Summary
نماذج لغزو الخلايا السرطانية في ثلاثي الأبعاد المصفوفة خارج الخلية تعكس على نحو أفضل
Abstract
ومن الخصائص المميزة للخباثة السرطان هو الغزو والانبثاث 1. في بعض أنواع السرطان (ه ز. دبقي 2) ، والغزو المحلية في الأنسجة السليمة المحيطة هي السبب الجذري للمرض والموت. لأنواع أخرى من السرطان (ه ز. الثدي والرئة ، الخ.) ، فإنه هو عملية الانبثاث ، والتي تحرك الخلايا السرطانية من الورم الرئيسي الشامل ، استعمار المواقع البعيدة وتساهم في نهاية المطاف إلى فشل الجهاز ، الذي يؤدي في النهاية إلى الإصابة بالأمراض و 3 وفيات. وقد قدر أن الغزو والانبثاث هي المسؤولة عن 90 ٪ من الوفيات الناجمة عن السرطان 4. نتيجة لذلك ، كان هناك اهتمام كبير في تحديد العمليات الجزيئية وسطاء البروتين حرجة من الغزو والانبثاث لأغراض التشخيص والعلاج وتحسين 5.
وثمة تحد للعلماء السرطان هو تطوير المقايسات الغزو الذي يشابه الوضع بما فيه الكفاية في الجسم الحيلتمكين دقة النمذجة المرض 6. ثنائي الأبعاد المقايسات حركية الخلية ليست سوى بالمعلومات عن جانب واحد من الغزو ولا تأخذ في الاعتبار إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية البروتين (ECM) التي هي أيضا عنصرا حاسما. في الآونة الأخيرة ، وقد صقلت الأبحاث فهمنا لغزو الخلايا السرطانية وكشف ان الخلايا الفردية قد تحرك من جانب وسائط مستطيلة أو مستديرة 7. بالإضافة إلى ذلك ، كان هناك مزيد من التقدير لمساهمة الغزو الجماعي ، التي تغزو الخلايا في صحائف ، وفروع ومجموعات ، وخصوصا في الأورام المتباينة للغاية التي تحافظ على الخصائص الظهارية ، إلى انتشار مرض السرطان 8.
نقدم اتباع أسلوب دقيق 9 لدراسة مساهمات من البروتينات المرشحة لغزو الجماعي 10. ولا سيما عن طريق الهندسة حمامات منفصلة للتعبير عن خلايا البروتينات الفلورية مختلفة ، فمن الممكن أن تشريح جزيئيا الأنشطة وproteiنانوثانية المطلوبة في الخلايا مما يؤدي مقابل تلك المطلوبة في الخلايا التالية. استخدام رني يوفر أداة لتفكيك الجزيئية تجريبيا العمليات التي ينطوي عليها غزو الخلايا الفردية ، وكذلك في مواقع مختلفة من الغزو الجماعي. في هذا الإجراء ، هي خليط من الخلايا مطلي fluorescently التي تحمل علامات على الجزء السفلي من ادخال Transwell شغلها سابقا مع البروتين ECM Matrigel ، ثم سمح لغزو "صعودا" من خلال تصفية والى Matrigel. إعادة بناء مداخن صورة ض السلسلة ، التي حصلت عليها مبائر التصوير ، إلى ثلاثة الابعاد تتيح للتمثيلات تصور جماعي فروع الغازية وتحليل تمثيل الخلايا fluorescently ذات العلامات الرائدة في مقابل المواقف التالية.
Protocol
1. فيروسات توسيم الخلايا مع البروتينات الفلورية
- لوحة الخلايا التغليف فيروسات (مثل فينيكس) من الخلايا عند 0.25 س 6 10 لكل بئر من 6 جيدا طبق في مصل بقري جنيني 10 ٪ (FBS) / DMEM.
- Transfect خلايا الحمض النووي مع فيروسات 48 ساعة في وقت لاحق باستخدام الخلايا Effectene وفقا لتعليمات الصانعين.
- شطف الآبار مرتين مع 24 ساعة في وقت لاحق متوسطة ، ثم يضاف 1.5 مل من 10 ٪ FBS / DMEM لكل بئر.
- جمع الفيروس حزم في زراعة الأنسجة المتوسط 48 ساعة في وقت لاحق من قبل pipetting ونقل إلى 2 مل أنابيب microcentrifuge.
- الطرد المركزي في 1600 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق إلى أي خلايا بيليه.
- طاف لإزالة أنبوب تنظيف وتخزين في -80 درجة مئوية.
- ومطلي الخلايا المراد بها في transduced retrovirally 1.5 × 5 10 خلايا لكل بئر من صحن 6 جيدا وتوضع في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- في اليوم التالي ، وإزالة وسائل الإعلام من الخلايا والإعلانيةد 1 مل من مخزون فيروس تستكمل مع 4 polybrene ميكروليتر (2 ملغ / مل) على كل بئر. استبدال لوحات في الحاضنة.
- بعد حضانة لمدة 5-6 ساعات ، إضافة 2 مل 10 ٪ FBS / DMEM لكل جيدا ويتم استبدال لوحات في 37 درجة مئوية inbubator بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي ، تحل محل وسائل الاعلام والسماح للخلايا قبل 24 ساعة من وسائل الاعلام مضيفا انتقائية مناسبة.
- عندما متموجة (التي تعتمد على معدل نمو الخلايا ، وكفاءة تنبيغ فيروسات ، ولكن عادة ما يستغرق 4-14 أيام) ، يعرض للتريبسين الخلايا والفرز لاستخدام الخلايا مضان غير transduced كمرجع ، وجمع وتجمع مع خلايا مضان أكبر من غير transduced الخلايا وتجميد aliquots في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
2. معكوس مقايسة Matrigel الغزو
- ذوبان الجليد ببطء وجود قسامة من Matrigel كاملة (أي التي تحتوي على عوامل النمو) على الجليد (الشكل 1A).
- مرة واحدة تفقد تجميدها ، وتمييع Matrigel 01:01 الجليد الباردة في برنامج تلفزيوني (جنبا إلى جنب مع أي إضافية أخرىالعلاجات في تركيز 2X في برنامج تلفزيوني قبل التخفيف. الشكل 1B). لجعله أسهل للتعامل مع Matrigel قبل البلمرة ، وكلها ينبغي أن بلستيكور (نصائح على سبيل المثال ، والأنابيب ، الخ) تكون باردة الجليد.
- كما تضاف Transwells على النحو المطلوب كثير المسام 6.5 ميكرون 8 مم غير المصقول في الآبار لمدة 24 جيدا نسيج لوحة الثقافة ، ثم ماصة بعناية 100 ميكروليتر من Matrigel المخفف في الآبار وترك لاحتضان لدقائق في 30 ~ 37 درجة مئوية إلى ترسيخ (الشكل 1C).
- خلال هذا الوقت ، وإعداد واحد أو أكثر fluorescently المسمى تعليق على الخلية بين 1 إلى 4 × 5 10 خلايا لكل لتر ، اعتمادا على خط الخليوي ، من كل شرط مسبق لمعاملة (ه ز. سيرنا العلاج بالمخدرات) في نموها الطبيعي المتوسطة (1D الشكل).
- عندما وطدت Matrigel ، عكس Transwells 100 ميكروليتر وماصة للتعليق على الخلية السفلى التي تواجه التصاعدي للمرشح (الشكل 1E).
- تغطية بعناية Transwells مع قاعدة جيدة نسيج 24لوحة الثقافة ، وإجراء اتصالات مع كل قطرة من تعليق الخلية (الشكل 1F).
- احتضان لوحة المقلوب في الدولة لمدة 4 ساعات للسماح للمرفق الخلية (الشكل 1G).
- بعد هذا الوقت ، وتحويل لوحات الجانب الأيمن المتابعة وتغسل كل Transwell بواسطة غمس متسلسلة في 2 × 1 مل مصل المتوسطة مجانا (الشكل 2A).
- ترك Transwells في ثالث يتضمن أيضا أية عقاقير أو العلاجات المطلوبة (2B الشكل).
- ماصة بلطف 100 ميكرولتر من 10 ٪ FBS / DMEM زائد جاذب كيميائي (EGF. ه ز ب 25 نانوغرام / مل) في Transwell على رأس Matrigel طدت / PBS الخليط ، واستبدال الغطاء واحتضان لمدة 3-5 أيام عند 37 درجة C مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2 (الشكل 2C).
3. التلوين والتصوير
- يمكن التعبير عن الخلايا البروتينات الفلورية تخطي الخطوات التالية قبل المجهري مبائر
- إلى خلايا غير الفلورسنت الصورة الغازية Transwells Matrigel المكان ، في 24 الأطباق الطازجة جيدا وماصة 1 مل من 4 ميكرومترCalcein AM الحل وصمة عار على رأس كل المكونات Matrigel ، مما يسمح له بالتأثير على الجانبين ، وصمة عار من أعلى وأسفل. Calcein صباحا (استر acetoxymethyl من calcein) هو صبغ الخلايا الحية التي البقع الخضراء الخلايا بأكملها ويتطلب أي تثبيت.
- احتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2 ترطيب الجو ، في الخلايا التي هي نقطة الملون بالكامل وجاهزة للتصوير بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
- بدلا من ذلك ، قد تكون ثابتة غير الفلورسنت غزو الخلايا Matrigel والملون كما هو موضح أدناه في 3،5-3،9.
- نقل كل لوحة Transwell 24 الطازجة جيدا. تراكب 1 مل من 4 ٪ para-formaldehyde/0.2 ٪ تريتون - X 100.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة عن 0.5 ساعة.
- إزالة تثبيتي ، ويغسل 3 مرات مع PBS 1 مل.
- إزالة الحمض النووي الريبي حشوية مع 30 دقيقة باستخدام العلاج ريبونوكلياز 100 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز. غسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة لرؤية التأيد Propidium 0.01 ملغ / مل (PI) المخفف في برنامج تلفزيوني وترك في درجة حرارة الغرفة في داكايزرسلوترن عن 0.5 ساعة. يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. في هذه المرحلة ، ملطخة PI يمكن الاحتفاظ transwell في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة لا تقل عن 1 في الشهر.
- أساليب التصوير المجهري الدقيق بواسطة مبائر تعتمد على الموارد المتاحة. باستخدام المجهر المقلوب مبائر ، Transwell مكان مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني المتبقية على ساترة كبيرة (ضمان عدم وجود فقاعات موجودة) على عدم الانغماس الهدف X 20 والقبض على كل المقاطع البصرية 10-15 ميكرون من أسفل قابس matrigel. ويمكن استخدام شرائح ضوئية فردية لقياس مدى الغزو (الشكل 3A) أو لبناء 3 الابعاد في الكائنات باستخدام البرمجيات المناسبة مثل Volocity (الشكل 3B).
4. ممثل النتائج
ويرد مثال على Z - سلسلة من الشرائح الضوئية في الشكل 3A. في هذا المثال ، تم صبغ الخلايا مع AM Calcein ويمكن رؤية عدد من الخلايا الغازية من تصفية ما يصل إلى التناقص مع المسافة. الكمي للفيويمكن أن يتم عن طريق تحليل vasion نسبة Calcein AM بكسل بكسل إيجابية سلبية في كل فاصل زمني ، أو باستخدام طريقة التثبيت / تلطيخ المفصلة أعلاه والفرز PI النوى إيجابية في كل موقف. ميزة واحدة من Calcein AM تلطيخ يمكن تجميعها هو أن إعادة بناء 3 الابعاد لغزو الخلايا باستخدام برامج مثل Volocity ، مما يعطي التصوير المرئي واسطة لغزو (الشكل 3B). إذا وصفت من قبل خلايا التعبير عن البروتينات الفلورية ، ثم يمكن للمواقف كل خلية اللون يمكن تصور في 3 الابعاد اعادة البناء والتي تعتبر إما من الجانب (الشكل 3C) أو عن طريق جعل شرائح من خلال إعادة الإعمار (الشكل 3D).
الشكل 1. رسم تخطيطي من الخطوات المتبعة في وضع معكوس مقايسة الغزو. أ) Matrigel ECM إذابة على الجليد. ب) يتم تخفيف Matrigel 01:01 برنامج تلفزيوني مع أي العلاجات التي تحتوي على المخدرات في التركيز النهائي مرتين. C) يتم وضعها في لوحات إدراج Transwell multiwell وMatrigel pipetted في كل منهما. D) أدلى تعليق خلية في التركيز المطلوب. E) وبمجرد أن وضعت Matrigel ، هو مقلوب لوحة وإزالتها ، ومطلي الخلايا على تصفية السفلي من إدراج Transwell. F) في موقف مقلوب ، وضعت بعناية لوحة متعدد الطبقات على إدراج Transwell ، وإجراء اتصالات مع التعليق الخلية. G) ويسمح للخلايا التمسك التصفية لمدة 4 ساعات.
الشكل 2. مواصلة الرسم التخطيطي للمقايسة غزو العكسية. أ) عندما انضمت الخلايا ، وتراجع في كل Transwell المصل خالية من وسائل الإعلام مرتين لإزالة الخلايا فضفاضة. ب) يغسل مكان Transwell الى نهائي يتضمن كذلك وسائل الإعلام بالإضافة إلى العلاج كما هو مطلوب. والطبقات بعناية C) وسائل الإعلام التي تحتوي على جاذب كيميائي (10 ٪ الجنين مثل المصل البقري) مع العلاجات على النحو المطلوب Matrigel.
الشكل 3. صور الممثل نتائج الفحص غزو العكسية. أ) من الخلايا الضوئية المقاطع ملطخة Calcein AM Matrigel الغازية ، التي اتخذت في 15 ميكرومتر فترات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ب) إعادة الإعمار من 3 الابعاد لغزو خلية من كومة من الصور Z - سلسلة مبائر ، ينظر إليها من الجانب. طبع من مرجع 10. C) ثلاثي الأبعاد للخلايا GFP التعمير وصفت RFP - غزو Matrigel ينظر إليها من الجانب. D) شريحة بصرية من خلال إعادة الإعمار 3 الأبعاد للخلايا وGFP RFP المسمى. طبع من مرجع 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقليديا المقايسات غزو Matrigel إعداد مع الخلايا يوضع فوقه طبقة من البروتين المصفوفة خارج الخلية مع جاذب كيميائي بفعل حركية وصوب من خلال مرشح في القاع. وسجل الغزو بوصفها وظيفة من عدد الخلايا يمكن أن تحسب على الجانب السفلي من التصفية. بالرغم من وجود فارق كبير من الناحية العملية مع "معكوس" مقايسة الغزو المذكورة أعلاه ، هناك معلومات أكثر بكثير عن عملية الغزو التي يمكن تحديدها من خلال وضع تصور لأنها تغزو خلايا تتحرك صعودا وخلال Matrigel. على سبيل المثال ، بالإضافة إلى كونه قادرا على تصور مختلف الخلايا المسمى لدراسة رائدة مقابل التالية الخلايا في الغزو الجماعي (الشكل 3C و 3D) ، باستخدام هذا الأسلوب يسمح لخلايا تكون ثابتة ، permeabilized ملون وتصوير ثم لمستويات البروتين أو التوزيع التحت خلوية . سيكون محدودا السلطة حل لهذه الطريقة من قبل خط الأساس كثافة إشارة يتألقNT البروتين معربا عن الخلايا وحساسية جهاز التصوير ، وخصوصا اذا لونين أو أكثر كان لا بد من تصويره. Matrigel الاختلاط الكولاجين (DQ) صبغ مروي (والذي هو ذلك مترافق مع فلوريسئين بشدة أن تطفئ إشارة الفلورسنت حتى التحلل البروتيني يفصل شظايا الكولاجين وبالتالي تخفيض تركيز فلوريسئين المحلية والسماح مضان) هو تطبيق آخر متعدد الألوان لهذا الأسلوب من شأنه أن السماح لتصور تدهور ECM بغزوها الخلايا. وباستخدام أجهزة فحص عالية المحتوى مزودة مبائر التصوير وغرف بيئية تمكن من أن يتحول هذا الإجراء إلى 4 د في الوقت الحقيقي مقايسة الغزو ، والتي يمكن أيضا أن المضاعفة مع تدابير إضافية مثل تدهور ECM. جنبا إلى جنب مع الأتمتة ، وسيكون من الممكن أيضا لتصميم عالية خلية القاعدة الإنتاجية المقايسات التي يمكن استخدامها للكشف عن أهداف المكتبات الكيميائية المضادة للغزو الرواية.
وهناك عدد من العوامل شولد يمكن التحكم بدقة عند استخدام هذا الاختبار غزو العكسية. يمكن أن كثافة الخلية يؤثر على كفاءة واضحة لغزو ، ولذلك يجب استخدام عدد متساو من الخلايا في كل تكرار. قد العلاجات التي يغير عدد الخلايا (ه ز. العقاقير السامة للخلايا) ويبدو أن تغيير مدى الغزو ، ولكنها قد تعكس أيضا هذا التأثير كثافة الخلية. على الرغم من أن العديد من خطوط الخلايا تعمل بشكل جيد في هذا الاختبار ، لا تغزو جميع جيدا بما يكفي لتكون مفيدة ، ولذا يجب أن يتم تقييم كل على أساس كل حالة على حدة. يجب أن يكون طول الفترة الزمنية المطلوبة لتحقيق مستوى من الغزو كافية لتوفير إطار يحدد تجريبيا اشارة جيدة لكل خط الخلية ، ونجمة داود الحمراء ميغابايت 231 خط خلية تعمل بشكل جيد على بعد 4 أيام من بدء الفحص ، على سبيل المثال. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون بعض من الشروط المقترحة (على سبيل المثال مسام ميكرون 8 حجم يدرج Transwell) لا تتناسب مع كل خط الخليوي ، وربما تكون هناك حاجة بعض التحسين. قيمة إضافية مستمدة من هذا الأسلوب بالمقارنة مع مستوى Matrigel غزو مقايسة مأك من المفيد إنشاء مختبر في أي مهتمة جديا في دراسة العمليات التي ينطوي عليها 3 - D الغزو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
التمويل لهذا البحث من معهد أبحاث السرطان في المملكة المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO, by Life Technologies | 21969 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO, by Life Technologies | 25050-032 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| 6.5mm Transwells, 8.0 μm pore size | Corning | 3422 | |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 | |
| RNase | Qiagen | 19101 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Confocal microcope | Leica Microsystems | SP2MP |
References
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment. J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The Hallmarks of Cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Croft, D. R., Olson, M. F. Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement. Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).
- Wolf, K. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).
- Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. Fos-transformation activates genes associated with invasion. Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).
- Scott, R. W. LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).
