend eiwit gelabeld α4 nAChR subeenheden (α4YFP), om een nauwkeurige kwantificering van de receptor ex vivo bij submicrometer resolutie in CNS neuronen via spectrale confocale microscopie 12. De beoogde fluorescerende knock-in mutatie is opgenomen in de endogene locus en onder controle van de oorspronkelijke promotor, de productie van normale niveaus van expressie en regulatie van de receptor in vergelijking met niet-gecodeerde receptoren in wildtype muizen. Deze knock-in benadering kan worden uitgebreid tot fluorescent label andere ionkanalen en biedt een krachtige aanpak van het visualiseren en kwantificeren van receptoren in het CZS.

In dit artikel beschrijven we een methode om veranderingen in de nAChR expressie te kwantificeren in specifieke CNS neuronen na blootstelling aan chronische nicotine. Onze methoden zijn onder andere mini-osmotische pomp implantatie, intracardiale perfusie fixatie, beeldvorming en analyse van fluorescent gelabeld nicotinezuur receptor subunits uit α4YFP knock-in muizen (afb. 1). We hebben geoptimaliseerd fixatie techniek autofluorescentie minimaliseren van vaste hersenen tissue.We in detail onze imaging methode met een spectrale confocale microscoop in combinatie met een lineaire spectrale ontmenging algoritme autofluoresent signaal aftrekken om nauwkeurig verkrijgen α4YFP fluorescentiesignaal beschrijven. Tot slot tonen we de resultaten van chronische nicotine geïnduceerde opregulatie van α4YFP receptoren in de mediale perforant pad van de hippocampus.

Protocol

1. Pomp implantatie

  1. Voordat de pomp implantatie, vullen en de voorbereiding van de Alzet mini-osmotische pompen (Alzet, Model 2002, Cupertino, USA) dat evenwel niet tot luchtbellen te introduceren. Dit model van mini-osmotische pomp levert oplossing bij een snelheid van 0,5 pl / uur gedurende 14 dagen. Zorg ervoor dat steriele omstandigheden. Weeg lege en gevulde pompen. Aan het einde van het experiment (10 dagen na implantatie), kan de resterende vloeistof in de pomp worden verwijderd met een spuit en naald en gewogen om het volume gepompt berekenen.
  2. Pompen met controle-oplossing bevat zoutoplossing (0,9% w / v, Teknova, S5819, Hollister, USA). (-)-Nicotine waterstof tartraatzout (Sigma, cat # N5260) wordt verdund in een zoutoplossing (0,9% w / v) en gesteriliseerd door filtratie door een 0,22 pm spuit-end filter om nicotine-oplossing, een 1 M stockoplossing van te bereiden. Wij hebben eerder toegediend nicotine 0,4 en 2 mg / kg / uur (berekend als vrije base van nicotine) gedurende 10 dagen.
  3. Bereid drie zoutoplossing baden (drie10 cm zoutoplossing gevuld petrischalen). Zodra de pomp is gevuld en afgedekt, waspomp grondig in elke opeenvolgende zout bad om alle sporen van de drug te verwijderen op de buitenste schil. Dompel vol pompen met een zoutoplossing voor de opslag tot een operatie, het houden van de controle en nicotine pompen in aparte zoutoplossing containers.
  4. Om een ​​gezond herstel te bevorderen en het risico van post-operatieve infectie, hebben schone kooien voorbereid op herstel op lange termijn.
  5. Voor de korte termijn herstel direct na een operatie, bereiden een kooi met daarin een verwarmingselement en een warmtelamp.
  6. Om chronische nicotine-effecten te onderzoeken hebben we 5 tot 6 homozygote α4YFP knock-in muizen (2-3 maanden oud) in elke groep (controle of nicotine). De α4YFP knock-in muis lijn zijn teruggekruist voor 10 generaties om de C57BL/6J muizenstam. Wij zorgen ervoor dat de leeftijd en het geslacht van alle muizen zijn hetzelfde voor de studie en dat alle operaties worden uitgevoerd op dezelfde dag van de variabiliteit te minimaliseren. Om te voorkomen dat hypothermia om de muizen tijdens en na de operatie, uit te rusten chirurgische tafel met een verwarmingselement bedekt met steriele chirurgische laken.
  7. Laten de α4YFP knock-in muis met 3 l / min zuurstof en 3% isofluraan en daarna te onderhouden anesthesie op 2,5 L / min zuurstof en 1% isofluraan. Wij geven de voorkeur isofluraananesthesie omdat na afloop van de operatie isofluraan wist het systeem snel en de muizen zijn bewuste en mobiel binnen ~ 2 min. Breng oogdruppels onmiddellijk (Tear-Gel, Novartis) om te voorkomen dat schade aan het hoornvlies.
  8. Pompen worden subcutaan geïmplanteerd door een incisie in de huid op de achterkant van de hals en de pomp caudaal ingedrukt de dorsale zijde van de rug. Veeg het gebied op de rug tussen de voorpoten met 95% ethanol mat de vacht. Knijp de huid met 0,8 mm Graefe pincet (Fine Science Tools, 11050-10) en een 1 cm centrale laterale gesneden met behulp van iris schaar (Fine Science Tools, 14060-10).
  9. Om een ​​subcutane ruimte voor de pomp te maken, plaatst u standaard patroon schaars (Fine Science Tools, 14101-14) in de incisie en zorgvuldig hen naar de caudale einde van het dier te duwen.
  10. Met behulp van 1,0 mm Graefe pincet (Fine Science Tools, 11650-10), verwijder de pomp van zout. Houd de incisie geopend met behulp van een tang en steek de pomp in de incisie met de osmotische pomp gericht naar de caudale einde van het dier en druk op de pomp aan de caudale einde.
  11. Pinch wond dicht met behulp van 0,8 mm tang en breng een passend bedrag van Vetbond (3M, cat # 1469SB) lijm. Ingedrukt houden totdat wond is verzegeld.
  12. Haal het dier uit isofluraan masker, injecteren met het pijnstillende, meloxicam (0,1 mg / kg sc), en plaats in een korte termijn herstel kooi tot bewuste en mobiel. Plaats dan in een lange termijn herstel kooi met voedsel en water ad libitum beschikbaar.

2. α4YFP-knock in de muis vastlegging door intracardiale perfusie

  1. Maak oplossingen een dag voorafgaand aan de procedure en laat bij 4 ° C. Om variabiliteit te minimaliseren alle muizenwordt geperfundeerd op dezelfde dag en met dezelfde partij oplossingen.
  2. Voer perfusie fixaties in een goed geventileerde ruimte. Spoel de lijn van peristatic pomp (Masterflex Easy Load, 7518-00; Masterflex Pompregelaar, 60648) met DDH 2 O.
  3. Voeg ~ 0.0015g van heparine (Sigma, cat # H4784), een anti-stollingsmiddel, tot en met 20 ml PBS pH 7,6 (Invitrogen, kat # 70011).
  4. Verdoof α4YFP knock-in muis door het injecteren van intramusculair een mengsel van ketamine (25 mg / kg, Wyeth Animal Health) en medatomidine hydrochloride (0,25 mg / kg, Pfizer) in het achterbeen spieren en onmiddellijk terug te plaatsen het dier in zijn kooi.
  5. Pin dier naar een piepschuim deksel ingebracht in een metalen plaat. Veeg thorax met 95% ethanol. Pinch huid met Adson pincet (Fine Science Tools, 91106 tot 12) en knip te openen van de borstholte met iris schaar. Klem de ribbenkast met behulp van een ultra fijne hemostat (Fine Science Tools, 13,021 tot 12) en bloot het hart.
  6. Begin pompen PBS bij 4 ml / min en insert een 23G vlindernaald (Becton Dickinson, 367253) in de linker ventrikel van het dier. Onmiddellijk knippen de rechterboezem om bloed toe te staan ​​en te ontsnappen perfusaat.
  7. Perfuseren 20 ml PBS (pH 7,6), dan 30 ml van 4% paraformaldehyde (pH 7,6, verdund met PBS van een 16% PFA voorraad, Electron Microscopy Wetenschappen, kat # 15710), dan 20 ml van 5% sacharose (pH 7,6) . We vonden dat meer dan de fixatie autofluorescentie verhoogt. Perfusie met 5% sacharose spoelt resterende PFA van de hersenen, die verlaagt autofluorescentie.
  8. Verwijder de hersenen en op te slaan in 30% sucrose voor 3 dagen.
  9. Om hersenen te bevriezen voor de coronale snijden, sneed de kleine hersenen met een scheermesje en plaats de hersenen in een plastic inbedding mal (VWR, kat # 18986-1) rostraal naar boven en onder te dompelen in OCT Montage Verbinding (Tissue-Tek, kat # 4583) . Freeze in droog ijs en bewaar bij -20 ° C alvorens te snijden.
  10. Sectie hersenen (30 micrometer dik) op een cryostaat en dan over te dragen aan gecoate glaasjes. Bewaar de hersenen secties bij -20 ° C in dia-dozen met een watervrij calciumsulfaat steen. De dia doos moet in een zip-lock verzegelde zak zodat er geen vocht en de daarop volgende vriesbrand indien bewaard bij -20 ° C.

3. Imaging fluorescerende nAChRs met behulp van spectrale confocale microscopie

  1. Zorg ervoor dat dia's beschikken over een minimale blootstelling aan een lichtbron te minimaliseren fotobleken.
  2. Dekglaasje de hersenen deel dia's met een montage medium dat niet remt fluorescent eiwit fluorescentie. Wij hebben goede succes Mowiol 4-88 (pH 8,5 in Tris-HCl en glycerol, EMD-Calbiochem, cat # 475904), die uithardt na enkele uren. Zorg ervoor dat de Mowiol evenwicht houdt op kamertemperatuur komen voordat deksel glijden, om luchtbellen te voorkomen. Gebruik geen nagellak wanneer het deksel glijden omdat het YFP fluorescentie lessen.
  3. Beelden worden verworven met een Nikon C1si spectrale confocale microscoop systeem. Details over de methode van de spectrale confocale beelden en lineaire unmixing zijn voorzien vand elders 13-15. De reden voor het gebruik van een spectrale confocale microscoop is dat de vaste hersenweefsel inherent autofluorescentie heeft. Spectral confocale beelden op de Nikon C1si maakt gebruik van een reeks van 32 fotomultiplicatorbuis detectoren die sample van een bepaalde reeks golflengten van TL-uitgestraalde licht, ruimtelijk gebroken in zijn verschillende golflengten via een rooster dispersieve element net zoals een prisma brekend wit licht in een regenboog van kleuren 16. Wat verzameld een lambda stapel beelden - beelden verzameld op verschillende golflengten van licht, zodat een emissiespectrum verzameld voor elke pixel van een lambda stapel beelden. Aangezien YFP en weefsels autofluorescentie elk kenmerk spectrale handtekeningen kan het lambda stack deconvolved een lineaire algebraïsche ontmenging algoritme in afzonderlijke YFP en autofluorescente signalen (Fig. 2). Zo kan een zeer nauwkeurige kwantificering van YFP fluorescentie wordt bepaald, zelfs in het weefsel met een hoog autofluorescence.
  4. Diverse instellingen kunnen worden aangepast om de beeldkwaliteit en fluorescentie collectie-efficiëntie te optimaliseren. We zullen rapporteren instellingen die we doorgaans gebruiken, maar deze instellingen kunnen worden aangepast afhankelijk van het monster en de confocale microscoop. Om nauwkeurig te kwantificeren veranderingen in α4YFP subeenheid expressie met een chronische nicotine zorgen we ervoor dat de grijze schaalniveau de intensiteit van de signalen van alle pixels zijn hieronder verzadigen waarde (<4095 voor 12-bits grijstinten). Bovendien hebben wij geschikt voor potentiële toename signaal vanwege receptor opregulatie door aanpassing van de confocale wijzigen zodat pixels ongeveer eenderde van verzadigende waarde (~ 1300-1400) of minder. Zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd, worden de instellingen behouden identiek voor alle beeldvorming sessies en monsters.
  5. We gebruiken de volgende instellingen voor het afbeelden van α4YFP het gebruik van een 60X olie CFI Plan Apo VC doel (1,40 NA, 0,13 mm werkafstand): 488 nm laser lijn op 15% maximale overdracht van een 40 mW Argon laser, Spectrale detector winst op 220, spectrum afgebeeld van 496,5 nm tot 656,5 nm op 5 nm resolutie, 512 x 512 pixels op een 50 um x 50 urn, een medium gaatje grootte (60 micrometer diameter), een 4,08 pixelverblijftijd, gemiddeld meer dan twee scans en de 12 bits van de grijstinten.

4. Lineaire unmixing van spectrale confocale beelden en beeldanalyse

  1. Om lineaire spectrale unmixing uit te voeren op een steekproef foto genomen met een spectrale confocale microscoop, moet men eerst het verwerven van een referentie-spectrum voor YFP en een referentie spectrum voor weefsel autofluorescentie.
  2. Een belangrijke voorwaarde voor elke verwijzing spectrum is een hoog signaal te krijgen van lawaai fluorescentiespectrum afgebeeld met dezelfde laser lijn wordt gebruikt voor de beeldvorming van uw monsters. Hoewel de 514 nm laser lijn van Argon heeft een hogere excitatie efficiëntie om YFP we het beeld YFP liever met de 488 nm laser lijn te wekken, want er is een betere scheiding van de piek emissie van YFP en de 488 nm lijn is minder likely naar de top te verstoren en kan men de hele YFP emissiespectrum te verkrijgen met inbegrip van de aanleiding tot piek. We beeld oplosbaar YFP getransfecteerd in cellen zodat een sterk YFP wordt verkregen en het resulterende YFP spectrum wordt opgeslagen in de bibliotheek van referentie spectra. Getransfecteerd α4YFP dan uitgedrukt in cellijnen kunnen ook worden gebruikt omdat het een hoog signaal ook om de achtergrond spectrum.
  3. Als u een verwijzing spectrum van autofluorescentie we beeld autofluorescentie verkrijgen van een wild-type muis hersenen deel uit de verschillende gebieden van de hersenen dat we van plan om beeld van de α4YFP muis en het verkrijgen van de bijbehorende spectra. We maken gebruik van dezelfde laser lijn, 488 nm, en het beeld met behulp van bijna identieke parameters, hoewel we misschien de detector winst te wijzigen, laser intensiteit of het uitvoeren van de gemiddelde beeldvorming om het signaal te maximaliseren om ruis.
  4. Na het behalen van een spectrale confocale afbeelding van een gebied van de hersenen van de α4YFP muis, wordt het beeld vervolgens deconvolved in zijn YFP en autofluorescence signalen door toepassing van een lineaire spectrale unmixing algoritme met behulp van de referentie-spectrum van YFP en de referentie spectrum van wild-type muis autofluorescentie uit hetzelfde hersengebied.
  5. De ongemengde α4YFP beeld kan vervolgens worden geopend in een beeldanalyse-software zoals ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) en dan de gemiddelde pixel intensiteit wordt berekend voor de regio van belang. Een plugin voor ImageJ genaamd "loci_tools.jar" ( http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej ) kan worden gebruikt om Nikon ics / ids confocale bestanden te importeren.
  6. We herhalen dezelfde lineaire spectrale ontmenging en analyse om muizen in hetzelfde hersengebied wildtype om een ​​achtergrond restwaarde te verkrijgen.
  7. Dan verkrijgt men het gecorrigeerde gemiddelde α4YFP intensiteit door het aftrekken van de achtergrond restwaarde (4.6) van de gemiddelde ongecorrigeerde α4YFP waarde (4.5).

5. Representatieve resultaten

We tonen een representatief kleurenbeeld projectie van een lambda stapel beelden van de mediale habenula een homozygote α4YFP muis (Fig. 3A) die met een spectrale confocale microscoop. We tonen ook aan de emissie-spectrum van een regio van belang met α4YFP positieve neuronen uit dezelfde lambda stapel beeld (Fig. 3B). Een afzonderlijke emissiepiek duidelijk is ~ 527 nm, de piek fluorescentie-emissie van YFP. Het gebied grenzend aan de mediale habenula toont een emissiespectrum ontbreekt een spectrale piek bij 527 nm, met vermelding van de afwezigheid van α4YFP nAChR subeenheden. Naar aanleiding van lineaire spectrale unmixing met behulp van referentie-spectra van YFP en muis hersenen autofluoresence met een aanzienlijke overlapping van de emissie (afb. 4), scheiding van YFP en autofluorescente signaal is mogelijk resulterend in een α4YFP onvermengd beeld, een autofluorescente onvermengd beeld en een restant kanaal. Duidelijke lokalisatie van α4YFP grieporescence kunnen worden geïdentificeerd in de dicht opeengepakte soma van de mediale habenula (afb. 4).

In de hippocampus α4YFP gelokaliseerd hoofdzakelijk in de mediale perforant pad de Tempero-ammonic pad en de alveus 12. Dit zijn allemaal glutamaat innervatie van de hippocampus. We hebben de effecten van chronische nicotine onderzocht op α4YFP uitdrukking in de hippocampus perforant pad (afb. 5). Chronische toediening van nicotine (2 mg / kg / uur gedurende 10 dagen) resulteerde in een significante toename (69 ± 14%) in α4YFP fluorescentie van controle zoutoplossing behandelde muizen tot chronische nicotine behandelde muizen (p = 0,001, Wilcoxon rank sum test) ( Fig. 5).

Figuur 1
Figuur 1. Flow grafiek met de procedure om de afbeelding veranderingen in α4YFP nAChR subeenheden met chronische nicotine. Mini-osmotische pompen worden gevuld met zoutoplossing of nicotine en subcutaan geïmplanteerd in & alpha; 4YFP homozygote muizen. Na 10 dagen muizen worden doorbloed en gefixeerd met 4% paraformaldehyde en de muis hersenen zijn doorgesneden (30 micrometer dik) op dia's. De hersenen sectie is afgebeeld op een spectrale confocale microscoop (Nikon C1si) en spectraal onvermengd in YFP en autofluorescente beelden. Vervolgens α4YFP beelden nader geanalyseerd met ImageJ software.

Figuur 2
Figuur 2. Een schema van een lambda stapel afgebeeld van een spectrale confocale microscoop lineair vermengd in de spectrale componenten. (A) een lambda stapel beelden verzameld. (B) Een lambda stapel bestaat uit beelden verzameld bij verschillende golflengten van het licht, zodat een emissie-spectrum wordt verzameld voor elke pixel in de gehele stack. (C) Aangezien YFP en weefsel autofluorescentie hebben elk een karakteristieke spectrale signatuur, kan de lambda stapel worden deconvolved met behulp van een lineaire unmixing algebraïsche algoritme in separate YFP en autofluorescente signalen. Zo kan een zeer nauwkeurige kwantificering van YFP fluorescentie worden ook uitgevoerd in weefsels met een hoge autofluorescentie.

Figuur 3
Figuur 3. Spectral confocale beeld van een gebied van de hersenen uiten α4YFP nAChRs. (A) Een echte kleur projectie van een lambda-stapel van beelden van de mediale habenula van een α4YFP muis gemaakt met een Nikon C1si spectrale confocale microscoop. (B) Standplaatsen van spectra uit een regio van belang, die α4YFP bevattende neuronen (groen), en een regio van belang buiten van de mediale habenula (rood) bevat.

Figuur 4
Figuur 4. Lineaire spectrale ontmenging van de mediale habenula. (A) Beelden van ongemengde α4YFP en (B) autofluorescentie volgende lineaire spectrale ontmenging. (C) Referentie spectra van YFP (groen trihoeken) en autofluorescentie (gele cirkels) gebruikt voor spectrale ontmenging.

Figuur 5
Figuur 5. Opregulatie van α4 nAChRs in de hippocampus van α4YFP knock-in muizen blootgesteld aan chronische nicotine. (A) Een betegelde montage van α4YFP fluorescentie van de hippocampus. De twee gestippelde selectie van gebieden zijn bij benadering de locaties op de inferieure onderdeel van de perforant pad van de hippocampus, waar analyses werden uitgevoerd voor elke muis. (B) α4YFP fluorescentie was significant hoger in de perforant pad van muizen blootgesteld aan chronische nicotine dan chronische zoutoplossing (*, p = 0,001, Wilcoxon rank sum test). Resultaten geven gemiddelde ± SEM van n = 20 metingen voor zoutoplossing en chronische nicotine behandelde muizen (5 muizen per behandelingsgroep).

Figuur 6
Figuur 6. Beter depth expressie van α4YFP ten opzichte van antilichaam labeling. XZ orthogonale uitzicht op α4YFP fluorescentie (A) en VGlut2 antilichaam met Cy5 als secundaire label (B). (C) die een grotere Plots fluorescentiesignaal intensiteit afbraak op diepte antilichaam kleuring (zwarte vierkanten) vergeleken met α4YFP (open cirkels).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Wij hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Anthony Renda werd ondersteund door een universiteit van Victoria Graduate Fellowship Award. Dit onderzoek werd ondersteund door een natuur-en ingenieurswetenschappen Research Council of Canada Discovery Grant, een NARSAD Young Investigator Award (tot RN), een Victoria Foundation - Myre en Winifred Sim Fonds, een Canadese Stichting voor Innovatie subsidie, een Brits Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en een natuur-en ingenieurswetenschappen Research Council van Canada Research Tools and Instrumentation Grant. Wij danken Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald en Daniel Morgado voor een uitstekende muis veeteelt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mini-osmotic pumps Alzet model 2002
saline TEKnova, Inc. S5819
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt Sigma-Aldrich N5260
eye drops Novartis AG Tear-Gel
Vetbond glue 3M 1469SB
heparin sodium salt Sigma-Aldrich H4784
10x PBS Invitrogen 70011
ketamine Wyeth Animal Health 0856-4403-01
medatomidine hydrochloride Pfizer Pharma GmbH 1950673
23G butterfly needle BD Biosciences 367253
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
plastic embedding mold VWR international 18986-1
O.C.T. Mounting Compound Tissue-Tek 4583
Mowiol 4-88 EMD Millipore 475904 pH 8.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).
  2. Schwartz, R. D., Kellar, K. J. Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo. Science. 220, 214-216 (1983).
  3. Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).
  4. Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse. Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).
  5. Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents. J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).
  6. Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons. Neuron. 37, 577-5782 (2003).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  8. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  9. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  10. Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  11. Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).
  12. Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional α4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
  13. Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).
  14. Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E. Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. Periasamy, A., Day, R. N. , Oxford University Press. 180-192 (2005).
  15. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
  16. Larson, J. M. The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed. Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).
  17. Melvin, N. R., Sutherland, R. J. Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs. J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).
  18. Jones, I. W., Wonnacott, S. Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out. Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).
  19. Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures. J. Neurochem. , (2007).
  20. Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression. The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).
  21. Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).
  22. Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment. Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).
  23. King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration. Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).
  24. Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine. Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).
  25. Sparks, J. A., Pauly, J. R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice. Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).
  26. Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study. Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).
  27. Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391, 173-177 (1998).
  28. Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. Nature. 471, 597-601 (2011).
  29. Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436, 103-107 (2005).
  30. Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research. Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).
  31. Lang, T., Rizzoli, S. O. Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures. Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).

Tags

Neuroscience nicotineverslaving knock-in muizen spectrale confocale beelden geel fluorescerend eiwit nicotine acetylcholine receptoren
Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Renda, A., Nashmi, R. Spectral… More

Renda, A., Nashmi, R. Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration. J. Vis. Exp. (60), e3516, doi:10.3791/3516 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter