Summary
Vi har utvecklat en ny teknik att kvantifiera nikotin förändringar acetylkolin receptor inom subcellulära regioner i vissa subtyper av CNS-neuroner för att bättre förstå mekanismerna bakom nikotinberoende med hjälp av en kombination av metoder, bland annat fluorescerande proteinet märkning av receptorn med hjälp av knock-in och spektrala konfokal bildalstring.
Abstract
Ligand-jonkanaler i det centrala nervsystemet (CNS) är inblandade i många förhållanden med allvarliga medicinska och sociala konsekvenser. Till exempel är beroende av nikotin via tobaksrökning en ledande orsak till för tidig död i världen (World Health Organization) och troligt orsakat av en förändring av jonkanal fördelning i hjärnan 1. Kronisk exponering för nikotin i både gnagare och människor resulterar i ett ökat antal nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR) i hjärnvävnad 1-3. På samma sätt har förändringar i de glutamaterga GluN1 eller GluA1 kanaler varit inblandad i att utlösa sensibilisering mot andra beroendeframkallande droger som kokain, amfetamin och opiater 4-6.
Följaktligen är förmågan att kartlägga och kvantifiera distribution och expression mönster av specifika jonkanaler kritiskt viktiga för att förstå mekanismerna för missbruk. Studiet av hjärnan regionspecifik effekter av enskilda läkemedel framfördes av tillkomsten av tekniker såsom radioaktiva ligander. Emellertid förhindrar den låga spatiala upplösningen av radioaktiv ligand-bindning förmågan att kvantifiera ligandstyrda jonkanaler i specifika undertyper av neuroner.
Genetiskt kodade fluorescerande reportrar, såsom grönt fluorescerande protein (GFP) och dess många varianter färg, har revolutionerat området biologi 7. Genom att genetiskt märka en fluorescerande reporter till ett endogent protein kan man visualisera proteiner in vivo 7-10. En fördel med fluorescerande märkning proteiner med en sond är att eliminera antikroppar används, som har frågor om specificitet och tillgängligheten till målproteinet. Vi har använt denna strategi för att fluorescerande märka nAChRs, vilket gjorde att studien av receptorn montering med Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i transfekterade odlade celler 11. På senare tid har vi använt knock-in att konstruera möss med gula fluorescerande proteinet taggade a4 nAChR subenheter (α4YFP), vilket möjliggör exakt kvantifiering av receptorn ex vivo vid submikrometer upplösning i CNS-neuroner via spektrala konfokalmikroskopi 12. Den riktade fluorescerande knock-in mutation ingår i det endogena stället och under kontroll av dess naturliga promotor, som producerar normala nivåer av uttryck och reglering av receptorn jämfört med otaggade receptorer i vildtyp möss. Detta knock-in kan utvidgas till fluorescerande märka andra jonkanaler och erbjuder en kraftfull strategi för att visualisera och kvantifiera receptorer i CNS.
I denna uppsats beskriver vi en metod för att kvantifiera förändringar i nAChR uttryck i specifika CNS neuroner efter exponering för kroniska nikotin. Våra metoder innefattar mini-osmotisk pump implantation intrakardiell perfusion fixering, avbildning och analys av fluorescensmärkta nikotinsyra RECeptor subenheter från α4YFP knock-in-möss (figur 1). Vi har optimerat fixeringen tekniken för att minimera autofluorescens från fast hjärnan tissue.We i detalj beskriva vårt avbildning metodik med hjälp av en spektral konfokalmikroskop i samband med en linjär spektral unmixing algoritm för att subtrahera autofluoresent signal för att exakt få α4YFP fluorescenssignal. Slutligen visar vi resultatet av kronisk nikotin-inducerad uppreglering av α4YFP receptorer i den mediala perforanta banan av hippocampus.
Protocol
1. Pumpen implantering
- Innan pumpen implantation, fylla och förbereda Alzet mini-osmotiska pumpar (Alzet, 2002 modell, Cupertino, USA) är noga med att inte införa luftbubblor. Denna modell av mini-osmotisk pump avger lösning vid en hastighet av 0,5 | il / h under 14 dagar. Se sterila betingelser. Väg tomma och fyllda pumpar. Vid avslutningen av experimentet (10 dagar efter implantation), kan den återstående vätskan i pumpen tas bort med en spruta och nål och vägdes för att beräkna den volym som pumpas.
- Pumpar med kontrollösning innehåller saltlösning (0,9% w / v, Teknova, S5819, Hollister, USA). För att bereda nikotinlösning, en 1 M förrådslösning av (-)-nikotin-tartrat-salt (Sigma, kat # N5260) späds i saltlösning (0,9% vikt / volym) och steriliserades genom filtrering genom ett 0,22 | im spruta-änden filtret. Vi har tidigare administrerat nikotin vid 0,4 och 2 mg / kg / h (beräknat som fri bas av nikotin) under 10 dagar.
- Förbered tre saltlösning bad (tre10 cm saltlösning fyllt petriskålar). När pumpen har fyllts och tak, tvätta pumpen ordentligt i varje successiv saltbad för att avlägsna eventuella spår av läkemedlet på det yttre skalet. Sänk fyllda pumpar i saltlösning för lagring fram till operation, hålla kontroll och nikotin pumpar i separata saltlösning behållare.
- För att uppmuntra en hälsosam återhämtning och minska risken för postoperativ infektion, har rena burar förberedda för en långsiktig återhämtning.
- För kortfristig återhämtning omedelbart efter operationen, förbereda en bur med en värmedyna och en värmelampa.
- För att undersöka kroniska nikotin effekter vi måste 5 till 6 homozygot α4YFP knock-hos möss (2-3 månader) i varje grupp (kontroll eller nikotin). Den α4YFP knock-i mus line har återkorsades för 10 generationer till C57BL/6J musstam. Vi ser till åldern och könet av alla möss är desamma för studien och att alla operationer utförs på samma dag för att minimera variabilitet. För att förhindra hyöverlevde olyckan hade de möss under och efter kirurgi, utrusta operationsbordet med en värmedyna täckt steril kirurgisk duk.
- Inducera α4YFP knock-i mus med 3 L / min syre och 3% isofluran och sedan underhålla anestesi vid 2,5 l / min syre och 1% isofluran. Vi föredrar isoflurananestesi grund efter avslutad operation isofluran rensar systemet snabbt och mössen är medvetna och rörlig inom ~ 2 min. Applicera ögondroppar omedelbart (Tear-Gel, Novartis) för att undvika skador på hornhinnan.
- Pumparna implanteras subkutant genom en hudincision på baksidan av halsen och pumpen trycks ned kaudalt den dorsala aspekten av ryggen. Torka av området på ryggen mellan frambenen med 95% etanol till matt päls. Nyp huden med 0,8 mm Graefe pincett (Fine Science Tools, 11.050-10) och gör en 1 cm central lateral cut med iris sax (Fine Science Tools, 14.060-10).
- För att skapa en subkutan utrymme för pumpen, sätt standardmönster saxs (Fine Science Tools, 14101-14) i snittet och tryck dem försiktigt mot kaudala slutet av djuret.
- Med 1,0 mm Graefe pincett (Fine Science Tools, 11.650-10), ta bort pumpen från saltlösning. Håll snitt öppna med hjälp av pincett och sätt pumpen i snitt med den osmotiska pumplocket mot kaudala slutet av djuret och tryck pumpen till den näst sista slutet.
- Nypa lindas stänga användning 0,8 mm pincett och applicera en tillräcklig mängd av Vetbond (3M, kat # 1469SB) lim. Håll tills såret är förseglad.
- Ta bort djuret från isofluran mask, injicera det smärtstillande medlet, meloxikam (0,1 mg / kg sc), och placera i en kortsiktig återhämtning buren fram medvetna och mobil. Sedan i en långsiktig återhämtning bur med mat och vatten tillgängligt ad libitum.
2. α4YFP knock-i mus fixering av intrakardiellt perfusion
- Gör lösningar en dag före förfarandet och lämna vid 4 ° C. För att minimera variabiliteten alla mösskommer att genomströmmas samma dag och med samma sats av lösningar.
- Utför perfusion upptagningar i ett väl ventilerat utrymme. Flush linje peristatic pump (Masterflex Easy Load, 7518-00; Masterflex Pump Controller, 60.648) med ddHaO 2 O.
- Tillsätt ~ 0,0015 av heparin (Sigma, kat # H4784), en antikoagulant, till 20 ml PBS, pH 7,6 (Invitrogen, kat # 70.011).
- Bedöva α4YFP knock-in mus genom att injicera intramuskulärt en blandning av ketamin (25 mg / kg, Wyeth Animal Health) och medatomidine hydroklorid (0,25 mg / kg, Pfizer) i bakbenet muskel och omedelbart placera djuret tillbaka till sin hembur.
- Stift djur till en polystyren lock införd i en metallbricka. Torka bröstkorgen med 95% etanol. Nyp huden med Adson pincett (Fine Science Tools, 91.106-12) och klipp öppna brösthålan med iris sax. Kläm fast bröstkorgen med en ultrafina hemostat (Fine Science Tools, 13.021-12) och exponera hjärtat.
- Börjar pumpa PBS vid 4 ml / min och insert en 23G fjärilsnål (Becton Dickinson, 367.253) i den vänstra ventrikeln hos djuret. Omedelbart klippa höger förmak så att blod och perfusat att fly.
- Perfundera 20 ml PBS (pH 7,6), därefter 30 ml av 4% paraformaldehyd (pH 7,6, späddes ut med PBS från en 16% PFA lager, Electron Microscopy Sciences, kat # 15.710), sedan 20 ml av 5% sukros (pH 7,6) . Vi fann att över fixering ökar autofluorescens. Perfusion med 5% sackaros sköljer kvarvarande PFA från hjärnan, vilket sänker autofluorescens.
- Ta bort hjärnan och förvara i 30% sackaros under 3 dagar.
- Att frysa hjärnor för coronal sektionering, stänga av lillhjärnan med ett rakblad och placera hjärnan i en plast bädda form (VWR, cat # 18.986-1) rostral uppåt och dränka i OCT Montering förening (Tissue-Tek, cat # 4583) . Frysa i torris och lagrades vid -20 ° C före skivning.
- § hjärnor (30 m tjockt) på en kryostat och sedan överföra till belagda bilder. Förvara hjärnan sektionerna vid -20 &grader, C bildspel lådor som innehåller en vattenfri sten kalciumsulfat. Bilden boxen bör vara i en zip-lås förseglad påse för att undvika fukt och efterföljande frysbränna vid förvaring vid -20 ° C.
3. Imaging fluorescerande nAChRs med spektral konfokalmikroskopi
- Se till att bilder har minimal exponering mot en ljuskälla för att minimera fotoblekning.
- Täckglas glasen hjärnan avsnitt med en montering medium som inte hämmar fluorescerande proteinet fluorescens. Vi har god framgång med Mowiol 4-88 (pH-värde 8,5 i Tris-HCl och glycerol, EMD-Calbiochem, kat # 475.904), som härdar efter några timmar. Kontrollera att Mowiol jämvikt till rumstemperatur innan locket glider för att undvika luftbubblor. Använd inte nagellack när locket glider eftersom det kommer att släcka YFP fluorescens.
- Bilderna förvärvas med hjälp av en Nikon C1si spektral konfokalmikroskop system. Detaljer för beräkning av spektral konfokal avbildning och linjär unmixing är att ged. annanstans 13-15. Den logiska grunden för att använda en spektral konfokalmikroskop är att fasta hjärnvävnad har inneboende autofluorescens. Spectral konfokala avbildning på Nikon C1si använder en rad av 32 detektorer fotomultiplikatorröret det provet ett särskilt urval av våglängder av fluorescerande utsända ljuset, bryts rummet i sina olika våglängder via ett galler dispersivt element precis som ett prisma brytande vitt ljus i en regnbåge av färger 16. Vad som samlas in är en lambda bunt bilder - bilder som samlats in vid olika våglängder av ljuset så att en emissionsspektrum samlas in för varje pixel i en lambda bunt bilder. Eftersom YFP och vävnad autofluorescens har vardera karakteristiska spektrala signaturer, kan det lambda stapeln avfaltade användning av en linjär unmixing algebraisk algoritm i separata YFP och autofluorescerande signaler (fig 2). Sålunda kan en mycket noggrann kvantifiering av YFP fluorescens bestämmas även i vävnad med en hög grad av autofluorescence.
- Olika inställningar kan justeras för att optimera bildkvaliteten och fluorescens avskiljningsgrad. Vi kommer att rapportera inställningar vi vanligtvis använder, men dessa inställningar kan justeras beroende på provet och konfokalmikroskop. Att exakt kvantifiera förändringar i α4YFP subenhet uttryck med kronisk nikotin vi se till att gråskalenivå intensitet signaler från alla pixlar är under mättar värde (<4095 för 12 bitars gråskala). Dessutom, hysa vi för potentiell ökning i signal på grund av receptor uppreglering genom att justera konfokala inställningarna så att pixlarna är cirka en tredjedel av mätta värde (~ 1300-1400) eller mindre. När inställningarna är optimerade, är inställningarna bibehålls identisk för alla avbildning sessioner och prover.
- Vi använder följande inställningar för avbildning α4YFP med en 60X olja CFI Plan Apo VC mål (1,40 NA, 0,13 mm arbetar avstånd): 488 nm laserlinjen på 15% maximal överföring av en 40 mW Argon laser, Spektral detektor förstärkning vid 220, spektralområdet avbildas från 496,5 nm till 656,5 nm vid 5 nm upplösning, 512 x 512 pixlar över en 50 | im x 50 | im-området och ett medium stifthålet storlek (60 | im diameter) och en 4,08 pixel uppehållstid, genomsnitt över två scans och 12 bitar av gråskala.
4. Linjär unmixing av spektrala konfokala bilder och bildanalys
- För att utföra linjära spektral unmixing på ett prov som bild tagen med en spektral konfokalmikroskop, måste man skaffa först en referens spektrum för YFP och en hänvisning spektrum för vävnaden autofluorescens.
- En viktig förutsättning för att någon hänvisning spektrum är att uppnå en hög signal-brus fluorescensspektrum avbildas med samma laser linje som används för avbildning av dina prover. Även om 514 nm laserlinjen av Argon har en högre excitation effektivitet för att excitera YFP vi föredrar att avbilda YFP med 488 nm laserlinjen eftersom det är bättre separation från toppen utsläpp av YFP och 488 nm linjen är mindre likely att snedvrida topp och man kan få hela spektrumet YFP emission inklusive upphov till topp. Vi bilden lösligt YFP transfekterad i en cell linje så att en stark YFP signal erhålls och den resulterande YFP spektrumet lagras i vårt bibliotek av referens spektra. Transfekterade α4YFP över uttryckt i cellinjer kan också användas eftersom den kommer också att ge en hög signal till bakgrund spektrum.
- För att få en referens spektrum av autofluorescens vi bilden autofluorescens från en vildtyp mushjärna avsnitt från de olika delar av hjärnan som vi tänker bild från α4YFP musen och få deras motsvarande spektra. Vi använder samma laser linje, 488 nm och bild med hjälp av nästan identiska parametrar, även om vi kan förändra detektorn vinsten, laser intensitet eller utföra genomsnittet avbildning för att maximera signal till brus.
- Efter att ha fått en spektral konfokal bild från en hjärna region i α4YFP musen är bilden sedan avfaltade i sin YFP och autofluorescence signaler genom att tillämpa en linjär spektral unmixing algoritmen med referens spektrum YFP och referens spektrum av vildtyp möss autofluorescens från samma hjärnan regionen.
- Den oblandade α4YFP bilden kan sedan öppnas i en mjukvara för bildanalys, såsom ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) och sedan medelvärdet pixelintensiteten beräknas för regionen av intresse. En plugin för ImageJ kallas "loci_tools.jar" ( http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej ) kan användas för att importera Nikon ICS / ids konfokala filer.
- Vi upprepar samma linjära spektrala unmixing och analys till vildtyp möss i samma hjärnan regionen att få en bakgrund restvärde.
- Därefter erhåller man den korrigerade medelvärdet intensitet α4YFP genom att subtrahera bakgrunden restvärdet (4,6) från den okorrigerade medelvärde α4YFP värde (4,5).
5. Representativa resultat
Vi visar en representativ sann färg projektion av en lambda-stapel av bilder av den medial habenula från en homozygot α4YFP mus (fig 3A) tas tillsammans med en spektral konfokalt mikroskop. Vi visar också emissionsspektrum från en region av intresse som innehåller α4YFP positiva neuroner från samma lambda stapeln bilden (fig. 3B). En distinkt emissionstoppen är uppenbar vid ~ 527 nm, vilket är toppen fluorescensemissionen YFP. Regionen angränsande till medial habenula visar en emissionsspektrum som saknar en spektraltopp vid 527 nm, vilket indikerar frånvaron av α4YFP nAChR-subenheter. Efter linjära spektrala unmixing med hänvisning spektra av YFP och mus hjärnan autofluoresence med betydande överlappning av utsläpp (Fig. 4), separering av YFP och autofluorescerande signal är möjligt vilket ger en α4YFP oblandad bild, en autofluorescerande oblandad bild och en rest kanal. Klar lokalisering av α4YFP influensaorescence kan identifieras i den tätt packade Soma av mediala habenula (Fig. 4).
I hippocampus α4YFP är lokaliserad främst i den mediala perforanta banan, Tempero-ammonic vägen och alveus 12. Dessa är alla glutamaterg innervation av hippocampus. Vi undersökte effekterna av kronisk nikotin på α4YFP expression i hippocampus perforanta bana (fig 5). Kronisk administrering av nikotin (2 mg / kg / h under 10 dagar) resulterade i en signifikant ökning (69 ± 14%) i α4YFP fluorescens från kontroll saltlösningsbehandlade möss kroniska nikotin behandlade möss (p = 0,001, Wilcoxon rank sum test) ( FIG. 5).
Figur 1. Flödesschema som visar förfarandet för att bilden förändringar i α4YFP nAChR subenheter med kronisk nikotin. Mini-osmotiska pumpar fyllda med antingen saltlösning eller nikotin och implanterades subkutant i & alphektar; 4YFP homozygota möss. Efter 10 dagar möss perfunderas och fixerades med 4% paraformaldehyd och hjärnorna mus sektioneras (30 ^ m tjock) på objektglas. Hjärnan delen avbildas på en spektral konfokalmikroskop (Nikon C1si) och spektralt oblandade i YFP och autofluorescerande bilder. Därefter α4YFP bilderna analyseras vidare med ImageJ mjukvara.
Figur 2. Ett schematiskt diagram över en lambda stapel avbildas från en spektral konfokalt mikroskop och linjärt oblandade i dess spektrala komponenter. (A) En lambda stapel av bilder uppsamlas. (B) Ett lambda stapel består av bilder som tas ut vid olika våglängder av ljus, så att en emissionsspektrum samlas in för varje bildpunkt i hela stapeln. (C) Eftersom YFP och vävnad autofluorescens har var karakteristiska spektrala signaturer, kan lambda stapeln avfaltade med hjälp av en linjär unmixing algebraisk algoritm i Sn separat YFP och autofluorescerande signaler. Sålunda kan en mycket noggrann kvantifiering av YFP fluorescens bestämmas även i vävnad med höga nivåer av autofluorescens.
Figur 3. Spectral konfokal bild av en hjärna region uttrycker α4YFP nAChRs. (A) En sann färg projektion av en lambda-stapel av bilder av den medial habenula från en α4YFP mus tillsammans med en Nikon-C1si spektral konfokalt mikroskop. (B) Kurvor över spektra från en region av intresse, vilket innefattar α4YFP innehållande neuroner (grön), och en region av intresse utanför medial habenula (röd).
Figur 4. Linjär spektrala unmixing av medial habenula. (A) Bilder från oblandad α4YFP och (B) autofluorescens följande linjära spektral unmixing. (C) Referens spektra av YFP (grön trivinklar) och autofluorescens (gula cirklar) som används för spektral unmixing.
Figur 5. Uppreglering av a4-nAChR i hippocampus hos α4YFP knock-i möss som exponerats för kronisk nikotin. (A) En sida vid sida montage av α4YFP fluorescens från hippocampus. De två streckade valområden är de ungefärliga platserna på den nedre delen av den perforanta banan av hippocampus var analyser utfördes för varje mus. (B) α4YFP fluorescens var signifikant högre i den perforanta banan av möss som exponerats för kronisk nikotin än kronisk saltlösning (* p = 0,001, Wilcoxon rank sum test). Resultaten representerar medelvärdet ± SEM från n = 20 mätningar för både salt-och kronisk behandlade nikotin möss (5 möss i varje behandlingsgrupp).
Figur 6. Bättre depth expression av α4YFP jämförelse med antikroppsmärkning. XZ ortogonala vyer av α4YFP fluorescens (A) och VGlut2 antikropp med Cy5 som en sekundär märkning (B). (C) grafer som visar större fluorescens nedbrytning signalintensitet med djupet för antikroppsfärgning (svarta kvadrater) jämfört med α4YFP (öppna cirklar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Anthony Renda stöddes av en University of Victoria Graduate Fellowship Award. Denna forskning stöds av en naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada Discovery Grant, en NARSAD Young Investigator Award (till RN), en Victoria Foundation - Myre och Winifred Sim Fund, en kanadensisk stiftelse för innovation bidrag ett British Columbia Kunskap utvecklingsfonden och en naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada Research Verktyg och Instrumentation Grant. Vi tackar Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald och Daniel Morgado utmärkt mus djurhållning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mini-osmotic pumps |  Alzet |
model 2002 | |
| saline | TEKnova, Inc. | S5819 | |
| (-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma-Aldrich | N5260 | |
| eye drops | Novartis AG | Tear-Gel | |
| Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
| heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| 10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
| ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
| medatomidine hydrochloride | Pfizer Pharma GmbH | 1950673 | |
| 23G butterfly needle | BD Biosciences | 367253 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| plastic embedding mold | VWR international | 18986-1 | |
| O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Mowiol 4-88 | EMD Millipore | 475904 | pH 8.5 |
References
- Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).
- Schwartz, R. D., Kellar, K. J. Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo. Science. 220, 214-216 (1983).
- Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).
- Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse. Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).
- Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents. J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).
- Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons. Neuron. 37, 577-5782 (2003).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).
- Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional α4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).
- Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E. Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. Periasamy, A., Day, R. N. , Oxford University Press. 180-192 (2005).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Larson, J. M. The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed. Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).
- Melvin, N. R., Sutherland, R. J. Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs. J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).
- Jones, I. W., Wonnacott, S. Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out. Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).
- Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures. J. Neurochem. , (2007).
- Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression. The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).
- Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).
- Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment. Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).
- King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration. Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).
- Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine. Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).
- Sparks, J. A., Pauly, J. R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice. Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).
- Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study. Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).
- Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391, 173-177 (1998).
- Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. Nature. 471, 597-601 (2011).
- Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436, 103-107 (2005).
- Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research. Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).
- Lang, T., Rizzoli, S. O. Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures. Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).
