Summary
Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij de
Abstract
Een kenmerkende eigenschap van kanker maligniteit is invasie en metastase 1. In sommige kankers (e. g. Glioma 2), locale invasie in het omringende gezonde weefsel is de oorzaak van ziekte en dood. Voor andere vormen van kanker (e. g. Borstkanker, longkanker, enz..), Het is het proces van metastase, waarbij tumorcellen zich van een primaire tumor massa, koloniseren distale sites en uiteindelijk bij te dragen tot orgaanfalen, dat leidt uiteindelijk tot morbiditeit en sterfte 3. Er wordt geschat dat de invasie en metastasen zijn verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen door kanker 4. Als gevolg hiervan, is er intense belangstelling voor het identificeren van de moleculaire processen en kritische eiwit bemiddelaars van invasie en metastasering ten behoeve van verbetering van de diagnose en de behandeling 5.
Een uitdaging voor kanker wetenschappers is het ontwikkelen van invasie assays die voldoende lijken op de in vivo situatieom nauwkeurige ziekte modelleren 6 mogelijk te maken. Twee-dimensionale celbeweeglijkheid tests zijn louter informatief over een aspect van invasie en geen rekening houden met de extracellulaire matrix (ECM) eiwit remodeling, die ook is een cruciaal element. Onlangs heeft onderzoek verfijnd ons begrip van tumorcel invasie en toonde aan dat individuele cellen kunnen verplaatsen door lange of bolvormige modes 7. Daarnaast is er een grotere waardering van de bijdrage van collectieve invasie, waarbij de cellen binnen te dringen in strengen, lakens en clusters, met name in zeer gedifferentieerde tumoren die te behouden epitheliale kenmerken, om de verspreiding van kanker 8.
We presenteren een verfijnde methode 9 voor de behandeling van de bijdragen van kandidaat-eiwitten op collectieve invasie 10. In het bijzonder, door engineering aparte zwembaden van cellen om verschillende fluorescerende eiwitten te drukken, is het mogelijk om moleculair ontleden de activiteiten en proteins nodig in het leiden van cellen ten opzichte van die welke vereist zijn in de volgende cellen. Het gebruik van RNAi biedt de moleculaire tool om experimenteel te demonteren de processen die betrokken zijn bij individuele cel invasie alsook in verschillende posities van de collectieve invasie. In deze procedure, mengsels van fluorescent gelabelde cellen worden uitgeplaat op de bodem van een Transwell insert eerder gevuld met Matrigel ECM-eiwit, daarna liet men het "omhoog" binnen te dringen door het filter en in de Matrigel. Reconstructie van z-series image stacks, verkregen door confocale beeldvorming, in drie-dimensionale representaties zorgt voor visualisatie van collectief invasie strengen en de analyse van de representatie van de fluorescent gelabelde cellen in toonaangevende versus volgende posities.
Protocol
1. Retrovirale labeling van cellen met fluorescente eiwitten
- Plaat retrovirale verpakking cellen (bv. Phoenix) uit op 0,25 x 10 6 cellen per putje van een 6-well schotel in 10% foetaal bovine serum (FBS) / DMEM.
- Transfecteren cellen met retrovirale DNA 48 uur later cellen met behulp van Effectene volgens de instructies van de fabrikant.
- Spoel twee keer putten later met medium 24 uur, voeg vervolgens 1,5 ml van 10% FBS / DMEM per well.
- Verzamel verpakt virus in weefselkweek medium 48 uur later door pipetteren en het overdragen tot en met 2 mL microcentrifugebuizen.
- Centrifugeer bij 1600 rpm gedurende 5 minuten tot pellet alle cellen.
- Verwijder supernatant een schoon buisje en bewaar bij -80 ° C.
- Cellen retrovirally worden getransduceerd worden uitgeplaat op 1,5 x 10 5 cellen per putje van een 6 goed schotel en geplaatst in een bevochtigde incubator bij 37 ° C gedurende de nacht.
- De volgende dag, verwijder de media uit de cellen en ad-d 1 ml van het virus voorraad aangevuld met 4 ul polybreen (2 mg / ml) aan elk putje. Vervang de platen in de broedstoof.
- Na incubatie gedurende 5-6 uur, voeg 2 ml 10% FBS / DMEM aan elk putje en platen worden vervangen in de 37 ° C inbubator 's nachts.
- De volgende dag, vervang dan de media en laat cellen 24 uur voor het toevoegen van geschikte selectieve media.
- Bij de samenvloeiing (die afhankelijk is van de groei van de cellen, en efficiëntie van de retrovirale transductie, maar meestal neemt van 4-14 dagen), cellen en sorteren trypsinize voor fluorescentie met behulp van niet-getransduceerde cellen als een referentie, te verzamelen en zwembad cellen met fluorescentie groter is dan de niet-getransduceerde cellen en vries porties bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
2. Inverse Matrigel invasie assay
- Langzaam ontdooien een portie van volledige Matrigel (dwz met groeifactoren) op ijs (Figuur 1A).
- Eenmaal ontdooid, verdunnen Matrigel 01:01 in ijskoud PBS (samen met eventuele andere extrabehandelingen op 2x concentratie in het PBS voorafgaand aan verdunning; figuur 1B). Om het makkelijker te hanteren Matrigel voor polymerisatie, alle plasticware (bv tips, buizen, enz.) moeten ijskoud worden.
- Steek zoveel 8 micron porie 6,5 ongecoat mm diameter Transwells zoals vereist in de putjes van een 24 goed weefselkweek plaat, dan voorzichtig pipet 100 ul van de verdunde Matrigel in de putten en laat het gedurende ~ 30 minuten incuberen bij 37 ° C te stollen (Figuur 1C).
- Gedurende deze tijd, bereiden een of meer fluorescent gelabelde celsuspensies tussen 1 en 4 x 10 5 cellen per ml, afhankelijk van de cellijn, van elk voorbehandeld voorwaarde (g e.. SiRNA, behandeling met geneesmiddelen) in hun normale groei medium (figuur 1D).
- Wanneer de Matrigel gestold is, draai de Transwells en pipet 100 pi van de celsuspensie op het naar boven gericht zijn onderkant van de filter (figuur 1E).
- Voorzichtig dekking van de Transwells met de basis van een 24 goed tissuecultuur plaat, contact maken met elke druppel celsuspensie (Figuur 1F).
- Incubeer de plaat in de omgekeerde toestand voor 4 uur mogelijk te maken celhechting (figuur 1G).
- Naar aanleiding van deze tijd, draai de platen rechts-side-up en was iedere Transwell door opeenvolgende dompelen in 2 x 1 ml serum vrij medium (figuur 2A).
- Laat de Transwells in een derde goed in met alle medicijnen of behandelingen vereist (figuur 2B).
- Voorzichtig 100 ul van 10% FBS / DMEM plus chemoattractant pipet (e. g. EFG op 25 ng / ml) in de Transwell op de top van de gestolde Matrigel / PBS mengsel, vervang het deksel en incubeer gedurende 3-5 dagen bij 37 ° C met 5% CO 2 (figuur 2C).
3. Vlekken en visualisatie
- Cellen die fluorescerende eiwitten kunnen overslaan de onderstaande stappen voorafgaand aan de confocale microscopie
- Om het beeld niet-fluorescerende cellen binnen te vallen Matrigel, plaats Transwells in verse 24 goed gerechten en pipet 1 ml van 4 uMCalceïne AM vlek oplossing op de top van elke Matrigel plug, waardoor het overtollige water over de zijkanten en van de boven-en onderkant vlek. Calceïne AM (acetoxymethyl ester van calceïne) is een levende cellen kleurstof die vlekken het hele cellen groen en vereist geen fixatie.
- Incubeer 1 uur bij 37 ° C in 5% CO 2 vochtige atmosfeer, op welk moment cellen zijn volledig gekleurd en klaar om te worden afgebeeld door de confocale microscopie.
- Als alternatief kunnen niet-fluorescerende cellen binnen te vallen Matrigel worden gefixeerd en gekleurd zoals hieronder beschreven in +3,5 tot +3,9.
- Breng elke Transwell om een nieuwe 24-well plaat. Overlay 1 ml van 4% para-formaldehyde/0.2% Triton-X 100.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 0,5 uur.
- Verwijder fixatief en was 3 keer met 1 ml PBS.
- Verwijder cytoplasmatisch RNA met 30 min RNase behandeling met behulp van 100 ug / ml RNase. Was twee keer met PBS.
- Voor visualisatie toe te voegen 0,01 mg / ml propidiumjodide (PI) verdund in PBS en laat bij kamertemperatuur in de dark voor 0,5 uur. Was drie keer met PBS. In dit stadium, PI-lood transwell kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur in het donker gedurende ten minste 1 maand.
- Nauwkeurige beeldvormende technieken door confocale microscopie zijn afhankelijk van de beschikbare middelen. Met behulp van een omgekeerde confocale microscoop, plaats Transwell met een kleine hoeveelheid van de resterende PBS op groot dekglaasje (Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn) ten opzichte van niet-immersie 20 X doelstelling en vastleggen optische secties om de 10-15 urn van de bodem van de Matrigel stekker. Afzonderlijke optische schijven kunnen worden gebruikt om de mate van invasie (figuur 3A) kwantificeren of te bouwen in 3-dimensionale objecten met behulp van geschikte software zoals Volocity (Figuur 3B).
4. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van een Z-serie van optische schijfjes is weergegeven in figuur 3A. In dit geval werden de cellen gekleurd met Calceïne AM en het aantal cellen uit de filter binnenvallende is te zien dat af met de afstand. Kwantificering van de invasion kan worden gedaan door analyse van de verhouding van Calceïne AM positieve pixels naar negatief pixels bij elk interval, of door gebruik te maken van de fixatie / kleuringsmethode hierboven beschreven en het tellen van PI positieve kernen op elke positie. Een voordeel van Calceïne AM kleuring is dat de drie-dimensionale reconstructies van celinvasie kunnen worden geassembleerd met behulp van software zoals Volocity, het geven van een visuele voorstelling van de wijze van invasie (Figuur 3B). Als cellen worden gelabeld door expressie van fluorescerende eiwitten, dan is de positie van elke kleur cel kan gevisualiseerd worden in 3-dimensionale reconstructies, zowel bekeken van de zijkant (Figuur 3C) of door het maken van plakjes door de reconstructie (Figuur 3D).
Figuur 1. Schematische weergave van de stappen die betrokken zijn bij het opzetten van omgekeerde invasie test. A) Matrigel ECM ontdooide op ijs. B) Matrigel wordt verdund 1:1 met PBS dat elke behandeling met geneesmiddelen op twee keer een eindconcentratie. C) Transwell inserts worden geplaatst in multiwell platen, en Matrigel gepipetteerd in elk. D) celsuspensies gemaakt op de gewenste concentratie. E) Als de Matrigel heeft ingesteld, de plaat is omgekeerd en verwijderd, worden de cellen uitgeplaat op de onderkant filter van de Transwell inserts. F) In de omgekeerde positie, is de meerwandige plaat voorzichtig geplaatst over Transwell inserts, contact maken met de celsuspensie. G) De cellen mogen zich te houden aan het filter voor 4 uur.
Figuur 2. Voortzetting van het schema voor de inverse invasie test. A) Als cellen hebben gehandeld, duik iedere Transwell in serum-vrij medium tweemaal op losse cellen te verwijderen. B) Plaats gewassen Transwell in een definitieve goed bevattende media plus behandelingen nodig. C) Media met chemoattractant (bijv. 10% foetaal bovine serum) met behandelingen zoals vereist wordt zorgvuldig gelaagd op Matrigel.
Figuur 3. Representatieve beelden van de resultaten van inverse invasie assay. A) Optische delen van cellen gekleurd met Calceïne AM binnenvallende Matrigel, genomen op 15 um periodiek door confocale microscopie. B) Reconstructie van een 3-dimensionale reconstructie van cel invasie van een stapel van confocale Z-serie beelden, gezien vanaf de zijkant. Overgenomen uit referentie 10. C) Drie-dimensionale reconstructie van GFP en RFP-gelabelde cellen binnenvallen Matrigel gezien vanaf de zijkant. D) Optische slice door de 3-dimensionale reconstructie van GFP en RFP-gemerkte cellen. Overgenomen uit referentie 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matrigel invasie assays zijn van oudsher opgezet met cellen geplaatst op een laag van extracellulaire matrix eiwit met chemoattractant geïnduceerde beweeglijkheid naar en door een filter aan de onderkant. Invasiviteit werd gescoord als een functie van het aantal cellen kunnen worden geteld aan de onderkant van het filter. Hoewel praktisch is er weinig verschil met de "inverse" invasie assay hierboven beschreven, is er aanzienlijk meer informatie over het proces van invasie die kan worden bepaald door het visualiseren van binnendringende cellen als ze naar boven en door de Matrigel. Bijvoorbeeld, in Naast de mogelijkheid om anders gelabelde cellen te visualiseren aan toonaangevende versus volgende cellen in collectieve invasie (Figuur 3C en 3D), het gebruik van deze methode te onderzoeken laat cellen vast te stellen, gepermeabiliseerde, gekleurd en daarna gescand voor eiwit niveaus of subcellulaire distributie . Het oplossend vermogen van deze methode zou worden beperkt door de basislijn signaal intensiteit van de fluorescerennt eiwit tot expressie brengen en de gevoeligheid van de beeldvormende apparatuur, vooral als twee of meer kleuren zouden worden afgebeeld. Het mengen van Matrigel met kleurstof-gehard (DQ), collageen (dat is zo zwaar geconjugeerd met fluoresceïne dat de fluorescerende signaal is gedoofd tot proteolyse scheidt collageen fragmenten daarmee het verlagen van de lokale fluoresceïne concentratie en het toelaat fluorescentie) is een multi-color toepassing van deze methode zou zorgen voor visualisatie van ECM afbraak door binnendringende cellen. Met behulp van hoge-content screening apparaten uitgerust met een confocale beeldvorming en klimaatkamers staat zou stellen deze procedure worden omgezet in een 4-D real-time invasie test, die ook zou kunnen worden multiplexed met aanvullende maatregelen, zoals ECM degradatie. In combinatie met automatisering, zou het ook mogelijk zijn om high throughput cel-gebaseerde testen die kunnen worden gebruikt om chemische bibliotheken scherm voor nieuwe anti-invasie targets design.
Een aantal factoren shOuld zorgvuldig gecontroleerd worden bij het gebruik van deze omgekeerde invasie test. Celdichtheid kan invloed hebben op de schijnbare efficiëntie van de invasie, zodat een gelijk aantal cellen moet worden gebruikt in elke repliceren. Behandelingen die celaantal (e. g. Cytotoxische drugs) veranderen kunnen verschijnen om de omvang van de invasie te veranderen, maar kan ook weerspiegelen deze celdichtheid beïnvloeden. Hoewel tal van cellijnen werken goed in deze test, niet alle binnenvallen goed genoeg om bruikbaar te zijn, dus elke moeten worden geëvalueerd op een case-by-case basis. De lengte van de tijd die nodig is tot een niveau van invasie voldoende om een goed signaal venster te bieden te bereiken, moeten empirisch worden bepaald voor elke cellijn, de MDA MB 231-cellijn goed werkt op 4 dagen na het begin van de test, bijvoorbeeld. Daarnaast kunnen een aantal van de voorgestelde voorwaarden (bijv. 8 micron poriegrootte voor Transwell inserts) niet geschikt voor elke cellijn, en sommige optimalisatie kan noodzakelijk zijn. De extra waarde afgeleid van deze methode in vergelijking met de standaard Matrigel invasie test make het de moeite waard op enigerlei laboratorium serieus geïnteresseerd in het bestuderen van de processen die betrokken zijn in 3-D invasie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De financiering voor dit onderzoek is van Cancer Research Verenigd Koninkrijk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO, by Life Technologies | 21969 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO, by Life Technologies | 25050-032 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| 6.5mm Transwells, 8.0 μm pore size | Corning | 3422 | |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 | |
| RNase | Qiagen | 19101 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Confocal microcope | Leica Microsystems | SP2MP |
References
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment. J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The Hallmarks of Cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Croft, D. R., Olson, M. F. Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement. Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).
- Wolf, K. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).
- Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. Fos-transformation activates genes associated with invasion. Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).
- Scott, R. W. LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).
