Summary
जब दोनों अणुओं बातचीत कोशिकाओं की सतहों पर लंगर डाले हैं रिसेप्टर ligand बातचीत कैनेटीक्स को मापने के लिए एक आसंजन आवृत्ति परख वर्णित है. यह यंत्रवत् आधारित परख रिसेप्टर्स और ligands बातचीत के रूप में micropipette दबाव मानव आसंजन सेंसर के रूप में लाल रक्त कोशिका और integrin αLβ2 और कहनेवाला आसंजन अणु 1 का उपयोग कर उदाहरण है.
Protocol
1. पूरे रक्त से लाल रक्त कोशिकाओं अलगाव
- ईएएस-45 समाधान तैयार करें. मैं टेबल से सभी सामग्री के वजन और डि पानी के 100 200ml में भंग . पानी जोड़ें 1000ml समाधान बनाने के लिए और 8.0 के पीएच समायोजित. फ़िल्टर और 50ml द्वारा विभाज्य. भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रुक.
नोट: 1.2 चरण एक नर्स के रूप में एक प्रशिक्षित चिकित्सा पेशेवर ऐसे द्वारा प्रदर्शन किया जाना चाहिए एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ.
- एक 10ml EDTA युक्त ट्यूब में औसत प्रकोष्ठीय नस से खून की 3 5ml ड्रा और धीरे EDTA के साथ खून तुरंत मिश्रण है और अच्छी तरह से थक्के से बचने.
- प्रक्रिया खून का नमूना के रूप में के रूप में जल्द से जल्द. Centrifugation छोड़कर सभी निम्न चरणों तैयारी बाँझ रखने के लिए हुड के तहत किया जाना चाहिए. एक 50ml अपकेंद्रित्र ट्यूब रक्त स्थानांतरण, 5min 1000rpm @ 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा और बाँझ 1077 Histopaque अपकेंद्रित्र और 10ml जोड़ने दो बार दोहराएँ.
- 10 जोड़ेंमिलीलीटर ठंड और बाँझ Pbs, 5min @ 1000rpm के लिए अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला निकालें. 4 बार (5 बार का कुल) दोहराएँ.
- बाँझ ईएएस 45 (5min 1000rpm @, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ दो बार धो. पिछले धोने एक नई बाँझ 15ml ट्यूब में स्थानांतरित लाल रक्त कोशिकाओं के दौरान.
- Resuspend लाल रक्त कोशिकाओं in10ml ईएएस-45.
2. लाल रक्त कोशिकाओं biotinylation
- चरण 1 से लाल रक्त कोशिकाओं के साथ ट्यूब ले लो. है @ 5min 1000rpm, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए centrifuging के बाद सभी सतह पर तैरनेवाला निकालें कई शीशियों में से प्रत्येक के लिए लाल रक्त कोशिकाओं गोली के 10μl रखो और प्रत्येक शीशी पीबीएस की इसी राशि को जोड़ने (उदाहरण के लिए छह अलग लाल रक्त कोशिकाओं biotinylation सांद्रता की तैयारी की तालिका द्वितीय देख).
- टेबल द्वितीय के अनुसार ताजा Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 dilutions.
- प्रत्येक शीशी 0.1M borate बफर के 10μl जोड़ें.
- प्रत्येक शीशी बायोटिन समाधान की गणना राशि (उदाहरण के रूप में टेबल द्वितीय देख) और भंवर तुरंत जोड़ें.
- प्रत्येक आरबीसी शीशी प्लेसएक 50ml शंक्वाकार ट्यूब और अंग को घुमानेवाली पेशी पर कमरे के तापमान पर 30min के लिए सेते के अंदर.
- प्रत्येक शीशी 2min @ 2000rpm के लिए 3 बार धो ईएएस-45 800μl के साथ.
- प्रत्येक और 4 पर शीशी दुकान ईएएस-45 के 100μl जोड़ें डिग्री सेल्सियस अब अंतिम समाधान के प्रत्येक 1μl में ~ लाल रक्त कोशिकाओं की 1mln होना चाहिए.
3. लाल रक्त कोशिकाओं पर बायोटिन से जुड़े ligands * functionalizing
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार 2mg/ml streptavidin समाधान तैयार करें. Aliqouted समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
- 2.7 कदम (10μl) से streptavidin समाधान, भंवर के साथ लाल रक्त कोशिकाओं की एक समान राशि तुरंत मिक्स और 30min के लिए अंग को घुमानेवाली पेशी पर 4 पर सेते डिग्री सेल्सियस
- ईएएस-45 500μl के साथ 2min @ 2000rpm के लिए 3 बार धोएं. 15μl भंडारण के लिए 1 /% BSA-45 ईएएस जोड़ें.
- 3.3 20μg/ml ligand समाधान, भंवर के साथ कदम (10μl) से लाल रक्त कोशिकाओं के बराबर राशि तुरंत मिक्स और कमरे के तापमान पर 30min के लिए अंग को घुमानेवाली पेशी पर सेते हैं.
- के 500μl के साथ दो बार धो ईएएस -2min @ 2000rpm के लिए 45 / 1% BSA. भंडारण के लिए ईएएस-45 / 1% BSA के 15μl जोड़ें.
* यदि आपका प्रोटीन बायोटिन कड़ी जुड़ गई है आप (उदाहरण के लिए, थर्मो वैज्ञानिक # 21955 ईज़ी लिंक माइक्रो किट एनएचएस PEG4 - Biotinylation) प्रोटीन biotinylation के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के उपयोग या एक मध्यवर्ती कदम के रूप में biotinylated पर कब्जा एंटीबॉडी का उपयोग के रूप में दिखाया कर सकते हैं वीडियो में.
4. रिसेप्टर और ligand के घनत्व की मात्रा का ठहराव
- चरण 3 से ligand लेपित लाल रक्त कोशिकाओं को सेते हैं और कमरे के तापमान पर 30min के लिए एक अलग शीशी संबंधित Mabs के saturating सांद्रता के साथ रिसेप्टर असर कोशिकाओं में. नियंत्रण के लिए अप्रासंगिक निर्धारण मिलान एंटीबॉडी के साथ अलग - अलग शीशियों कोशिकाओं में सेते हैं. यदि प्राथमिक एंटीबॉडी fluorescently लेबल नहीं हैं, निर्माता के निर्देशों के अनुसार fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.
- इसी फ्लोरोसेंट कैलोरी के साथ प्रवाह cytometery द्वारा 4.1 चरण में तैयार नमूने का विश्लेषणibration मोती. के रूप में छवि में दिखाया घनत्व की गणना. 1.
5. कक्ष और कक्ष micropipette के लिए तैयार
- PN-30 'Narishige चुंबकीय ग्लास microelectrode क्षैतिज खींचने या Sutter उपकरण micropipette डांड़ी का उपयोग केशिका ट्यूब से micropipettes खींचो.
- Microforge साथ micromanipulator का प्रयोग एक वांछित आकार (आमतौर पर 1-5μm से आवश्यक व्यास पर्वतमाला अध्ययन में इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं के आकार पर निर्भर करता है) के लिए खींच लिया micropipette की नोक को समायोजित.
- इच्छित आकार करने के लिए माइक्रोस्कोप कवर ग्लास काटने से सेल कक्ष तैयार करें. दोनों पक्षों से खनिज तेल का उपयोग करने के लिए मध्यम वाष्पीकरण से बचने के लिए प्रयोग के दौरान osmolarity बदल के चैम्बर सील.
- चैम्बर के लिए रिसेप्टर और ligand असर कोशिकाओं जोड़ें.
6. Micropipette आसंजन आवृत्ति परख
- महाप्राण (व्यंजन) संबंधित pipettes द्वारा बातचीत कोशिकाओं और उपयोग कंप्यूटर क्रमादेशित piezoelectr आईसी अनुवादक नियंत्रित संपर्क क्षेत्र और समय के साथ अन्य सेल के साथ और बाहर के संपर्क आरबीसी ड्राइव करने के लिए. सेल जुदाई पर आरबीसी बढ़ाव देख द्वारा आसंजन घटनाओं का पता लगाएँ.
- चक्र संपर्क - त्याग दिए गए संपर्क समय के लिए 5-10 बार दोहराएँ. आसंजन या एक्सेल स्प्रेडशीट के एक स्तंभ में कोई आसंजन के लिए "0" के लिए "1" जोड़ने के द्वारा मनाया आसंजन घटनाओं का रिकार्ड. आप एक रिकॉर्डिंग डिवाइस का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, डिजिटल मीडिया या वीडियो टेप सूक्ष्म छवियों के लिए.
- आसंजन आवृत्ति बनाम संपर्क समय प्रत्येक संपर्क के समय के लिए कम से कम तीन अलग अलग सेल जोड़े का उपयोग करने के लिए एक मतलब और SEM प्राप्त वक्र रिकार्ड.
- अप्रासंगिक ligands (जैसे BSA) और / या अवरुद्ध ligands रिसेप्टर्स या उनके विशिष्ट कार्यात्मक नाकाबंदी Mabs का उपयोग के साथ लेपित लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करके नियंत्रण के लिए nonspecific बंधन वक्र रिकार्ड. प्रत्येक संपर्क के समय बिंदु पर विशिष्ट आसंजन आवृत्ति nonspecific आसंजन एक आवृत्ति को हटाने के द्वारा गणना की जा सकती है.
- विशिष्ट आसंजन आवृत्ति फ़िट एक बनाम एक संभाव्य मॉडल है कि आगे दूसरा आदेश और पहली आदेश रिवर्स, रिसेप्टर्स की एक प्रजाति और 1 ligands की एक प्रजाति के बीच बातचीत एक कदम का वर्णन (1 समीकरण) से संपर्क समय टी डेटा पी :
जहां कश्मीर एक 2d प्रभावी बंधन आत्मीयता है, कश्मीर बंद है बंद दर, मीटर अनुसंधान और मीटर एल संबंधित रिसेप्टर और ligand घनत्व चरण 4 में मापा हैं, और एक ग संपर्क क्षेत्र है. वक्र फिट एक ग और कश्मीर एक साथ lumped हैं और सामूहिक रूप से प्रभावी 2D आकर्षण के रूप में बुलाया के रूप में दो पैरामीटर, एक ग कश्मीर एक और कश्मीर बंद है. बंद दर के साथ अपने उत्पाद प्रभावी 2D पर दर है: एक ग कश्मीर पर = एक ग एक एक्स कश्मीर कश्मीर बंद.
विशिष्ट आसंजन आवृत्ति पी एक घटाव द्वारा कुल मापा आसंजन (पी) मापा 1,21 से nonspecific आसंजन अंश (पी nonspecific) की गणना है:
8. प्रतिनिधि परिणाम:
1 integrin α एल β 2 neutrophils पर साइट घनत्व के निर्धारण चित्रा. Neutrophils पहली बार 10min के लिए ई selectin के पुलिस महानिरीक्षक 1μg/ml के साथ incubated रहे थे 3,4 आंकड़े या ई selectin के पुलिस महानिरीक्षक के बिना इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक हालत मैच, और तब पीई संयुग्मित विरोधी के saturating सांद्रता (10μg/ml) के साथ मानव CD11a MAB (HI111 क्लोन, विशिष्ट तालिका देखेंअभिकर्मकों और उपकरण) या नियंत्रण के लिए अप्रासंगिक माउस IgG1, धोए, और तुरंत विश्लेषण. नमूने मानक QuantiBRITE पीई अंशांकन मोतियों के साथ बी.डी. LSR प्रवाह कोशिकामापी पर पढ़ रहे थे. कक्ष एक अंशांकन मोतियों की प्रतिदीप्ति histograms (गुलाबी) के साथ पता चलता है कि उन ई selectin के पुलिस महानिरीक्षक (नीले रंग) इलाज या अनुपचारित कोशिकाओं (हरे रंग) के साथ. विशिष्ट CD11a MAB धुंधला ठोस घटता है और अप्रासंगिक निर्धारण मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी धुंधला डॉटेड घटता में दिखाया गया है में दिखाया गया है. ई selectin के पुलिस महानिरीक्षक (सभी धोने के चरणों में और FACS बफर में उपस्थिति) के साथ इलाज किया कोशिकाओं CD11a घनत्व को प्रभावित नहीं के रूप में अनुपचारित कोशिकाओं के साथ तुलना से देखा था. पैनल बी घनत्व मात्रा का ठहराव की प्रक्रिया से पता चलता है. Log10 कक्ष से चार अंशांकन मनका histograms के प्रत्येक चोटी मूल्य का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (FI) के लिए गणना (गुलाबी हलकों) और बहुत विशिष्ट मनका प्रति पीई अणुओं के लिए (निर्माता) से. Log10 fluoresc के खिलाफ एक log10 मनका प्रति पीई अणुओं के रेखीय प्रतिगमनखिलाडि़यों प्लॉट था. ई selectin इलाज किया कोशिकाओं के लिए log10 वित्तीय संस्था (y) 3.99 (नीले ठोस वृत्त) और विशिष्ट MAB और नियंत्रण एंटीबॉडी के लिए 2.23 (नीले खुले सर्कल), respectivly बराबर मान. हम (x मान पैनल बी पर हरे और नीले हलकों के रूप में प्लॉट किए जाते हैं) के लिए रेखीय समीकरण को हल एक्स = log10 पीई / सेल और पीई के रूप में: MAB अनुपात 1:1 था, neutrophils पर α एल 2 β की कुल संख्या थी 9587 के रूप में गणना की. भूतल घनत्व अणुओं 43 / 2 सुक्ष्ममापी, न्युट्रोफिल 22 व्यास के रूप में 8.4μm का उपयोग करने के लिए गणना की थी. ICAM-1 के घनत्व इसी प्रवाह पीई विरोधी मानव CD54 MAB, जो 65 mol / 2 सुक्ष्ममापी बराबरी का उपयोग cytometery द्वारा मापा गया था .
चित्रा 2 micropipette प्रणाली schematics. हमारे micropipette प्रणाली घर में इकट्ठा किया गया था और तीन उप के होते हैं: एक इमेजिंग उपतंत्र एक निरीक्षण, आरईसी की अनुमतिord और micropipette-aspirated सेल के आंदोलनों का विश्लेषण, एक micromanipulation उपतंत्र के लिए एक सेल कक्ष से कक्षों का चयन करने के लिए सक्षम है, और एक दबाव उपतंत्र एक micropipettes में कोशिकाओं महाप्राण (व्यंजन) के लिए अनुमति देने के लिए. इमेजिंग उपतंत्र के मध्य टुकड़ा खुर्दबीन औंधा है (ओलिंप IMT2 IMT-2) एक 100x तेल विसर्जन 1.25 एनए उद्देश्य के साथ. छवि एक प्रभारी जोड़े डिवाइस (सीसीडी) कैमरा के माध्यम से एक वीडियो कैसेट रिकॉर्डर के लिए भेजा है. एक वीडियो टाइमर की व्यवस्था करने के लिए युग्मित है समय का ट्रैक रखने. प्रत्येक micropipette खुर्दबीन पर घुड़सवार और पतले एक तीन अक्ष हाइड्रोलिक micromanipulator के साथ तैनात एक यांत्रिक ड्राइव द्वारा चालाकी से किया जा सकता है. न्यूपोर्ट से यांत्रिक manipulators के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है. Micropipette धारकों के एक piezoelectric अनुवादक पर मुहिम शुरू की है, जिनमें से चालक piezo actuator के लिए एक वोल्टेज प्रवर्धक (घर का बना) के माध्यम से एक कंप्यूटर LabVIEW कोड (अनुरोध पर उपलब्ध) और एक DAQ बोर्ड के माध्यम से संकेत अनुवाद के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. यह एकएक llows एक आसंजन परीक्षण चक्र में पिपेट और ठीक repeatably कदम. दबाव विनियमन उपसिस्टम प्रयोग के दौरान चूषण नियंत्रण के लिए प्रयोग किया जाता है. एक हाइड्रोलिक लाइन एक द्रव जलाशय micropipette धारक को जोड़ता है. एक ठीक यांत्रिक positioner जलाशय की ऊंचाई ठीक हो चालाकी की अनुमति देता है.
Micropipettes KIMAX पिघलने बिंदु borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब (1.0 व्यास के बाहर के साथ ± 0.07 मिमी और 0.7 के अंदर व्यास ± 0.07 मिमी का उपयोग करने के लिए उत्पन्न कर रहे हैं सबसे पहले, केशिका ट्यूब से micropipettes पी.एन. 30 Narishige चुंबकीय ग्लास microelectrode क्षैतिज खींचने का उपयोग करने के लिए खींच रहे हैं. (Sutter उपकरण micropipette डांड़ी अन्य खींचने विकल्प है) दूसरा, Microforge प्रणाली (घर में निर्मित) के लिए वांछित आकार खोलने के लिए micropipettes में कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Microforge प्रणालियों के वाणिज्यिक मॉडल के रूप में अच्छी तरह से उपलब्ध हैं.
के दौरान प्रयोग, microsc micropipettes के कंपन से बचनेope, micromanipulators के साथ एक हवा निलंबन की मेज पर रखा गया है.
चित्रा 3 आसंजन आवृत्ति एफ रनिंग मैं के लिए विशिष्ट (ए) और nonspecific (बी) 1s (लाल) में बाध्यकारी और संपर्क (नीला) ICAM (A) 1 या hIgG के साथ लेपित लाल रक्त कोशिकाओं के बीच दोहराया आसंजन परीक्षण चक्र से मापा बार 10s (बी ) मानव integrin α एल 2 β व्यक्त neutrophils के साथ एफ. i = (एक्स 1 + 2 एक्स + ... + X मैं) / i (1 ≤ n ≤ i), जहाँ मैं परीक्षण चक्र सूचकांक है एक्स मैं "1" के बराबर होती है (आसंजन) या "0" (कोई आसंजन एफ) n (n = 50) आसंजन प्रायिकता के लिए सबसे अच्छा अनुमान के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
के 4 कैनेटीक्स चित्राICAM 1 न्युट्रोफिल integrin α एल 2 β के लिए बाध्य ( 
). आसंजन मापा प्रायिकता के रूप में प्रत्येक संपर्क के समय में तीन जोड़े के लिए सेल चित्रा 3 में दिखाया गया है औसत और संपर्क समय बनाम प्लॉट किए जाते हैं. चैम्बर मध्यम 2 Ca के प्रत्येक 1mm + और मिलीग्राम 2 + प्लस 1μg/ml dimeric की ई selectin के पुलिस महानिरीक्षक के साथ HBSS α एल β 2 बाध्यकारी upregulate था . लाल रक्त कोशिकाओं पर ICAM-1-पुलिस महानिरीक्षक पर कब्जा करने के लिए, एक मध्यवर्ती कदम streptavidin ऊष्मायन कदम के बाद 10μg/ml कब्जा एंटीबॉडी (biotinylated बकरी मानव विरोधी एफसी एंटीबॉडी eBioscience,) के साथ लाल रक्त कोशिकाओं को सेते हैं जोड़ा गया है. 1) लाल रक्त कोशिकाओं पर कब्जा विरोधी मानव - एफसी एंटीबॉडी के साथ लेपित है और मानव आईजीजी के साथ (का.) ICAM 1 पुलिस महानिरीक्षक और 2) लाल रक्त कोशिकाओं के लिए बाध्य neutrophils के बजाय incubated के साथ नहीं लेपित: nonspecific बंधन दो अलग अलग परिस्थितियों के लिए नियंत्रण इस्तेमाल किया गया एंटीबॉडी पर कब्जा (Δ). 10μg/ml मानव आईजीजी मध्यम करने के लिए जोड़ा गया है ई के बंधन कम से कमआरबीसी सतह पर कब्जा एंटीबॉडी के समाधान में selectin के पुलिस महानिरीक्षक. Nonspecific मानव आईजीजी नियंत्रण वक्र के रूप में दर्ज करने के लिए बाध्य एक विशिष्ट आसंजन संभाव्यता वक्र प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ( 
) Eq का उपयोग कर. 2. फिटिंग Eq के साथ विशिष्ट आसंजन संभाव्यता वक्र. 1 (ठोस लाइन) प्रभावी बंधन आत्मीयता एक ग कश्मीर 1.4 = • 10 -4 μm4 और कश्मीर बंद = 0.3 -1 एस लौट आए.
| अभिकर्मक | मेगावॉट (छ mol /) | एकाग्रता (मिमी) | राशि (छ) |
|---|---|---|---|
| Adenine | 135.13 | 2 | 0.27 |
| डी ग्लूकोज (dextrose) | 180.16 | 110 | 19.82 |
| D-Mannitol | 182.17 | 55 | 10.02 |
| सोडियम क्लोराइड (NaCl) | 58.44 | 50 | 2.92 |
| सोडियम फास्फेट, Dibasic (ना HPO ) | 141.95 | 20 | 2.84 |
| एल-glutamine | 146.15 | 10 | 1.46 |
टेबल 1 ईएएस-45 बफर तैयारी (1L).
| 25 DMF के 550 μl में बायोटिन XHS मिलीग्राम | 0.1M बायोटिन समाधान |
| 0.1 बायोटिन w / DMF के कमजोर पड़ने 1:10 | 0.01M बायोटिन समाधान |
| 0.1 बायोटिन w / DMF के कमजोर पड़ने 1:100 | 0.001M बायोटिन समाधान |
तालिका 2 बायोटिन समाधान तैयार.
| बायोटिन अंतिम एकाग्रता (सुक्ष्ममापी) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| लाल रक्त कोशिकाओं गोली शेयर (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x पीबीएस (μl) | 179.2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176.8 |
| 0.1M borate बफर (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0.01M बायोटिन समाधान (μl) | 1 | 2 | 3.2 | |||
| 0.001M बायोटिन समाधान (μl) | 0.8 | 2 | 4 |
तालिका 3 लाल रक्त कोशिकाओं की Biotinylation.
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Discussion
सफलतापूर्वक micropipette आसंजन आवृत्ति परख कई महत्वपूर्ण कदम पर विचार करना चाहिए का उपयोग करें. सबसे पहले, ब्याज की रिसेप्टर ligand प्रणाली के लिए विशिष्ट बातचीत रिकॉर्ड करने के लिए सुनिश्चित करें. Nonspecific नियंत्रण माप (cf. चित्र 3, 4) विशिष्टता को सुनिश्चित करते हैं. आदर्श रूप में, nonspecific आसंजन संभावनाओं 0.05 नीचे सभी संपर्क समय durations के लिए हो सकता है और प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक विशिष्ट और nonspecific आसंजन संभावनाओं के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है. विभिन्न तरीकों लाल रक्त कोशिकाओं की सतह के लिए ligands जोड़े को इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दिखाया गया था कि क्रोमियम क्लोराइड 17 विधि युग्मन बायोटिन-streptavidin युग्मन की तुलना में एक nonspecific बंधन के उच्च स्तर दिया.
दूसरा, विशिष्ट बातचीत के लिए एक आसंजन प्रायिकता मध्यम श्रेणी में होना चाहिए. इस आवश्यकता को रिसेप्टर्स की घनत्व और ligands (या लाल रक्त कोशिकाओं पर केवल ligands अलग अगर रिसेप्टर्स अनिवार्यता से सेल पर व्यक्त कर रहे हैं से मुलाकात हो सकता हैघनत्व जिनमें से बदलना मुश्किल है ओं). इस प्रयोजन के लिए, जब अज्ञात रिसेप्टर ligand बंधन आत्मीयता के साथ एक नई प्रणाली का परीक्षण, biotinylated लाल रक्त कोशिकाओं की एक श्रृंखला है (एक उदाहरण के रूप में टेबल क्ष्क्ष्क्ष् देख) तैयार करने के लिए ligand के घनत्व की एक किस्म का परीक्षण. आसंजन स्थिर राज्य संभावना अधिक नहीं औसत पर 0.8 के रूप में की तुलना में किया जाना चाहिए सेल सेल रिसेप्टर घनत्व भिन्नता आमतौर पर 1 के लिए कुछ कोशिकाओं के आसंजन स्तर लाता है, अगर औसत ligand घनत्व बहुत अधिक है. विशिष्टता के लिए प्रारंभिक परीक्षण के दौरान, अगर कुछ कोशिकाओं 0 या 1 के आसंजन स्तर है, ligand के घनत्व को समायोजित करने की जरूरत है. Nonspecific नियंत्रण माप आमतौर पर विशिष्ट माप का पालन करें और यहाँ एक आसंजन संभावना है के रूप में संभव के रूप में शून्य के करीब करना चाहते हैं.
तीसरा, संपर्क समय के लिए सही श्रृंखला मिल. Eq में शब्द (कश्मीर बंद टी) यदि संपर्क के समय काफी लंबे समय ऍक्स्प है . एक शून्य को जाता है और प्रभावी 2D आत्मीयता पठार स्तर से गणना की जा सकतीआसंजन एक वक्र की: 
बंद दर कश्मीर बंद संक्रमण चरण या कितनी जल्दी आसंजन वक्र एक पठार के स्तर तक पहुँचता है निर्धारित करता है . बंद दर का अनुमान करने के लिए सही एक पठार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संक्रमण चरण में स्तर पर्याप्त समय अंक में कई अंकों की माप की आवश्यकता है. एक के ऊपर वर्णित तीन महत्वपूर्ण चरणों के लिए लेखांकन बाध्यकारी छवि के लिए इसी तरह घटता प्राप्त करेंगे. 4.
शेष कार्य के लिए एक रिसेप्टर ligand बाध्यकारी कैनेटीक्स मॉडल का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक मापा बाध्यकारी वक्र की व्याख्या और डेटा मॉडल भविष्यवाणी फिटिंग से 2D गतिज मापदंडों का अनुमान है. यह उल्लेखनीय है कि Eq चाहिए. 1 आगे दूसरा आदेश के एक सरल मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, पहले के आदेश रिवर्स एकल कदम एक एकल रिसेप्टर ligand 1 प्रजातियों के बीच , पलटवाँ कैनेटीक्स. और अधिक जटिल गतिज प्रक्रियाओं वें सहित वर्णित किया गया है,दोहरी रिसेप्टर ligand 3,4 प्रजातियों, दो चरण में 14 बिना 19 trimolecular बातचीत, और आसंजन बंधन 10 कैनेटीक्स के बजाय सक्रिय साइट के गठन के द्वारा सीमित कैनेटीक्स के साथ बंधनकारी या ई मामलों. इन मामलों में, और अधिक शामिल गणितीय मॉडल आसंजन प्रायिकता बनाम संपर्क समय की अवस्था और रिसेप्टर ligand बाध्यकारी कैनेटीक्स से संबंधित करने के लिए आवश्यक हैं.
रिसेप्टर ligand बातचीत के कैनेटीक्स में निरंतर मौलिक परिकल्पना है कि कैनेटीक्स मापदंडों सेल के अंदर बहाव संकेत घटनाओं का निर्धारण करने में एक भूमिका निभा ब्याज की वजह से उपजी है. micropipette आसंजन आवृत्ति परख यहाँ प्रस्तुत एक बहुत कुछ तरीकों कि स्वस्थानी माप में दो आयामी (2d) बाध्यकारी कैनेटीक्स की अनुमति है. दो आयामी मतलब है कि दोनों सेल सतहों पर रिसेप्टर्स और ligands हैं, के रूप में स्वाभाविक रूप से जीव के अंदर कई सेल सेल बातचीत में होता है. 2D रिसेप्टर lig की गतिज दर स्थिरांकऔर बाध्यकारी तेजी से कैसे कोशिकाओं को एक दूसरे या बाह्य मैट्रिक्स के लिए बाध्य के लिए जानकारी प्रदान करने के लिए, कितनी देर तक वे बाध्य रहते हैं, और कितने बांड फार्म का होगा. तुलना करके, सतह plasmon अनुनाद विधि (SPR) में बातचीत अणुओं की एक 23 द्रव चरण में है, इसलिए तीन आयामी (3 डी) बाध्यकारी बुलाया. क्योंकि दोनों बातचीत अणुओं और शुद्ध सेलुलर पर्यावरण से अलग कर रहे हैं, गतिज 3D माप में प्राप्त मानकों काफी 2D माप में प्राप्त एक ही रिसेप्टर ligand 17 जोड़ी के लिए भी उन लोगों से अलग किया जा सकता है.
आसंजन आवृत्ति विधि कोशिका झिल्ली जीने पर 2D कैनेटीक्स का विश्लेषण करती है और इस तरह एक के लिए सेलुलर पर्यावरण के biophysical और जैव रासायनिक नियमों का विश्लेषण करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है. इनमें microtopology 5, झिल्ली झिल्ली 2 लंगर, आणविक अभिविन्यास और 6 लंबाई, वाहक 9 कठोरता और curva शामिल हैं20 संरचना, भिडंत 20 शक्ति है, और cytoskeleton और झिल्ली संगठन जहां बातचीत अणुओं 15,17 निवास के modulators.
क्योंकि पार junctional बातचीत रिसेप्टर ligand दो कक्षों और दो कोशिकाओं के बीच शारीरिक संबंध में परिणामों के बीच प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्क की आवश्यकता है, आणविक बातचीत की रासायनिक प्रतिक्रिया कैनेटीक्स एक यांत्रिक परख है कि संपर्क में कोशिकाओं डालता है और प्रभाव के द्वारा बाध्यकारी का पता लगाता है द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है बल के. हालांकि हम आसंजन आवृत्ति एक आसंजन संवेदक के रूप में एक micropipette aspirated आरबीसी का उपयोग परख उदाहरण है, परमाणु शक्ति 24 माइक्रोस्कोपी, biomembrane बल 8,17 जांच, ऑप्टिकल चिमटी 25, और एकीकृत micropipette और 26 ब्रैकट सहित अन्य बल तकनीक हो सकता है, इस्तेमाल किया जा सकता है.
अन्य यंत्रवत् आधारित 2D assays विकसित किया गया है. इन थर्मल अस्थिरता 8 परख, centrifuga शामिलtion परख 27,28, 29 परख, और प्रवाह चैम्बर परख 30,31 rosetting.
आसंजन आवृत्ति परख की सीमा कक्षों की एक जोड़ी के साथ दोहराया धारावाहिक चक्र एक समय में एक संपर्क का परीक्षण करने के लिए कारण परख की धीमी और श्रम गहन प्रकृति है. यह धीमी गति से बंद दरों के साथ रिसेप्टर ligand बातचीत के लिए मुश्किल हो जाता है क्योंकि लंबे बार संपर्क करने के लिए बाध्य स्थिर राज्य तक पहुँचने के लिए वक्र के लिए आवश्यक होगा, प्रयोग inhibitively लंबे समय बनाने के.
बल द्वारा एक micropipette aspirated आरबीसी निर्माण transducer piconewton स्तर बलों, जो एक noncovalent रिसेप्टर ligand 1,32 बांड की विशिष्ट शक्ति की तुलना में कम परिमाण के एक आदेश है का पता लगाने के लिए सक्षम है. हालांकि, रिसेप्टर ligand हदबंदी भी शून्य बलों पर हो सकता है. कोई कमजोर आसंजन है कि बंधन आत्मीयता और 1-दर पर का एक मूल्यवान समझना नहीं चल पाता सुराग चला जाता है .
टीवह आसंजन आवृत्ति विधि मानता है कि प्रत्येक आसंजन परीक्षण समान है और दूसरों से स्वतंत्र है. यह कुछ 33 प्रणालियों, जहां वर्तमान आसंजन वृद्धि हुई है या अगले आसंजन की संभावना कम के लिए आवश्यकता के रूप में दिखाया गया था उल्लंघन किया जा सकता है . जाँच अगर आवश्यकता आसंजन घटनाओं के अनुक्रम दर्ज के लिए मुलाकात की है के लिए Matlab कोड अनुरोध पर उपलब्ध है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन NIH R01HL091020 अनुदान, R01HL093723, R01AI077343, और R01GM096187 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
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