Summary
成三维的细胞外基质肿瘤细胞的侵袭模型更好地反映
Abstract
一个定义特征是癌症的恶性肿瘤侵袭和转移1。在某些癌症（E. 克 。胶质瘤2），局部浸润到周围的健康组织的疾病和死亡的根源。其他癌症（E. 克 。乳腺癌，肺癌等 ），它是在转移过程中，肿瘤细胞从原发肿瘤的质量，殖民远端站点，并最终有助于器官功能衰竭，最终导致发病率和死亡率3。据估计，侵袭和转移是负责90％的癌症死亡 4 。因此，有浓厚的兴趣，提高诊断和治疗5的目的确定的分子过程，侵袭和转移的关键蛋白质调解员。
癌症科学家面临的一个挑战是要发展入侵检测， 充分类似于在体内的情况启用准确的疾病建模 6 。二维细胞活力检测信息约一个入侵方面，并没有考虑到帐户外基质（ECM）蛋白的重塑，这也是一个关键因素。最近，研究完善我们了解肿瘤细胞的侵袭，并透露，单个细胞的移动拉长或圆形模式 7 。此外，有更大的集体入侵的贡献表示赞赏，特别是在高度分化的肿瘤，维持上皮细胞的特点，使细胞股，床单和集群入侵 ，8癌症的蔓延。
我们目前的候选蛋白的研究贡献的集体入侵10改进后的方法9。特别是在单独池工程细胞表达不同的荧光蛋白，它是分子剖析的活动和proteiNS需要在领导与那些需要在以下细胞的细胞。使用的RNAi实验拆卸单个细胞的侵袭，以及在不同岗位的集体入侵所涉及的过程提供了分子工具。在此过程中，荧光标记的细胞的混合物镀以前与基质胶流脑蛋白填补了Transwell小插入底部，然后让其通过过滤器进入基质胶入侵的“向上”。 Z系列的形象栈，通过共聚焦成像到三维表示，重建允许集体入侵链分析和荧光标记的细胞，在领导与以下职位的任职可视化。
Protocol
1。逆转录病毒荧光蛋白标记的细胞
- 板逆转录病毒包装细胞（ 如凤凰卫视）出0.25 × 10 6细胞，一个6孔，每孔 菜在10％胎牛血清（FBS）/ DMEM培养液。
- 使用逆转录病毒DNA转染细胞48小时后细胞Effectene根据制造商的指示。
- 培养24小时冲洗井两次后，再加入1.5毫升10％FBS /每口井的DMEM。
- 收集包装病毒在组织培养中等48小时后吹打，并转移至2 mL离心管。
- 在每分钟1600转离心5分钟沉淀的任何细胞。
- 删除上清到一个干净的试管和存储于-80 ° C。
- 细胞retrovirally转镀在1.5 × 10 5细胞，每孔6井的菜，在培养箱放置在37℃过夜。
- 第二天，取出细胞和广告媒体D 1毫升辅以4μL聚凝胺（2毫克/毫升），每孔的病毒存货。在孵化器板更换。
- 5-6小时的潜伏期后，加入2 ml 10％胎牛血清/ DMEM培养液，每孔和板块都在37 ° C inbubator一夜之间更换。
- 第二天，更换介质，并让细胞前24小时，加入适当的选择性培养基。
- 当融合（这取决于细胞的生长率，逆转录病毒转导效率，但通常需要4-14天），trypsinize作为参考荧光非转导细胞的细胞和排序，收集和池细胞荧光大于非细胞和冻结在-80等分° C的将来使用。
2。逆基质胶侵袭实验
- 慢慢解冻一个完整的基质胶冰（图1A）（即含生长因子）等分。
- 一旦解冻，淡化基质胶1:1（连同任何其他附加在冰冷的PBS在治疗前的2倍浓度稀释在PBS;图1B）。为了使更容易聚合前的基质胶处理，所有的塑料制品（如提示，管等），应该是冰冷的。
- 插入许多8微米孔径6.5毫米直径的无涂层Transwells成井24孔细胞培养板所需，然后小心地移液100μL稀释基质胶入井，并在37〜30分钟离开° C到巩固（图1C）。
- 在此期间，准备一个或多个荧光标记的细胞悬液，1到4 × 10 5个细胞每毫升取决于细胞系，从每个前处理条件（E.克的siRNA药物治疗）。，在其正常生长中（图1D）。
- 当基质胶已固化，到过滤器（图1E）向上面临的底面反转Transwells和加入100μL的细胞悬液。
- 小心地盖上24孔组织的基础Transwells培养板中，每个细胞悬液（图1F）液滴接触。
- 4小时孵育板在倒立的状态，让细胞附着（图1G）。
- 这个时候，打开右侧板和每个Transwell小到2 × 1毫升血清培养基（图2A）连续浸渍清洗。
- 留在一个含有任何药物或治疗所需的三分之一（图2B）Transwells。
- 轻轻移液器（E. 25毫微克/毫升的克。表皮生长因子）到100μl10％FBS / DMEM培养液加趋化的凝固的基质胶/ PBS混合物顶部Transwell小，更换3-5天盖和孵化，在37 ° C的5％的CO 2（图2C）。
3。染色和可视化
- 细胞表达荧光蛋白可以跳过下面的步骤之前，共聚焦显微镜
- 对图像的非荧光的细胞入侵24以及新的菜肴和加入1毫升4微米基质胶，地方Transwells钙黄绿素AM每个基质胶插头上的污渍的解决方案，允许它波及两侧和污点从顶部和底部。钙黄绿素AM（钙黄绿素acetoxymethyl酯）是一个活细胞染料，绿色，污渍整个细胞，无需固定。
- 孵育1小时，在37℃，5％CO2饱和湿度，此时细胞完全染色，共聚焦显微镜成像。
- 另外，可能是固定的，非荧光细胞侵入基质胶染色描述在3.5以下3.9。
- 每个Transwell小转移到一个新的24孔板。覆盖1 4％para-formaldehyde/0.2％的Triton X - 100毫升。
- 室温孵育0.5小时。
- 取出固定液，用1 ml PBS洗3次。
- 删除30分钟用100微克/毫升核糖核酸的核糖核酸酶处理的细胞质RNA。用PBS洗2次。
- 用于可视化添加0.01 mg / ml的碘化丙啶（PI）的PBS稀释，并在室温下离开中DARK为0.5小时。用PBS洗3次。在这个阶段，PI染色Transwell小，可在保持室温在黑暗中至少有1个月。
- 共聚焦显微镜的精确成像方法取决于可用资源。使用与残余PBS的少量非浸泡20 ×目标和捕捉光的部分从底部的基质胶插头每10-15微米（确保无气泡存在）到大盖玻片倒置共聚焦显微镜，Transwell小的地方。个人光片可用于量化入侵的程度（图3A），或建立相应的软件使用，如Volocity（图3B）到3维对象。
4。代表性的成果
如图3A所示的光学切片Z系列的一个例子。在这种情况下，细胞与钙黄绿素上午染色和细胞入侵的过滤器的数量可以看出，随着距离的减少。量化在vasion可以通过分析钙黄绿素的比例，我在每个时间间隔，或使用上面详细的固定/染色法和计数在每个位置PI阳性细胞核的负面像素的积极像素。钙黄绿素的优势之一AM染色细胞浸润，三维重建，可装配使用，如Volocity软件，给人一种视觉描绘的入侵模式（图3B）。如果细胞是由荧光蛋白的表达标记，然后每种颜色的单元格的位置可以进行可视化三维重建，无论是从侧面（图3C），或通过重建（图3D）片观看。
图1。设立反入侵检测所涉及的步骤示意图。一）基质胶流脑在冰上解冻。 B）基质胶含有任何药物治疗，终浓度的两倍，用PBS稀释为1:1。三） Transwell小插入多孔板放入，基质胶吸管到每个。 D）细胞悬液制成所需浓度。 E）的基质胶一旦成立，该板块倒置和删除，细胞被镀上Transwell小插入底部过滤器。 F）在倒转位置，中空板是经过精心放置在Transwell小插入，使细胞悬液接触。 G）的细胞是可以坚持4个小时的过滤器。
图2。继续反入侵检测的原理图。 a）一旦细胞坚持到无血清培养基，浸每个Transwell小两次，以去除松散的细胞。 b）将洗到最后的媒体以及含有加治疗Transwell小。 c）媒体趋化因子（如10％胎牛血清）的治疗需要时，仔细分层到基质胶。
图3。逆侵袭实验结果的代表性的图像。一）与钙黄绿素染色细胞的光学部分AM入侵基质胶，共聚焦显微镜在15微米间隔。二）重建三维重建一叠焦Z系列图像，从侧面看一个细胞浸润。转载自参考文献10。三）GFP和RFP标记的入侵，从侧面观看的基质胶细胞的三维重建。 D）光片通过GFP和RFP标记的细胞三维重建。转载自参考文献10。
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Discussion
基质胶侵袭实验历来设立细胞到细胞外基质蛋白与趋化因子诱导的蠕动层对通过底部的过滤器放在。侵袭得分多少细胞可以在过滤器的底面计算的函数。虽然实际上有以上所述的“逆”入侵检测的差别不大，有相当多的入侵过程中，可以通过可视化入侵的细胞，因为他们通过基质胶和确定的信息。例如，除了能够看到不同的标记细胞研究领导与集体入侵细胞（图3C和3D），使用这种方法使细胞固定，透，染色和蛋白水平或亚细胞分布，然后成像。这种方法的分辨能力将是有限的基线的荧光信号强度NT蛋白表达细胞成像仪器的灵敏度，特别是如果两个或更多的颜色进行成像。染料淬火（DQ）的胶原蛋白（这是如此严重，直到水解胶原蛋白片段分开，从而降低当地的荧光素浓度和允许荧光的荧光信号被淬灭的荧光共轭）的混合基质胶是另一种方法，将多色彩应用允许侵入细胞ECM降解的可视化。装有共焦成像和环境试验箱使用高内涵筛选设备，将使此过程中，要转变成4 - D的实时入侵检测，也可与额外措施，如ECM降解复。与自动化相结合，它也将有可能以设计高通量细胞为基础的，可以用来检测屏幕为新型抗入侵目标化学库。
一些因素SH应小心控制，当使用这种反入侵检测。细胞密度影响明显的入侵效率，使细胞的数目相等，应在每个复制使用。治疗方法，从而改变细胞数（细胞毒性药物E.克。）可能会出现改变了入侵的程度，但可能也反映了这一细胞密度的影响。虽然众多的细胞株的工作以及在这个实验中，并非所有的入侵以及足够的有用的，所以每个人都应该在逐案的基础上进行评估。应经验确定，实现了足够的入侵提供一个良好的信号窗口的水平所需的时间长度，每个细胞株，MDA MB 231细胞株在实验开始后的4天工作得很好，例如，。此外，一些建议（例如，8微米的孔径Transwell小插入）的条件可能不适合每一个细胞株，并可能需要一定的优化。这种方法产生的额外价值时相比，标准基质胶侵袭实验米AKE是值得认真研究在3 - D入侵所涉及的过程有兴趣的实验室建立。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
资助这项研究是由英国癌症研究中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO, by Life Technologies | 21969 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO, by Life Technologies | 25050-032 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| 6.5mm Transwells, 8.0 μm pore size | Corning | 3422 | |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 | |
| RNase | Qiagen | 19101 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Confocal microcope | Leica Microsystems | SP2MP |
References
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