Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Spektral konfokal afbildning af Fluorescerende mærkede nikotinreceptorer i Knock-i mus med kronisk Nikotin Administration

Published: February 10, 2012 doi: 10.3791/3516
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Victoria

Summary

Vi har udviklet en ny teknik til at kvantificere nicotinacetylcholinreceptorneurotransmission ændringer inden for subcellulære regioner af specifikke undertyper af CNS-neuroner til bedre at forstå mekanismerne i nikotintrangen ved hjælp af en kombination af metoder, herunder fluorescerende protein tagging af receptoren ved hjælp af knock-in tilgang og spektral konfokal billeddannelse.

Abstract

Ligand-gatede ionkanaler i centralnervesystemet (CNS) er impliceret i talrige betingelser med alvorlige medicinske og sociale følger. For eksempel er afhængighed af nikotin via tobaksrygning en førende årsag til for tidlig død på verdensplan (World Health Organization), og er sandsynligvis forårsaget af en ændring af ion-kanal fordeling i hjernen 1. Kronisk eksponering for nikotin i både gnavere og mennesker resulterer i forøgede antal af nicotinacetylcholinreceptorer (nAChRs) i hjernevæv 1-3. Ligeledes har ændringer i glutamaterge GluN1 eller GluA1 kanaler blevet impliceret i at udløse sensibilisering andre vanedannende stoffer, såsom kokain, amfetamin og opiater 4-6.

Følgelig evnen til at kortlægge og kvantificere distribution og ekspressionsmønstre af specifikke ionkanaler er kritisk vigtigt at forstå mekanismerne i afhængighed. Undersøgelsen af ​​hjerne region-specifikke efeffekter af individuelle lægemidler blev fremført ved fremkomsten af ​​teknikker såsom radioaktive ligander. Den lave rumlige opløsning af radioaktiv ligand binding forhindrer muligheden for at kvantificere ligand-gatede ionkanaler i specifikke undertyper af neuroner.

Genetisk indkodede fluorescerende reportere, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og mange andre farver, har revolutioneret inden for biologi 7. Ved genetisk mærkning af en fluorescerende reporter til et endogent protein kan man forestille proteiner in vivo 7-10. En fordel ved fluorescens mærkning proteiner med en probe er elimineringen af ​​antistof brug, som har problemer med nonspecificity og tilgængelighed til målproteinet. Vi har brugt denne strategi til fluorescens-mærke nAChRs, som gjorde det muligt for studiet af receptoren samling bruge Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i transficerede dyrkede celler 11. Nylig, har vi brugt knock-in tilgang til ingeniør mus med gult fluorescerende protein tagged a4 nAChR underenheder (α4YFP), hvilket muliggør præcis kvantificering af receptoren ex vivo ved submikrometer opløsning i CNS-neuroner via spektral konfokal mikroskopi 12. Den målrettede fluorescerende knock-in mutation er inkorporeret i det endogene locus og under kontrol af dens native promotor, der producerer normale niveauer af ekspression og regulering af receptoren sammenlignet med umærkede receptorer i vildtype-mus. Dette knock-i fremgangsmåde kan udvides til fluorescens mærke andre ionkanaler og giver en kraftig metode til at visualisere og kvantificere receptorer i CNS.

I dette papir beskriver vi en metode til at kvantificere ændringer i nAChR udtryk i specifikke CNS-neuroner efter udsættelse for kronisk nikotin. Vores metoder omfatter mini-osmotisk pumpe implantation, intrakardial perfusion fiksering, billedbehandling og analyse af fluorescens mærket nikotinsyre receptor underenheder fra α4YFP knock-i mus (fig. 1). Vi har optimeret fiksering teknikken for at minimere autofluorescens fra fast hjerne tissue.We detaljeret beskrivelse vores billeddannelse metode under anvendelse af en spektral konfokalt mikroskop i forbindelse med en lineær spektral unmixing algoritme til at subtrahere autofluoresent signal for nøjagtigt at opnå α4YFP fluorescenssignal. Endelig viser vi resultatet af kronisk nikotin-fremkaldt opregulering af α4YFP receptorer i den mediale perforante sti i hippocampus.

Protocol

1. Pumpe implantation

  1. Før pumpen implantation, fylde og forberede Alzet mini-osmotiske pumper (Alzet, model 2002, Cupertino, USA) er forsigtig med ikke at indføre luftbobler. Denne model af mini-osmotisk pumpe leverer opløsning ved en hastighed på 0,5 gl / time i 14 dage. Sikre sterile forhold. Vejes tomme og fyldte pumper. Ved afslutningen af ​​forsøget (10 dage efter implantation), kan den resterende væske i pumpen fjernes med en sprøjte og nål og vejet til beregning af den pumpes.
  2. Pumper med kontrolopløsning indeholde saltvand (0,9% w / v, Teknova, S5819, Hollister, USA). Til fremstilling af nikotin opløsning, en 1 M stamopløsning af (-)-nikotin hydrogen tartratsalt (Sigma, katalognr N5260) fortyndes i saltvand (0,9% w / v) og steriliseret ved filtrering gennem et 0,22 um sprøjte-ende filter. Vi har tidligere administreret nikotin på 0,4 og 2 mg / kg / time (beregnet som fri base af nikotin) i 10 dage.
  3. Forbered tre saltvand bade (tre10 cm saltvand fyldt petriskåle). Når pumpen er blevet fyldt og lukket, vaskepumpen grundigt i hver successiv saltvand bad for at fjerne eventuelle spor af lægemidlet på den ydre skal. Fordyb fyldt pumper i saltvandsopløsning til opbevaring indtil kirurgi, holde kontrol og nikotin pumper i separate saltvand beholdere.
  4. For at fremme en sund opsving og reducere risikoen for post-kirurgisk infektion, have rene bure udarbejdet for en langsigtet genopretning.
  5. For kort sigt opsving umiddelbart efter operationen, forberede et bur, der indeholder en varmepude og en varmelampe.
  6. At undersøge kroniske nikotin virkninger, vi har 5 til 6 homozygot α4YFP knock-i mus (2-3 måneder gamle) i hver gruppe (kontrol eller nicotin). Den α4YFP knock-i muse line er blevet tilbagekrydset i 10 generationer til C57BL/6J musestamme. Vi sørger for alder og køn af alle mus er de samme for undersøgelsen, og at alle operationer udføres på samme dag for at minimere variabilitet. For at forhindre hypothermia til musene under og efter kirurgi, udstyre kirurgisk bord med en varmepude dækket med steril kirurgisk afdækningsstykke.
  7. Inducerer α4YFP knock-i mus med 3 L / min oxygen og 3% isofluran og derefter opretholde anæstesi ved 2,5 l / min oxygen og 1% isofluran. Vi foretrækker isofluran anæstesi på grund ved afslutningen af ​​operationen isofluran rydder systemet hurtigt og musene er bevidste og mobile inden for ~ 2 min. Anvend øjendråber straks (Tear-Gel, Novartis) for at undgå hornhindeskade.
  8. Pumperne implanteret subkutant via en incision i huden på ryggen af ​​halsen, og pumpen skubbes caudalt ned dorsale aspekt af ryggen. Tør område på ryggen mellem forbenene med 95% ethanol til mat pels. Klem huden med 0,8 mm Graefe pincet (Fine Science Tools, 11.050-10) og gøre en 1 cm central lateral snit ved hjælp af iris saks (Fine Science Tools, 14.060-10).
  9. Hvis du vil oprette en subkutan plads til pumpen, skal du indsætte standard mønster sakss (Fine Science Tools, 14101-14) i indsnittet og skubbe dem grundigt mod den kaudale ende af dyret.
  10. Brug 1,0 mm Graefe pincet (Fine Science Tools, 11.650-10), fjerne pumpen fra saltvand. Holde indsnit åbne med pincet og indsætte pumpen ind i indsnittet med den osmotiske pumpe hætten vender den kaudale ende af dyret og skubbe pumpen til den kaudale ende.
  11. Pinch sår lukket ved hjælp af 0,8 mm pincet og anvende en passende mængde Vetbond (3M, kat # 1469SB) lim. Hold indtil såret er forseglet.
  12. Fjern dyret fra isofluran maske, injicere med smertestillende, meloxicam (0,1 mg / kg sc), og anbringes i en kortsigtet genopretning bur indtil bevidst og mobil. Derefter placeres i en langsigtet genopretning bur med mad og vand ad libitum.

2. α4YFP knock-in mus fiksering ved intrakardial perfusion

  1. Gør løsninger én dag forud for proceduren og henstår ved 4 ° C. For at minimere variabilitet alle musvil blive perfunderet samme dag og med samme batch af opløsninger.
  2. Udfør perfusion optagelser på et godt ventileret område. Flush linje peristatic pumpe (Masterflex Easy Load, 7518-00; Masterflex Pumpestyring, 60.648) med Hedeselskabet 2 O.
  3. Tilsættes ~ 0.0015g af heparin (Sigma, katalognr H4784), en antikoagulant, til 20 ml PBS pH 7,6 (Invitrogen, cat # 70.011).
  4. Bedøve α4YFP knock-i mus ved at injicere intramuskulært en blanding af ketamin (25 mg / kg, Wyeth Animal Health) og medatomidine hydrochlorid (0,25 mg / kg, Pfizer) i bagbenet muskel og umiddelbart placere dyret tilbage i hjemburet.
  5. Pin dyret en styrofoam låg indføres i en metalbakke. Tør thorax med 95% ethanol. Pinch huden med Adson pincet (Fine Science Tools, 91.106-12) og snip åbne brysthulen med iris saks. Spænd brystkassen med en ultra fin arterieklemme (Fine Science Tools, 13.021-12) og eksponere hjertet.
  6. Begynder at pumpe PBS ved 4 ml / min, og insert en 23G sommerfugl nål (Becton Dickinson, 367.253) i den venstre ventrikel af dyret. Umiddelbart klippe det højre atrium for at tillade blod og perfusatet for at undslippe.
  7. Perfundere 20 ml PBS (pH 7,6), hvorefter 30 ml 4% paraformaldehyd (pH 7,6, fortyndet med PBS fra en 16% PFA lager, Electron Microscopy Sciences, Cat # 15.710), derefter 20 ml af 5% sucrose (pH 7,6) . Vi har fundet, at over fiksering forøger autofluorescens. Perfusion med 5% sucrose skyller resterende PFA fra hjernen, hvilket sænker autofluorescens.
  8. Fjern hjerne og opbevar det i 30% sucrose i 3 dage.
  9. For at fryse hjerner for koronal sektionering, afbrød lillehjernen med et barberblad og sted hjerne i en plastik indlejring skimmel (VWR, kat # 18986-1) rostralt side op og nedsænkes i oktober Montering forbindelse (Tissue-Tek, kat # 4583) . Fryse i tøris og opbevares ved -20 ° C før udskæring.
  10. § hjerner (30 um tyk) på en kryostat og derefter overføre til coatede objektglas. Opbevar hjernen sektioner ved -20 &grader; C i slide kasser indeholdende en vandfri calciumsulfat sten. Slæden kasse skal være i en lynlås lås forseglet pose for at undgå fugt og efterfølgende frysebrand ved opbevaring ved -20 ° C.

3. Billeddannende fluorescerende nAChRs med spektral konfokal mikroskopi

  1. Sikre objektglas har minimal udsættelse for en lyskilde til at minimere fotoblegning.
  2. Dækglas hjernen sektion glider med en montering medium, som ikke inhiberer fluorescerende protein fluorescens. Vi har god succes med Mowiol 4-88 (pH 8,5 i Tris-HCI og glycerol, EMD-Calbiochem, cat # 475.904), som hærder efter nogle få timer. Sørg for, at Mowiol ækvilibrerer til stuetemperatur, før dækslet glider for at undgå luftbobler. Brug ikke neglelak når låget glide, da det vil slukke YFP fluorescens.
  3. Billeder er erhvervet ved hjælp af en Nikon C1si spektral konfokal mikroskop system. Nærmere oplysninger for beregningen af ​​spektrale konfokal billedbehandling og lineære unmixing er sikred. andetsteds 13-15. Rationalet for anvendelse af en spektral konfokalt mikroskop er det faste hjernevæv har iboende autofluorescens. Spektral konfokal billeddannelse på Nikon C1si anvender et array af 32 fotomultiplikatorrør detektorer, der udtages en række specificerede bølgelængder af fluorescerende udsendte lys, brydes rumligt i dets forskellige bølgelængder via et gitter dispergerende element ligesom en prisme brydende hvidt lys i en regnbue af farver 16. Hvad der er opsamlet en lambda stabel af billeder - billeder indsamles ved forskellige bølgelængder af lys, således at et emissionsspektrum opsamles for hver pixel i en lambda stabel af billeder. Idet YFP og væv autofluorescens hver har karakteristiske spektrale signatur, kan lambda stablen udfoldede anvendelse af en lineær unmixing algebraisk algoritme i separate YFP og autofluorescerende signaler (fig. 2). Således kan meget nøjagtig kvantificering af YFP fluorescens bestemmes også i væv med en høj grad af autofluorescence.
  4. Forskellige indstillinger kan justeres for at optimere billedkvaliteten og fluorescens samling effektivitet. Vi vil rapportere indstillinger vi typisk bruger, men disse indstillinger kan justeres afhængigt af prøven og konfokal mikroskop. Nøjagtigt kvantificere ændringer i α4YFP underenhed ekspression med kronisk nikotin vi sikre, at gråskalaniveauet intensiteten af ​​signalerne fra alle pixel er under mættende værdi (<4095 til 12 bit gråskala). Desuden har plads til potentiel forøgelse i signalet som følge af receptoren opregulering ved at justere den konfokale indstillinger, således at pixel er omkring en tredjedel af mætning værdi (~ 1300-1400) eller mindre. Når indstillingerne er optimeret, er indstillingerne opretholdes ens for alle billeddiagnostiske sessioner og prøver.
  5. Vi bruger følgende indstillinger for billedbehandling α4YFP ved hjælp af en 60X olie CFI Plan Apo VC mål (1,40 NA, 0,13 mm arbejder afstand): 488 nm laser line på 15% maksimal transmission af en 40 mW argon laser, Spektral detektor forstærkning ved 220, spektralområde afbildes fra 496,5 nm til 656,5 nm ved 5 nm opløsning, 512 x 512 pixels over en 50 um x 50 um-området, et medium pinhole størrelse (60 um diameter), en 4,08 pixel dvæletid, gennemsnit over to scanninger og 12 bits gråskala.

4. Lineær unmixing af spektrale konfokal billeder og billedanalyse

  1. For at udføre lineær spektral unmixing på en prøve billede taget med en spektral konfokal mikroskop, skal man først erhverve en reference spektrum for YFP og en reference spektrum for væv autofluorescens.
  2. En vigtig forudsætning for enhver henvisning frekvenser er at opnå et højt signal-til-støj fluorescensspektret afbildes med den samme laser linje anvendes til billeddannelse af Deres prøver. Selv om 514 nm laser linje Argon har en højere excitation effektivitet til at excitere YFP foretrækker vi at billedet YFP med 488 nm laser linje, fordi der er bedre adskillelse fra spidsen emission af YFP og 488 nm linien er mindre likely at fordreje toppen og man kan få hele YFP emission spektrum, herunder anledning til peak. Vi billede opløseligt YFP transficeret i en cellelinie, således at et stærkt YFP signal opnås, og den resulterende YFP spektrum lagres i vores bibliotek reference spektra. Transficeret α4YFP overudtrykt i cellelinjer kan ligeledes anvendes, idet det også vil tilvejebringe et højt signal til baggrund spektrum.
  3. For at opnå en reference spektrum af autofluorescens vi billedet autofluorescens fra en vildtype mus hjerne afsnit fra de forskellige områder af hjernen, som vi agter at billedet fra α4YFP musen og få deres tilsvarende spektre. Vi bruger den samme laser linie, 488 nm, og billedet ved hjælp af næsten identiske parametre, selv om vi kan ændre detektoren gevinst, laser intensitet eller udføre gennemsnit billedbehandling til at maksimere signal til støj.
  4. Efter at have opnået en spektral konfokal billede fra en hjerne region i α4YFP musen, er billedet derefter udfoldede i sin YFP og autofluorescence signaler ved at anvende en lineær spektral unmixing algoritme, der anvender referencespektret af YFP og referencespektret af vild-type mus autofluorescens fra samme område af hjernen.
  5. Den ublandede α4YFP billede kan derefter åbnes på en billedanalysesoftware såsom ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) og derefter den gennemsnitlige pixelintensitet beregnes for området af interesse. Et plugin til ImageJ kaldet "loci_tools.jar" ( http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej ) kan bruges til at importere Nikon ics / ids konfokal filer.
  6. Vi gentage den samme lineære spektrale unmixing og analyse til vild-type mus i samme område af hjernen for at opnå en baggrund restværdi.
  7. Så opnår man den korrigerede middelværdi α4YFP intensitet ved at trække baggrunden restværdi (4,6) fra den gennemsnitlige ukorrigerede α4YFP værdi (4,5).

5. Repræsentative resultater

Vi viser et repræsentativt ægte farve projektion af en lambda stabel af billeder af den mediale habenula fra en homozygot α4YFP mus (Fig. 3A) taget med en spektral konfokalt mikroskop. Vi viser emissionsspektret fra et område af interesse indeholdende α4YFP positive neuroner fra den samme lambda stabel billede (fig. 3B). En distinkt spidsværdien er tydelig ved ~ 527 nm, hvilket er den maksimale fluorescensemissionen af ​​YFP. Området tilgrænsende den mediale habenula viser et emissionsspektrum mangler en spektral spids ved 527 nm, hvilket indikerer fravær af α4YFP nAChR underenheder. Efter lineær spektrale unmixing anvendelse henvisning spektre for YFP og musehjerne autofluoresence med væsentlig overlapning af emission (fig. 4), adskillelse af YFP og autofluorescerende signal er muligt eftergivende en α4YFP ublandet billede, en autofluorescerende ublandet billede og en resterende kanal. Klar lokalisering af α4YFP influenzaorescence kan identificeres i tætpakkede soma af den mediale habenula (fig. 4).

I hippocampus α4YFP er lokaliseret hovedsageligt i den mediale perforante sti den tempero-ammonic bane og alveus 12. Disse er alle glutamaterge innervation af hippocampus. Vi undersøgte virkningerne af kronisk nikotin på α4YFP ekspression i den hippocampale perforante sti (fig. 5). Kronisk administration af nikotin (2 mg / kg / time i 10 dage) resulterede i en signifikant stigning (69 ± 14%) i α4YFP fluorescens fra kontrolceller saltvandsbehandlede mus til kroniske nikotin behandlede mus (p = 0,001, Wilcoxon rank sum test) ( Figur 5).

Figur 1
Figur 1. Flowdiagram, der viser proceduren for billedet ændringer i α4YFP nAChR underenheder med kronisk nikotin. Mini-osmotiske pumper er fyldt med enten saltvand eller nikotin og implanteret subkutant i og alpha; 4YFP homozygote mus. Efter 10 dage mus perfunderes og fikseret med 4% paraformaldehyd og musehjerner er snit (30 um tyk) på objektglas. Hjernen afsnit er afbildet på en spektral konfokal mikroskop (Nikon C1si) og spektralt ublandet i YFP og autofluorescerende billeder. Derefter α4YFP billeder analyseres yderligere med ImageJ software.

Figur 2
Figur 2. Et skematisk diagram af en lambda stabel afbildes fra en spektral konfokalt mikroskop og lineært ublandet i dets spektrale komponenter. (A) En lambda stabel af billeder indsamles. (B) En lambda stabel består af billeder indsamlet ved forskellige bølgelængder af lys, således at et emissionsspektrum opsamles for hver pixel i hele stakken. (C) Da YFP og væv autofluorescens hver har karakteristiske spektrale signatur, kan lambda stablen udfoldede anvendelse af en lineær unmixing algebraisk algoritme til separate YFP og autofluorescerende signaler. Således kan meget nøjagtig kvantificering af YFP fluorescens bestemmes også i væv med høje niveauer af autofluorescens.

Figur 3
Figur 3. Spectral konfokale billede af en hjerneregion udtrykker α4YFP nAChRs. (A) Et sandt farve projektion af en lambda stabel af billeder af den mediale habenula fra en α4YFP mus taget med et Nikon C1si spektral konfokalt mikroskop. (B) Plots af spektre fra en region af interesse, som omfatter α4YFP indeholdende neuroner (grøn) og en region af interesse uden for mediale habenula (rød).

Figur 4
Figur 4. Lineær spektral unmixing af medial habenula. (A) Billeder af ublandet α4YFP og (B) autofluorescens følgende lineære spektral unmixing. (C) Reference spektre af YFP (grøn trivinkler) og autofluorescens (gule cirkler), der anvendes til spektral unmixing.

Figur 5
Figur 5. Opregulering af a4-nAChRs i hippocampus af α4YFP knock-i mus udsat for kronisk nikotin. (A) en teglbeklædt montage af α4YFP fluorescens fra hippocampus. De to punkterede markerede områder er de omtrentlige placeringer på den nedre ekstremitet af den perforante sti af hippocampus, hvor analyser blev udført for hver mus. (B) α4YFP fluorescens var signifikant højere i den perforante sti mus udsat for kronisk nikotin end kronisk saltvand (* p = 0,001, Wilcoxon rank sum test). Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SEM fra n = 20 målinger for både saltvand og kronisk nikotin behandlede mus (5 mus for hver behandlingsgruppe).

Figur 6
Figur 6. Bedre depth ekspression af α4YFP sammenlignet med antistof mærkning. Xz ortogonale i α4YFP fluorescens (A) og VGlut2 antistof med Cy5 som en sekundær etiket (B). (C) afbildninger, som viser større fluorescens-signalintensitet nedbrydning over dybden af ​​antistoffarvning (sorte firkanter) sammenlignet med α4YFP (åbne cirkler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Anthony Renda blev støttet af en University of Victoria Graduate Fellowship Award. Denne forskning blev støttet af en Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant, en NARSAD Young Investigator Award (til RN), en Victoria Foundation - Myre og Winifred Sim Fund, en canadisk Institut for Innovation tilskud, en British Columbia Viden Fond og en naturlig Sciences and Engineering Research Council of Canada Research Tools og Instrumentering Grant. Vi takker Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald og Daniel Morgado for fremragende mus dyrehold.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mini-osmotic pumps Alzet model 2002
saline TEKnova, Inc. S5819
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt Sigma-Aldrich N5260
eye drops Novartis AG Tear-Gel
Vetbond glue 3M 1469SB
heparin sodium salt Sigma-Aldrich H4784
10x PBS Invitrogen 70011
ketamine Wyeth Animal Health 0856-4403-01
medatomidine hydrochloride Pfizer Pharma GmbH 1950673
23G butterfly needle BD Biosciences 367253
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
plastic embedding mold VWR international 18986-1
O.C.T. Mounting Compound Tissue-Tek 4583
Mowiol 4-88 EMD Millipore 475904 pH 8.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).
  2. Schwartz, R. D., Kellar, K. J. Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo. Science. 220, 214-216 (1983).
  3. Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).
  4. Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse. Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).
  5. Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents. J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).
  6. Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons. Neuron. 37, 577-5782 (2003).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  8. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  9. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  10. Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  11. Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).
  12. Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional α4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
  13. Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).
  14. Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E. Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. Periasamy, A., Day, R. N. , Oxford University Press. 180-192 (2005).
  15. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
  16. Larson, J. M. The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed. Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).
  17. Melvin, N. R., Sutherland, R. J. Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs. J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).
  18. Jones, I. W., Wonnacott, S. Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out. Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).
  19. Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures. J. Neurochem. , (2007).
  20. Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression. The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).
  21. Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).
  22. Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment. Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).
  23. King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration. Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).
  24. Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine. Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).
  25. Sparks, J. A., Pauly, J. R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice. Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).
  26. Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study. Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).
  27. Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391, 173-177 (1998).
  28. Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. Nature. 471, 597-601 (2011).
  29. Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436, 103-107 (2005).
  30. Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research. Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).
  31. Lang, T., Rizzoli, S. O. Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures. Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).

Tags

Neuroscience nikotinafhængighed knock-in mus spektral konfokal billedbehandling gult fluorescerende protein nikotinacetylcholinreceptorer
Spektral konfokal afbildning af Fluorescerende mærkede nikotinreceptorer i Knock-i mus med kronisk Nikotin Administration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Renda, A., Nashmi, R. Spectral… More

Renda, A., Nashmi, R. Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration. J. Vis. Exp. (60), e3516, doi:10.3791/3516 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter