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Bioengineering

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

Published: July 25, 2012 doi: 10.3791/3520
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, Stanford University

Summary

En este artículo se describe el uso de pinzas magnéticas para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática a nivel sola molécula de una manera altamente paralelizable.

Abstract

La generación y detección de las fuerzas mecánicas es un aspecto omnipresente de la fisiología celular, con relación directa con la metástasis del cáncer 1, 2 y aterogénesis cicatrización de la herida 3. En cada uno de estos ejemplos, las células tanto de ejercer la fuerza de su entorno y al mismo tiempo enzimáticamente remodelación de la matriz extracelular (MEC). El efecto de las fuerzas de ECM se ha convertido en un área de considerable interés debido a su probable importancia biológica y médica 4-7.

Técnicas de una sola molécula, tales como la captura óptica 8, microscopía de fuerza atómica 9, y pinzas magnéticas 10,11 permitirá a los investigadores para probar la función de las enzimas a nivel molecular, al ejercer fuerzas sobre las proteínas individuales. De estas técnicas, pinzas magnéticas (MT) se caracterizan por su bajo costo y alto rendimiento. MT ejercen fuerzas en el rango de 1-100 ~ pN y puede proporcionar milisegundo resolución temporal,cualidades que son bien emparejados para el estudio del mecanismo de la enzima en el nivel de una sola molécula de 12. Aquí mostramos un ensayo altamente paralelizable MT para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis de las moléculas de proteínas individuales. Se presenta el ejemplo específico de la proteolisis de un péptido de colágeno trimérica por metaloproteinasas de matriz 1 (MMP-1), sin embargo, este ensayo se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sustratos y proteasas.

Protocol

1. Flujo de Preparación de la célula

  1. Cubreobjetos (# 1.5, 22x22 mm y 22x40 mm, VWR) se limpian con ultrasonidos.
    1. Añadir los cubreobjetos a un pequeño envase de cristal capaz de mantener cubreobjetos y equipamiento en el baño de ultrasonidos (ver paso 2).
    2. Llenar el recipiente con isopropanol y sonicar en un sonicador de baño durante 20 minutos.
    3. Deseche el isopropanol y lavar los cubreobjetos con grandes cantidades de agua desionizada producida por un aparato de Barnsted MilliQ o dispositivo similar. Llene el recipiente con agua y déjelos en remojo durante 20 minutos.
    4. Después de ultrasonidos, secar los cubreobjetos en una corriente de agua filtrada, libre de polvo del aire. Utilice sólo los que aparecen cubreobjetos limpio (es decir, sin manchas).
    5. Con cuidado la llama de los cubreobjetos durante unos segundos para limpiarlos de cualquier resto de polvo y la humedad: pasar los cubreobjetos a través de una llama de gas que se produce con un mechero Bunsen, teniendo cuidado de no deformar el cubreobjetos, debido al exceso de calor. Este paso elimina residual en la superficiecontaminantes.
  2. Utilizando cinta de doble cara adhesiva, fije los dos cubreobjetos juntos. Corte la cinta ~ 3 cm de longitud y 0,3 cm de ancho. Coloque la cinta sobre el cubreobjetos mm 22x40 dejando un canal cm 1,6 en el medio. Utilice una punta de pipeta para presionar suavemente sobre el cubreobjetos para asegurarse de que la cinta se ha adherido correctamente.

2. Configuración magnética Pinzas y Calibración

  1. Pinzas magnéticas eran de configuración usando permanentes imanes de tierras raras como se describió anteriormente 10,12. Un soporte de aluminio L-fue construido con un orificio de 1 mm de diámetro y montado sobre un eje vertical Z-traductor (Thorlabs) para modular la altura de las pinzas. Dos permanentes imanes de tierras raras se adjunta a la ménsula a cada lado de la estenopeica para crear la trampa magnética (Figura 1).
  2. Preparación de ADN: ADN de fago lambda marcado en su extremo 5 'y 3' termina con biotina y digoxigenina (IDT ADN, San Diego, CA) se utiliza para calibrar la magnitudpinzas de genética.
    1. Mezclar 50 l de 4 nM λ-DNA con 2 l de 40 nM biotina oligonucleótido conjugado y se calienta a 60 ° C durante 10 minutos. Luego enfriar lentamente a temperatura ambiente durante 1 hora.
    2. Añadir ADN ligasa de acuerdo con las especificaciones del fabricante y ligar a temperatura ambiente durante 3 horas.
    3. Añadir 2 l de 400 nM oligonucleótido digoxigenina conjugado e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos.
    4. Añadir 1,5 l de 10 mM de ATP y continuar ligación del oligonucleótido conjugado con digoxigenina a la λ-DNA durante 3 horas.
    5. Retire el exceso de los oligonucleótidos y la ADN ligasa con 100 filtros de espín kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un total de intercambio de tampón de 1000 veces en buffer TE es suficiente para eliminar el exceso de los oligos. Nota: Es importante no utilizar velocidades de centrifugado> 500xG porque va a llevar a la rotura del ADN.
    6. Examinar una muestra del ADN mediante electroforesis en un gel de agarosa 0,7% para asegurar que el ADN is no desnaturalizado o cortadoras.
    7. Medir la concentración de ADN. El uso de un Nanodrop UV-Vis espectrómetro (Thermo Scientific) se recomienda ya que el volumen de muestra disponible puede ser muy pequeña.
  3. Prepare las celdas de flujo como se describe en la sección 1.
  4. Para la fijación del ADN a la celda de flujo, añadir anticuerpos anti-digoxigenina (IgG de oveja; 1 mg ml -1; Roche Bioscience, Manheim, Alemania) y permitir que se adhieren a la superficie de vidrio durante 15 minutos.
  5. Pasivar la superficie de la celda de flujo para evitar que se pegue no específica de ADN mediante la adición de 2 mg ml -1 de BSA, 0,1% de Tween-20 en PBS 1x. Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos.
  6. Repita el paso 2.5.
  7. Añadir 50 pM de fuctionalized λ-DNA y permiten asociar al cubreobjetos durante 15 minutos.
  8. Eliminar el exceso de ADN con 1x PBS.
  9. Añadir streptavidina revestida de piedras superparamagnéticas (1 cuentas micras = 2 mg ml -1; 2,8 micras cuentas = 20 mg ml -1
  10. Eliminar el exceso de cuentas con 1x PBS.
  11. La calibración magnética Pinzas
    1. Mueva los imanes permanentes a una posición que está lejos de la superficie de la muestra (> 15 mm).
    2. Colocar la celda de flujo preparada en el microscopio.
    3. Mueva los imanes permanentes en su posición por encima de la celda de flujo.
    4. Elegir el plano focal de cuentas de ADN λ-funcionalizados, centrándose en las cuentas de distancia de las dos superficies de vidrio. El plano focal correcta es aquella en la que las perlas deseadas tienen un centro brillante.
    5. Tome un video de movimiento cordón a 80 Hz o superior a 500 marcos.
    6. Mueva el imán más cerca de la superficie de la muestra. Para distancias más allá de 5 mm, se mueven en incrementos de 1 mm. Para distancias de entre 1 y 5 mm, se mueven en incrementos de 0,5 mm. Para distancias de menos de 1 mm, se mueven en incrementos de 0,25 mm.
    7. Repita los pasos 2.11.5 y 2.11.6 en cada posición del imán nuevo.
    8. Para cada conjunto de datosestablecido, rastrear el centro de las perlas usando un ajuste 2D gaussiana.
    9. Calcular la fuerza a través de las fluctuaciones browniano con:

    Ecuación 1
    donde k B T es la energía térmica de Boltzmann, L es la longitud de λ-DNA, y <x 2> es la variación en la posición centroide.

    1. Confirmar la exactitud de las fuerzas comprobando el cálculo de la fuerza a través de un espectro de ajuste de potencia de Lorentzian con el fin de encontrar la frecuencia de corte. Fuerza aplicada está relacionada con la frecuencia de corte por la relación:

    Ecuación 2
    Cuando 0 ƒ es la frecuencia de corte, uno es el radio de talón, y μ es la viscosidad del fluido 12.

3. El colágeno péptido adjunto a las celdas de flujo

A fin de proporcionar un ejemplo concreto de aplicación de nuestra metodología, se describen los trabajos recientes en nuestro laboratorio que caracteriza a la proteolisis de un péptido de colágeno modelo trimérica. Creemos que este enfoque general se puede aplicar ampliamente a otras proteínas y polinucleótidos.

  1. El péptido modelo colágeno consta de un N-terminal de 6x Su etiqueta para la purificación, seguido por una etiqueta 5x myc, (CPE) 10 para hacer cumplir la formación de triple hélice, el colágeno a1 residuos 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), que forman la MMP- 1 sitio de reconocimiento, la secuencia foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), y un KKCK C-terminal para facilitar el etiquetado con biotina-maleimida. Foldon deriva de la proteína fibritin T4-fago, y se estabiliza trímeros de colágeno del modelo cuando se fusiona en cualquiera de la N - o C-terminal 13,14.
  2. El péptido de colágeno y proteínas MMP-1 se expresa y se purificó como se describió anteriormente 4,15. </ Li>
  3. Añadir anti-myc (15 mg ml -1) a la celda de flujo y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que el anti-myc para sujetar a la superficie de la celda de flujo.
  4. Pasivar la celda de flujo para evitar fijación no específica de proteínas utilizando 5 mg mL -1 de BSA en la misma forma como se describe en el paso 2,5.
  5. Añadir 150 péptido de colágeno pM y permitir que se conecte al anticuerpo a través de la etiqueta myc durante 45 minutos.
  6. Eliminar el exceso de colágeno utilizando tampón PBS.
  7. Añadir cuentas de streptavidin cubierto superparamagnéticas (1 cuentas micras = 2 mg ml -1 y 2,8 micras cuentas = 20 mg ml -1) y permitir que se adhieren a las moléculas de colágeno durante 45 minutos. Las perlas de 1 micras debe diluirse a la concentración deseada en PBS. Las perlas de 3 micras debe ser separado de la solución utilizando imanes fuertes, entonces resolubilizado en PBS. Este proceso debe ser repetido 3 veces. Nos dimos cuenta de que este paso es esencial para GEt las perlas 3 micras para unirse a la superficie inmovilizada péptido de colágeno.

4. Equipo de ensayo proteólisis

  1. Una vez que la celda de flujo se ensambla con el péptido de colágeno y perlas magnéticas, la imagen de la celda de flujo magnético en la trampa bajo bajo, ~ 1 fuerza pN. En nuestra experiencia, una subpoblación de las perlas es a veces débilmente adherido a la superficie en una forma no específica. La aplicación de la fuerza modesta asegura que estas perlas son liberados.
  2. Añadir enzima activa a la celda de flujo. En este caso MMP-1 fue pre-activadas mediante la adición de 3,5 mM de APMA (4-aminofenilmercúrico acetato) y se incubaron a 37 ° C durante 3 horas. La activación se verificó mediante SDS-PAGE.
  3. Tan pronto como la celda de flujo se vuelve a introducir en el aparato magnético pinzas, grabar un vídeo que abarca unos pocos campos de vista, dando típicamente varios cientos de perlas adjuntos. Esto será t = 0.
  4. Repita el mismo proceso de grabación de varios campos de la vista (cuando regresaba to el mismo campo de visión) en los puntos regulares de tiempo, hasta que todas las cuentas de separar o no la proteólisis adicional es discernible.
  5. Análisis de datos cinéticos
    1. Contar los granos en los diversos campos de la vista en momentos diferentes y un promedio de ellos. Normalizar el número de cuentas dividiendo el número medio de bolas en cada momento por el número de perlas en el instante t = 0. Esto asegura que podamos comparar las tasas de la proteólisis de distintos experimentos, debido a que el número absoluto de cuentas será diferente de experimento a experimento.
    2. Trazar la relación como una función del tiempo. En este caso, se ajustaba a un decaimiento exponencial más una constante.

    Ecuación 3
    donde f (t) es la relación de las perlas unidas (o moléculas de colágeno unproteolyzed), t es el tiempo, una es la fracción de perlas unidas por una correa de sujeción colágeno, b es la tasa constante de desintegración, y ces la fracción de perlas que están unidos no específicamente.

    1. El mismo experimento se repitió en diferentes concentraciones y fuerza de MMP-1 para dilucidar el efecto de la fuerza en la proteólisis de colágeno por la MMP-1.

5. Los resultados representativos

El protocolo anterior describe un nuevo uso de pinzas magnéticas (Figura 1) para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática. Hemos calibrado las pinzas para 1 y 3 micras perlas micras utilizando tanto la magnitud de las fluctuaciones observadas browniano y el cálculo de la frecuencia de corte en las posiciones del imán diferentes (Figura 2). En los experimentos de fuerza proteolisis, la configuración es similar, excepto que el ADN se sustituye con colágeno (Figuras 3, 4). El número normalizado de perlas restantes se pueden representar como función del tiempo para encontrar las tasas de proteolisis (Figura 5), y este proceso puede serrepite para diferentes concentraciones de la enzima y las fuerzas.

Figura 1
Figura 1. Esquemática del proceso de calibración trampa magnética (no a escala). Dos imanes permanentes de tierras raras crear un campo magnético que tira de la superparamagnético talón. Traducir el imán hacia arriba y abajo se ajusta la fuerza aplicada. Las cuentas se visualizan con un brillante convencional microscopio de campo con la luz que pasa a través de un agujero entre los dos imanes Recuadro:. Imagen tomada con un objetivo de 40x de aire. Los puntos cortantes, redondos corresponden a las perlas unidas a la superficie cubreobjetos. Los objetos fuera de foco son cuentas separadas.

Figura 2
Figura 2. Los gráficos de la fuerza calibrada como una función de la distancia del imán de la superficie de la muestra durante 1 micras (izquierda) y 2.8 micras (derecha) de talóns. Los datos se ajustaron a la función empírica Equation4 , Donde x es la distancia desde el imán. Una = 31,8, b = 5,61, y c = 4,39 para las perlas de 1 micras y con una = 140, b = 3,10 y c = 1,86 para los 3 perlas de micras. Estos valores son específicos para nuestro instrumento específico y la geometría experimental, y cada instrumento debe ser calibrado individualmente. Las barras de error en cada punto representa una variabilidad ~ 10% en la fuerza aplicada sobre un talón a base de bolas, debido a la variabilidad en el tamaño de talón. La fuerza aplicada es proporcional al volumen de las perlas, y el volumen de bolas varía ~ 9% con respecto a la media (de acuerdo con las especificaciones del fabricante).

Figura 3
Figura 3. Proteólisis Fuerza ensayo de la instalación (no a escala). El trímero modelo colágeno está unido a la superficie del cubreobjetos a través de myc / conjugación de anti-myc. Las perlas superparamagnéticas estreptavidina-revestidas se adjunta a los trímeros de colágeno a través de un enlace biotina-estreptavidina. Activada la MMP-1 corta el colágeno a través del tiempo, provocando que las perlas se desprenden de la superficie y se alejan del plano focal.

Figura 4
Figura 4. Dibujos animados esquemática de la proteolisis como una función del tiempo. La caricatura muestra un campo de muestra de vista con el tiempo, se produce la proteólisis. Con el tiempo, la MMP-1 cortes de colágeno y las perlas de la separe y se alejan del plano focal bajo la influencia del campo magnético.

Figura 5
Las tasas de la Figura 5. Proteólisis dependerá de la fuerza aplicada 16. Se muestran los datos recogidos en el 1,0 pN (3 mM MMP-1, el negro), 6,2 pN (3 mM MMP-1, roja) y 13 pN (0,2 mM MMP-1, magoNTA). Las tasas de proteólisis (parámetros de ajuste) son los siguientes: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min-1 (6,2 PN), y 2,08 ± 0,18 min-1 (13 PN). La fracción de perlas unproteolyzed en puntos de tiempo largos (> 15 minutos) se mantiene aproximadamente constante a través de ~ 0,25 experimentos diferentes. Las barras de error corresponden a la estadística de Poisson que refleja el número de observaciones en cada momento. El error en cada punto de tiempo para perlas n es n 1/2. El error en la fracción de perlas unidas se calculó por error propagation.1 perlas micras fueron utilizados para experimentos y 1,0 pN 6.2 pN y 2,8 micras perlas fueron utilizados para experimentos pN 13.

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Discussion

Este protocolo se describe un nuevo uso para una sola molécula técnica clásica. Pinzas magnéticas permiten a medio y alto rendimiento de los ensayos de una sola molécula de una manera costo-eficiente. Sin embargo, como todas las técnicas experimentales que hay desafíos y peligros potenciales.

Limitaciones de pinzas magnéticas

En comparación con una trampa óptica de la resolución espacial y temporal de un aparato de TA es baja. Por otra parte, las fuerzas generadas por el MT simple descrito aquí son 30 pN o menos, mucho menos que las fuerzas de forma rutinaria accede en experimentos de AFM. Esta limitación puede ser una virtud: MT son muy adecuadas para la aplicación de sub-pN fuerzas.

A diferencia de una trampa óptica o AFM, MT convencional, tal como el aparato de aquí, no permiten la manipulación de las partículas individuales. Trampas ópticas se utilizan generalmente para aplicar una fuerza paralela a la cubreobjetos, mientras que MT está mejor adaptado para los experimentos verticales de tracción. Electromagnétic MT frente a estas limitaciones, aunque a costa de mayor complejidad.

Pinza de calibración

Tanto la fluctuación browniano y el análisis del espectro de potencia para la calibración de la fuerza tienen sus limitaciones. Hemos encontrado que el método de fluctuación browniano es particularmente sensible a la borrosidad de la cámara. Como la velocidad de fotogramas mayor (tiempo de exposición menor) calcula la fuerza disminuida. En la práctica, hemos aumentado la velocidad de fotogramas hasta que las fuerzas calculadas a partir de las fluctuaciones browniano de acuerdo con las fuerzas calculadas utilizando el espectro de potencia de un 10%. Por el contrario, el análisis del espectro de potencia es más robusto frente a la cámara borroso, pero un poco más difícil de implementar. Se recomienda realizar ambos cálculos para comprobar la robustez de los resultados.

Observamos que las variaciones en tamaño de las perlas y el resultado magnético contenido de partículas en las variaciones en la fuerza aplicada de ~ 10%. Este efecto no fue importante en nuestra reciente experimento esporque nosotros promedio a lo largo de cientos de cuentas en cada medición. Sin embargo, los experimentos que extraen la información única de cada cordón atado podría obligar a un método de calibración más exacta.

Controles para asegurar los archivos adjuntos de un solo punto

El logro específicos, orientados a un solo punto de los archivos adjuntos es a menudo un reto en la práctica en los estudios de una sola molécula. Los siguientes controles confirmó fijación específica de colágeno al anticuerpo, y perlas a colágeno:

  1. Añadido perlas sólo a una celda de flujo pasivado con BSA.
  2. Añadido anti-myc, cuentas pasivadas con BSA y añadió a continuación.
  3. Añadido anti-myc, pasivado con BSA, añadió no biotinilado colágeno y después se añadió perlas.
  4. Pasivado con BSA, añadió no biotinilado colágeno y perlas entonces añadidos.
  5. Pasivado con BSA, añadió colágeno biotina y los granos y sumarse.
  6. Añadido anti-myc, pasivado con BSA, añadió biotinaylated colágeno y cuentas luego se suman.

En los casos 1-5, donde se omitió algún componente de la serie adjunto deliberadamente, en cualquier lugar de 0 a 4 perlas se ve unida a la célula de flujo por el campo de visión (80.000 m 2). Sólo en el caso 6, donde todos los restos de unión están presentes, vimos del ~ 30-60 micras y 2,8 perlas 80-200 micras 1 perlas unidas a la superficie. La cinética de proteolisis observada se ajustan adecuadamente por una sola exponencial más un término constante, lo que sugiere fuertemente que sólo hay un paso limitante, y por lo tanto, sólo una correa única. El término constante probablemente refleja perlas que no son específicamente unido al cubreobjetos.

Se presentan las concentraciones de anticuerpos y proteínas que trabajan para nuestro experimento. Una amplia gama de concentraciones de cada componente debe ser examinado en el desarrollo de un nuevo ensayo. BSA funcionado bien como un agente de pasivación superficial en nuestro experimento. Sin embargo, este conocidoHod puede no funcionar en todas las circunstancias. Otros protocolos para la pasivación superficial se han utilizado también con éxito. Los ejemplos incluyen polietilenglicol funcionalizados 17 portaobjetos de vidrio, con el apoyo bicapas lipídicas 18, o caseína como un agente de bloqueo.

Notas sobre el análisis de datos

En los experimentos de la proteólisis de la fuerza, siempre hay algún desprendimiento no específica (especialmente a altas fuerzas de 19) debido a la disociación de la no-covalentes (por ejemplo, biotina - estreptavidina) interacciones. Damos cuenta de este fenómeno mediante la medición de la proteolisis en diferentes concentraciones de MMP-1, incluyendo no MMP-1, como se describe en Adhikari et al. al. proteólisis de medición en diferentes concentraciones de MMP-1 para todas las fuerzas que nos permite generar curvas de Michaelis-Menten, donde se utilizan para calcular la eficiencia catalítica k cat / K M de la enzima. Alternativamente, si varias concentraciones de la enzima no se utilizan, se recomienda queuna medición de control hacerse sin enzima a las fuerzas dadas a restar de la tasa de desprendimiento no específica.

Las aplicaciones potenciales

Las pinzas magnéticas cubren un rango de fuerza de ancho. Las fuerzas que pueden ser ejercidas dependerá del tamaño de las perlas. 1 micras y 2.8 micras cuentas se superponen en las fuerzas accesibles, y en nuestra experiencia, utilizando cualquiera de las cuentas a las fuerzas intermedias funciona bien.

Anticipamos que semejantes aproximaciones experimentales pueden ser de aplicación general en el estudio de la proteolisis dependiente de la fuerza 4,20, 21 y se desarrolla interacciones de unión 22. Nosotros y otros 23 han observado que el radio de los anillos de difracción por fuera de las perlas de enfoque proporciona un medio sensible para el seguimiento de la posición relativa del talón al cubreobjetos 23. Aunque generalmente no se utiliza en esta manera, creemos que los ensayos de MT tienen la capacidad de proporcionar precisión nanométrica AMUMAurements de la dinámica de proteínas estructurales. Esta información adicional puede ser particularmente valiosa en el contexto de la fuerza dependiente de la proteolisis o mediciones de unión.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el premio a la Trayectoria Burroughs Wellcome en la interfaz de la Ciencia (ARD), los Institutos Nacionales de Salud a través de Nuevo Director del NIH Programa Premio a la Innovación 1-DP2-OD007078 (ARD), el William Bowes, Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), y el Instituto Cardiovascular de Stanford beca predoctoral Joven (JC). Los autores agradecen a James Spudich por el préstamo de equipos de microscopía.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Cover Glass #1.5 (22x22) VWR 48366-067
Micro Cover Glass #1.5 (22x40) VWR 48393-048
Lambda DNA Invitrogen 25250-010
T4 DNA Ligase Invitrogen 15224-041
Microcon Ultracel YM-100 Millipore 42413
Anti-Digoxigenin Roche Diagnostics 11-333-089-001
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Anti-myc Antibody Invitrogen 46-0603
Bovine Serum Albumin Sigma B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin Invitrogen 658.01D
p-Aminophenylmercuric Acetate Calbiochem 164610
Biotin-Maleimide Sigma Aldrich B1267
Biotin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Digoxigenin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Collagen peptide gene DNA 2.0 Custom synthesis
MMP-1 cDNA Harvard Plasmid Database
z-translator Thorlabs MTS50
Servo controller for translator Thorlabs TDC001

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References

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