Summary
Un ensayo para medir la frecuencia de adhesión ligando del receptor de la cinética de interacción cuando ambas moléculas están anclados en la superficie de las células que interactúan se describe. Este ensayo mecánico basado en se ejemplifica mediante la micropipeta presurizado glóbulo rojo humano como sensor de adhesión y αLβ2 integrina y la molécula de adhesión intercelular-1 como interactúan los receptores y ligandos.
Abstract
El ensayo de adhesión micropipeta fue desarrollado en 1998 para medir dos dimensiones (2D) ligando del receptor de la cinética de unión 1. El ensayo utiliza un glóbulo rojo humano (RBC) como sensor de la adhesión y la célula presentadora de una de las moléculas que interactúan. Emplea a micromanipulación para que la RBC en contacto con otra célula que expresa la molécula interactúa con otras área controlada con precisión y el tiempo para permitir la formación de enlaces. El acto de adhesión se detecta como la elongación de glóbulos rojos a tirar de las dos células separadas. Mediante el control de la densidad de los ligandos inmovilizados en la superficie de glóbulos rojos, la probabilidad de que la adhesión se mantiene en el rango medio entre 0 y 1. La probabilidad de adherencia se estima a partir de la frecuencia de los fenómenos de adhesión en una secuencia de ciclos repetidos contactos entre las dos células de un tiempo de contacto determinado. Variando el tiempo de contacto genera una curva de unión. Ajuste de un modelo probabilístico para la reacción del receptor-ligando una cinética de la unióncurva de rendimientos de la afinidad en 2D y descuento sobre la tarifa.
El ensayo ha sido validado con las interacciones de los receptores Fc gamma con IgG Fc 1-6, selectinas con ligandos glicoconjugados 6-9, las integrinas con ligandos 10-13, homotypical vinculante cadherina 14, receptor de células T y co-receptor con complejos de histocompatibilidad péptido principales 15 - 19.
El método se ha utilizado para cuantificar las regulaciones de la cinética en 2D, los factores biofísicos, tales como la membrana microtopology 5, la membrana de anclaje 2, la orientación molecular y longitud 6, rigidez portador 9, la curvatura de 20, y la fuerza de compresión 20, así como los factores bioquímicos, como moduladores del microambiente del citoesqueleto y la membrana donde las moléculas interactúan y viven de la organización superficie de estas moléculas 15,17,19.
El método también se ha utilizado to estudiar la unión simultánea de dos ligando del receptor de la misma especie 3,4, y las interacciones trimolecular 19 utilizando un modelo modificado 21.
La principal ventaja del método es que permite el estudio de los receptores de membrana en su ambiente nativo. Los resultados podrían ser muy diferentes de los obtenidos con receptores purificada 17. También permite el estudio de las interacciones ligando-receptor en un plazo de tiempo inferiores a un segundo con una resolución temporal más allá de los métodos bioquímicos típicos.
Para ilustrar el método de adherencia micropipeta frecuencia, se muestra la medición cinética de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) en los glóbulos rojos funcionalizados la unión a la integrina α β 2 L de neutrófilos con dimérica E-selectina en la solución para activar α β L 2.
Protocol
1. Los glóbulos rojos aislados de la sangre entera
- Prepare EAS-45 soluciones. Sopesar todos los ingredientes de la Tabla I y se disuelven en 100-200ml de agua DI. Agregar agua hasta 1000 ml solución y ajustar el pH a 8.0. Filtro y alícuotas de 50 ml. Congelar a -20 ° C para su almacenamiento.
Nota: El paso 1.2 debe ser realizada por un técnico profesional de la medicina como una enfermera, con una Junta de Revisión Institucional protocolo aprobado.
- Dibuja 3 de 5 ml de sangre de la vena cubital mediana en un tubo de 10 ml que contiene EDTA y mezcle suavemente la sangre con EDTA inmediatamente ya fondo para evitar la coagulación.
- Proceso de muestra de sangre tan pronto como sea posible. Todos los pasos siguientes, excepto la centrifugación se debe hacer bajo el capó para mantener la preparación estéril. Transferencia de la sangre a un tubo de centrífuga de 50 ml, agregar 10 ml de Histopaque frío y estéril 1077 y centrifugar durante 5 min @ 1000 rpm, 4 º C. Repita dos veces.
- Añadir 10ml fría y estéril PBS, durante 5 minutos @ 1000 rpm, 4 º C. Eliminar el sobrenadante. Repite 4 veces (un total de 5 veces).
- Lavar con agua estéril EAS-45 (5 min @ 1000 rpm, 4 ° C) dos veces. Durante los últimos glóbulos rojos se mueven de lavado a un nuevo tubo de 15 ml estéril.
- Resuspender los eritrocitos in10ml EAS-45.
2. Los glóbulos rojos biotinilación
- Tome el tubo con los glóbulos rojos en el paso 1. Eliminar todas las sobrenadante tras centrifugación durante 5 min @ 1000 rpm, 4 º C. Ponga 10μl de los glóbulos rojos de pellets a cada uno de varios viales y agregue la cantidad correspondiente de PBS a cada vial (ver Tabla II, por ejemplo, de la preparación de seis concentraciones diferentes biotinilación glóbulos rojos).
- Hacer nuevas Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 diluciones de acuerdo a la Tabla II.
- Añadir 10μl de tampón borato 0,1 M a cada vial.
- Agregue la cantidad calculada de la solución de biotina a cada vial (ver Tabla II como ejemplo) y agitar inmediatamente.
- Coloque cada vial RBCdentro de un tubo cónico de 50 ml y se incuba durante 30 minutos en rotador a temperatura ambiente.
- Lavar el vial 3 veces con 800μl de EAS-45 @ 2000 rpm durante 2 minutos.
- Agregar 100μl de EAS-45 a cada vial y almacenar a 4 ° C. En cada 1μl de la solución final debería ser ahora ~ 1mln de los glóbulos rojos.
3. Funcionalización de la * biotina ligada a ligandos en los glóbulos rojos
- Prepare una solución de estreptavidina 2mg/ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aliqouted solución puede conservarse a -20 ° C.
- Mezcle la misma cantidad de glóbulos rojos en el paso 2.7 (10μl) con una solución de estreptavidina, vortex e incubar inmediatamente en el rotador de 30 minutos a 4 ° C.
- Lavar 3 veces con 500μl de EAS-45 @ 2000 rpm durante 2 minutos. Añadir 15μl EAS-45 / 1% de BSA para el almacenamiento.
- Mezcle la misma cantidad de glóbulos rojos en el paso 3.3 (10μl) con una solución de ligando 20μg/ml, vortex e incubar inmediatamente en el rotador de 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces con 500μl de EAS-45 / 1% BSA durante 2 minutos @ 2000rpm. Añadir 15μl de EAS-45 / 1% de BSA para el almacenamiento.
* Si la proteína no tiene ningún vínculo con biotina puede utilizar uno de los kits disponibles en el mercado de biotinilación de proteínas (por ejemplo, Thermo Scientific 21955 # EZ-Link Micro-NHS-peg4 biotinilación Kit) o el uso de anticuerpos con biotina captura como un paso intermedio, como se muestra en el video.
4. La cuantificación de la densidad de receptores y ligandos
- Incubar ligando recubierto de glóbulos rojos en el paso 3 y, en otro vial, teniendo los receptores de las células con concentraciones de saturación de mAbs respectivos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Incubar en las células de viales separados de irrelevante isotipo de anticuerpos para el control. Si los anticuerpos primarios no están marcados con fluorescencia, se incuban con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
- Analizar las muestras preparadas en el paso 4.1 por cytometery flujo con sus correspondientes cal fluorescentesibration cuentas. Calcular las densidades, como se muestra en la fig. 1.
5. Preparación para la micropipeta y la cámara de celular
- Tire de micropipetas de tubos capilares con PN-30 Extractor magnético Narishige 'microelectrodos de vidrio horizontal o Sutter Micropipeta Instrumentos de extractores.
- Use micromanipulador con microforge para ajustar la punta de la micropipeta tiró al tamaño deseado (por lo general los rangos de diámetro requerido de 1-5μm según el tamaño de las células para ser utilizadas en el estudio).
- Prepare la cámara de la célula mediante la reducción de la cubierta de vidrio para microscopio con el tamaño deseado. Sellar la cámara utilizando el aceite mineral de ambas partes para evitar la evaporación del medio para cambiar la osmolaridad durante el experimento.
- Añadir las células del receptor-ligando y teniendo a la cámara.
6. Adherencia micropipeta frecuencia de ensayo
- Aspirar las células interactuando por pipetas respectivos y el uso de computadoras programadas piezoelectr Traductor IC para conducir los glóbulos rojos dentro y fuera de contacto con la célula con otra área de contacto controlado y tiempo. Detectar eventos de adhesión mediante la observación de la elongación de glóbulos rojos en caso de separación de células.
- Repita el ciclo de contacto-retracción 50-100 veces por un tiempo de contacto determinado. Registrar los eventos observados adhesión mediante la adición de "1" para la adhesión o "0" para no adherencia en una columna de hoja de cálculo Excel. Usted puede usar un dispositivo de grabación, por ejemplo, medios digitales o de video, las imágenes microscópicas.
- Registro de la frecuencia de adherencia en relación con la curva de tiempo de contacto con al menos tres pares de células diferentes para cada tiempo de contacto para obtener una media y SEM.
- Registro de la curva de unión no específica para el control mediante el uso de los glóbulos rojos recubiertos con ligandos irrelevantes (por ejemplo, BSA) y / o el bloqueo de los ligandos o receptores con sus AcMo específicos bloqueo funcional. Frecuencia de adhesión específicas en cada punto de tiempo de contacto se puede calcular mediante la eliminación de la frecuencia de adherencia no específica 1.
- Ajustar la frecuencia de adhesión específicas P a los datos de contacto en comparación con el tiempo t por un modelo probabilístico (Ecuación 1) que describe una segunda orden de avance y de primer orden inverso, de un solo paso la interacción entre una especie y de los receptores de una sola especie de ligandos 1 :
donde K es una afinidad de unión del 2D efectiva, k es el de fuera de ritmo, m r e l m son los receptores respectivos y la densidad de ligando medido en el paso 4, y A c es el área de contacto. La curva de ajuste tiene dos parámetros, A c K a y de k, como una C y una K se agrupan y llamados colectivamente como la afinidad 2D eficaz. Su producto con el off-rate es la efectiva 2D en clase: A c = k en A c K a K x fuera.
La adhesión de frecuencia específica P a se calcula mediante la resta de la fracción de la adhesión no específica (P inespecífica) a partir de la adhesión total medido (P medido) 1,21:
8. Los resultados representativos:
Figura 1 Determinación de la integrina α β L 2 densidad de sitios en los neutrófilos. Los neutrófilos se incubaron primero con 1μg/ml de E-selectina-Ig de 10 minutos para que coincida con las condiciones experimentales utilizadas en las figuras 3,4 o sin la E-selectina-Ig, y luego, con concentraciones de saturación (10μg/ml) de PE-conjugado anti -CD11a humanos MAB (clon HI111, consulte la Tabla de determinadosreactivos y equipos) o ratón IgG1 irrelevante para el control, se lavan, y se analizó inmediatamente. Las muestras fueron leídas en el citómetro de flujo BD LSR con el estándar de bolas de calibración QuantiBRITE PE. El panel A muestra los histogramas de fluorescencia de bolas de calibración (rosa), junto con los de E-selectina-Ig células tratadas (color azul) o sin tratamiento (color verde). Específicas CD11a tinción AcM se muestra en las curvas sólidas e irrelevante tinción isotipo del anticuerpo de control se muestra en las curvas de puntos. Las células tratadas con E-selectina-Ig (presencia en todas las etapas de lavado y en tampón FACS) no afectó la densidad de CD11a como se ve desde la comparación con las células no tratadas. El panel B muestra el proceso de cuantificación de la densidad. Log10 se ha calculado para la media de intensidad de fluorescencia (FI) de cada valor máximo de cuatro bolas de calibración de los histogramas de Grupo A (círculos de color rosa) y por la gran cantidad de moléculas específicas-PE por bolas (del fabricante). Una regresión lineal de moléculas de Log10 PE por bolas contra Log10 fluoresccia se trazó. Por E-selectina células tratadas la Log10 FI (y) los valores de la igualdad de 3,99 (círculo de color azul) y 2,23 (círculo azul abierto) para el AcMo específico y el anticuerpo control, respectivly. Hemos resuelto la ecuación lineal de x (los valores se representan como círculos de color verde y azul en el panel B) x = Log10 PE / celular y, como PE:. AcM relación fue de 1:1, el número total de α β 2 L de neutrófilos fue calcula como 9587. Densidad de la superficie se calculó en 43 moléculas / m 2, con 8.4μm como el diámetro de neutrófilos 22. Densidad de ICAM-1 se midió de manera similar por cytometery de flujo utilizando PE-anti-CD54 humano MAB, lo que equivalía a 65 mol / m 2.
Figura 2 Micropipeta los diagramas del sistema. Nuestro sistema de micropipeta se reunió en la casa y se compone de tres subsistemas: el subsistema de formación de imágenes para permitir que uno observa, record y analizar los movimientos de la célula micropipeta de aspiración, un subsistema de micromanipulación para permitir una para seleccionar las celdas de la cámara de celular, y un subsistema de la presión para permitir que uno de aspirar las células en las micropipetas. La pieza central del subsistema de imagen tiene su microscopio invertido (Olympus IMT-2 IMT2), con una inmersión en aceite de 100x objetivo 1,25 NA. La imagen se envía a una grabadora de vídeo a través de un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD). Un contador de tiempo de video se acopla al sistema para mantener la noción del tiempo. Cada micropipeta puede ser manipulado por un accionamiento mecánico montado en el microscopio y finalmente coloca con un micromanipulador hidráulico de tres ejes. Manipuladores mecánicos de Newport podría ser utilizado también. Uno de los titulares de micropipeta se monta en un traductor piezoeléctrico, el conductor de la cual es controlada por un código de computadora LabView (bajo petición) y la traduce en señales a través de una tarjeta DAQ a través de un amplificador de voltaje (en casa) en el actuador piezoeléctrico. Este es unllows uno para mover la pipeta de precisión y repetible en un ciclo de prueba de adhesión. El subsistema de regulación de presión se utiliza para el control de aspiración durante el experimento. Una tubería hidráulica se conecta el titular micropipeta a un depósito de líquido. Un posicionador de mecánica fina permite que la altura del embalse que precisamente manipulada.
Micropipetas se generan con Kimax punto de fusión tubos de vidrio de borosilicato capilar (con diámetro exterior de 1,0 ± 0,07 mm y un diámetro interior de 0,7 ± 0,07 mm. En primer lugar, las micropipetas de tubos capilares se extraen utilizando PN-30 Extractor magnético Narishige 'microelectrodos de vidrio Horizontal (Sutter Instrumentos Micropipeta Extractor es otra opción de asistente de cámara). Segundo sistema, Microforge (construido en la casa) se utiliza para cortar las micropipetas para la apertura de tamaño deseado. Los modelos comerciales de los sistemas de Microforge están disponibles también.
Para evitar la vibración de las micropipetas durante el experimento, el microscope, junto con el micromanipulador, se coloca en una mesa de suspensión de aire.
Figura 3 Ejecución F adhesión frecuencia i específicos (A) e inespecíficos (B) que se une a 1s (rojo) y 10 (azul) mide los tiempos de contacto de los ciclos repetidos de adhesión de prueba entre los glóbulos rojos recubiertos con ICAM-1 (A) o Higg (B ) con los neutrófilos humanos que expresan la integrina α β L 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), donde i es el índice del ciclo de prueba, X i es igual a "1" (adherencia) o "0" (no adherencia). F n (n = 50) fue utilizado como la mejor estimación de la probabilidad de adherencia.
Figura 4 Cinética deICAM-1 a la integrina α β neutrófilos L 2 ( 
). Probabilidad de adherencia medido como se muestra en la Figura 3 para tres pares de células en cada tiempo de contacto promedio es y representa frente al tiempo de contacto. El medio de la cámara se HBSS con 1 mM de cada uno de Ca 2 + y Mg 2 +, además de 1μg/ml dimérica E-selectina-Ig para regular al alza β α L 2 vinculante. Para la captura de ICAM-1-Ig en los glóbulos rojos, un paso intermedio se añadió para la incubación de los glóbulos rojos con anticuerpos de captura 10μg/ml (biotinilado de cabra anti-Fc de anticuerpos humanos, eBioscience) después de la etapa de incubación estreptavidina. Para controlar la unión inespecífica dos condiciones se utilizaron diferentes: 1) los glóbulos rojos recubiertos con el anticuerpo de captura anti-humano-Fc y se incubaron con IgG humana en lugar de ICAM-1-Ig (O) y 2) los neutrófilos unión a los glóbulos rojos no cubiertas con la captura de anticuerpos (Δ). 10μg/ml IgG humana fue introducido en el medio para minimizar la unión de la E-Selectina-Ig en la solución a la captura de anticuerpos en la superficie de glóbulos rojos. La unión no específica registrada como la IgG humana curva de control se utilizó para obtener una curva de adherencia probabilidad específica (en 
) Usando la ecuación. 2. Montaje de adhesión específicas curva de probabilidad con la ecuación. 1 (línea continua) volvió afinidad de unión efectiva una K c a = 1,4 • 10 -4 μm4 y k off = 0.3 s -1.
| Reactivo | MW (g / mol) | Concentración (mM) | Cantidad (g) |
|---|---|---|---|
| Adenina | 135.13 | 2 | 0.27 |
| D-glucosa (dextrosa) | 180.16 | 110 | 19.82 |
| D-Manitol | 182.17 | 55 | 10.02 |
| Cloruro de sodio (NaCl) | 58.44 | 50 | 2.92 |
| El fosfato de sodio, dibásico (Na HPO ) | 141.95 | 20 | 2.84 |
| L-glutamina | 146.15 | 10 | 1.46 |
Tabla 1. Preparación EAS-45 buffer (1L).
| 25 mg de biotina-XHS en 550 l de DMF | 0,1 M biotina solución |
| Dilución de 1:10 de la biotina 0,1 w / DMF | 0,01 M biotina solución |
| Dilución 1:100 de 0,1 biotina w / DMF | 0,001 M biotina solución |
Tabla 2. Preparación de la solución de biotina.
| biotina concentración final (M) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Los glóbulos rojos de pellets de valores (l) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x PBS (l) | 179,2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176,8 |
| 0,1 M tampón de borato (l) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0,01 M biotina solución (l) | 1 | 2 | 3.2 | |||
| 0,001 M biotina solución (l) | 0.8 | 2 | 4 |
Tabla 3. Biotinilación de los glóbulos rojos.
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Discussion
Para utilizar con éxito la adhesión micropipeta ensayo de frecuencia se deben considerar varios pasos críticos. En primer lugar, asegúrese de registrar la interacción específica para el sistema de receptor-ligando de interés. Medidas no específicas de control (ver fig. 3, 4) garantizar la especificidad. Idealmente, las probabilidades no específicos de adhesión debe ser inferior a 0,05 para todas las duraciones de tiempo de contacto y tener una diferencia significativa entre las probabilidades de adhesión específicas y no específicas para cada momento. Diferentes métodos podrían ser utilizados para acoplar los ligandos a la superficie los glóbulos rojos. Se ha demostrado que el cloruro de cromo método de acoplamiento 17 dio un mayor nivel de la unión no específica de biotina-estreptavidina acoplamiento.
En segundo lugar, una probabilidad de adherencia para la interacción específica debe estar en el rango medio. Este requisito puede cumplirse mediante la variación de la densidad de receptores y ligandos (o ligandos sólo en los glóbulos rojos si los receptores se expresan constitutivamente en célulass la densidad de los cuales es difícil de cambiar). Para ello, cuando se prueba un nuevo sistema con desconocidos ligando-receptor afinidad de unión, preparar una serie de glóbulos rojos con biotina (véase la Tabla III como ejemplo) para probar una variedad de densidades de ligando. La probabilidad de adherencia en estado estable no debe ser superior a 0,8 en promedio, como la célula a célula del receptor de variación de la densidad por lo general trae el nivel de adhesión de algunas células a 1 si la densidad media ligando es demasiado alto. Durante las pruebas iniciales de la especificidad, si algunas células tienen niveles de adhesión de 0 o 1, la densidad de ligando necesita ser ajustado. Medidas de control no específicos suelen seguir las medidas específicas y aquí a uno le gustaría tener la probabilidad de adherencia lo más cerca posible a cero.
En tercer lugar, encontrar el intervalo correcto de los tiempos de contacto. Si el tiempo de contacto es suficiente la exp (- k fuera t) término de la ecuación. Uno llega a cero y la afinidad 2D efectiva puede ser calculada a partir del nivel de la mesetade la curva de adherencia 1: 
El k fuera de descuento sobre la tarifa que determina la fase de transición o qué tan rápido la curva de adherencia llega a un nivel de meseta. Para estimar la tasa fuera de la precisión requiere mediciones de varios puntos a un nivel de meseta, así como los puntos de tiempo suficiente en la fase de transición. Contabilización de los tres pasos críticos descritos anteriormente se obtendrán curvas de unión similar a la figura. 4.
La tarea pendiente es utilizar un modelo de receptor-ligando cinética de unión de interpretar la curva de medidas experimentalmente vinculantes y de estimación de parámetros cinéticos 2D de ajuste del modelo de predicción a los datos. Cabe señalar que la ecuación. 1 representa un modelo más simple de segundo orden hacia adelante, de primer orden inverso, de un solo paso, la cinética reversible entre un único ligando del receptor de las especies 1. Los procesos cinéticos más complejos se han descrito, incluso ºlos casos de doble e ligando del receptor de la misma especie 3,4, en dos etapas obligatorias sin 14 o con 19 interacciones trimolecular, y la cinética de una adherencia limitada por la formación del sitio activo en lugar de bonos cinética 10. En estos casos, los modelos matemáticos más involucrados están obligados a relacionar la probabilidad de adhesión frente a la curva de tiempo de contacto y la cinética de ligando de unión al receptor.
El interés sostenido en la cinética de la interacción receptor-ligando se deriva de la hipótesis fundamental de que los parámetros de la cinética de desempeñar un papel en la determinación de los eventos de señalización hacia abajo dentro de la célula. La adhesión micropipeta ensayo frecuencia se presenta aquí es uno de los pocos métodos que permiten realizar mediciones in situ de las dos dimensiones (2D) cinética de unión. Dos dimensiones significa que los dos receptores y ligandos en la superficie celular, como ocurre naturalmente en muchas interacciones célula-célula en el interior del organismo. Las constantes cinéticas 2D de los receptores de LIGy obligatorio proporcionar información para la rapidez con que las células se unen entre sí o con la matriz extracelular, el tiempo que permanecen vinculados, y cómo muchos bonos se forma. En comparación, en la resonancia de plasmones superficiales (SPR) método 23 una de las moléculas que interactúan en la fase líquida, por lo que llamó tres dimensiones (3D) de la unión. Debido a que tanto las moléculas que interactúan, son purificadas y aisladas del ambiente celular, los parámetros cinéticos obtenidos en la medición 3D podría ser drásticamente diferentes de los obtenidos en las mediciones en 2D incluso para el mismo receptor-ligando par 17.
El método de análisis de frecuencia de adhesión cinética 2D sobre la vida membrana celular y por lo tanto ofrece una oportunidad para que una de analizar las regulaciones biofísicas y bioquímicas del medio ambiente celular. Estos incluyen la membrana microtopology 5, anclaje de membrana 2, la orientación molecular y la longitud de 6, 9 y rigidez portador Curvatura 20, la fuerza de choque 20, y moduladores de la organización del citoesqueleto y la membrana donde las moléculas interactúan residen 15,17.
Debido a la unión cruzada del receptor-ligando interacción requiere contacto físico directo entre dos células y los resultados en la vinculación física entre dos células, la cinética de la reacción química de la interacción molecular puede ser analizada mediante un ensayo mecánico que pone en contacto las células y detecta por el efecto vinculante de la fuerza. A pesar de que ejemplifica el ensayo de adherencia con una frecuencia de RBC micropipeta de aspiración como un sensor de adhesión, otras técnicas de la fuerza se puede utilizar, incluyendo microscopía de fuerza atómica 24, biomembrana fuerza sonda 8,17, 25 pinzas ópticas, y la micropipeta integrado y en voladizo 26.
Otros ensayos mecánicos en 2D basado en se han desarrollado. Estos incluyen el ensayo de fluctuación térmica 8 de centrifugaciónción del ensayo 27,28, rosetas ensayo de 29, y el ensayo de cámara de flujo 30,31.
La limitación de la frecuencia de ensayo de adherencia es la lentitud y mucha mano de obra de la prueba debido a los repetidos ciclos de serie con un solo par de células de la prueba un contacto a la vez. Se hace difícil para las interacciones ligando-receptor con lento de las tasas por largos tiempos de contacto que se requeriría para la curva de unión para alcanzar el estado estacionario, por lo que el experimento inhibitively largo.
El transductor de fuerza construida por un RBC micropipeta de aspiración es capaz de detectar el nivel de picoNewton las fuerzas, que es un orden de magnitud menor que la resistencia típica de un covalente ligando-receptor de bonos 1,32. Sin embargo, ligando-receptor disociación puede ocurrir incluso en el cero fuerzas. Cualquier débil adhesión que se lleva sin ser detectado a una subestimación de la afinidad de unión y en la tarifa 1.
Tque el método de adhesión frecuencia se supone que cada prueba de adherencia es idéntica e independiente de los demás. Este requisito puede ser violada como se ha demostrado en algunos sistemas de 33 años, donde la adhesión actual de aumento o disminución de la probabilidad de que la adhesión al lado. El código de Matlab para comprobar si se cumple el requisito de la secuencia de los acontecimientos registrados adhesión está disponible bajo petición.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 y R01GM096187.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 Forthcoming.
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
