Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Modellering och Imaging 3-dimensionell Kollektiv Cell Invasion

Published: December 7, 2011 doi: 10.3791/3525

Summary

Modeller av tumörcellen invasion till tredimensionella extracellulära matrix bättre återspegla

Abstract

Ett kännetecken för cancer malignitet invasion och metastasering 1. I vissa cancerformer (e. g. Gliom 2), lokal invasion till omgivande frisk vävnad är den grundläggande orsaken till sjukdom och död. För andra cancerformer (e. g. Bröst-, lung, osv.) Är det processen att metastaser, där tumörceller flytta från en primärtumör massa, kolonisera distala platser och i slutändan bidra till organsvikt, som leder så småningom till sjuklighet och dödlighet 3. Det har uppskattats att invasion och metastasering svarar för 90% av dödsfall i cancer 4. Som ett resultat har det varit intensivt intresse för att identifiera de molekylära processerna och kritiska medlare protein invasion och metastasering i syfte att förbättra diagnos och behandling 5.

En utmaning för cancer forskare är att utveckla invasion analyser som är tillräckligt liknar in vivo situationenatt möjliggöra noggrann sjukdom modellering 6. Tvådimensionella cell motilitet analyser är bara informativt om en aspekt av invasion och inte tar hänsyn till extracellulära matrix (ECM) protein ombyggnad som också är ett viktigt inslag. Nyligen har forskning förfinat vår förståelse av tumörcellen invasion och visade att enskilda celler kan gå med avlånga eller runda lägen 7. Dessutom har det funnits en större förståelse för bidrag av kollektiva invasion, där cellerna invaderar i trådar, lakan och kluster, särskilt i högt differentierade tumörer som upprätthåller epiteliala egenskaper, spridning av cancer 8.

Vi presenterar en förfinad metod 9 för att pröva bidrag kandidaten proteiner till kollektiva invasionen 10. I synnerhet genom tekniska separata pooler av celler för att uttrycka olika fluorescerande proteiner, är det möjligt att molekylärt dissekera verksamhet och proteins krävs i ledande celler jämfört med de som krävs i följande celler. Användningen av RNAi ger molekylära verktyg för att experimentellt isär processer i enskilda celler invasion samt i olika positioner av kollektiva invasion. I detta förfarande är blandningar av fluorescerande-märkta celler pläterade på botten av en Transwell in tidigare fylld med Matrigel ECM protein, sedan får invadera "uppåt" genom filtret och in i Matrigel. Rekonstruktion av Z-serien bilden stackar, som erhållits genom konfokala bildhantering, till tredimensionella representationer möjliggör visualisering av kollektivt invadera trådar och analys av representation av fluorescerande-märkta celler i ledande kontra följande befattningar.

Protocol

1. Retroviral märkning av celler med fluorescerande proteiner

  1. Tavla retroviral förpackningar celler (t.ex. Phoenix) ute på 0,25 x 10 6 celler per brunn på en 6-väl skålen i 10% fetalt bovint serum (FBS) / DMEM.
  2. Transfektera celler med retrovirus DNA 48 timmar senare celler med Effectene enligt tillverkarens instruktioner.
  3. Skölj brunnar två gånger med medelhög 24 timmar senare, tillsätt sedan 1,5 ml 10% FBS / DMEM per brunn.
  4. Samla förpackade virus i vävnaden odlingsmedium 48 timmar senare genom att pipettera och överföra till 2 tuber mL mikrocentrifug.
  5. Centrifugera vid 1600 rpm i 5 min till pellets några celler.
  6. Ta bort supernatanten till ett rent rör och förvara vid -80 ° C.
  7. Celler som skall retrovirally transduced är pläterade ut vid 1,5 x 10 5 celler per brunn på en 6 väl skålen och placeras i en fuktig inkubator vid 37 ° C över natten.
  8. Nästa dag, ta bort materialet från cellerna och add 1 ml av virus lager kompletterat med 4 l polybrene (2 mg / ml) i varje brunn. Byt ut plattor i kuvös.
  9. Efter inkubering i 5-6 timmar, tillsätt 2 ml 10% FBS / DMEM till varje brunn och plattor har ersatts i 37 ° C inbubator över natten.
  10. Nästa dag byter media och låta cellerna 24 timmar innan du lägger till lämpliga selektiva medier.
  11. När sammanflytande (vilket beror på tillväxten av cellerna, och effektivitet retrovirus transduktion, men vanligtvis tar mellan 4-14 dagar), trypsinize celler och sortera för fluorescens med icke-transduced celler som referens, samla in och celler pool med fluorescens större än icke-transduced celler och alikvoter fryser vid -80 ° C för framtida bruk.

2. Inverse Matrigel invasion analys

  1. Sakta tinar en delmängd av kompletta Matrigel (dvs innehåller tillväxtfaktorer) på is (Figur 1A).
  2. När tinats, späd Matrigel 1:1 i iskallt PBS (tillsammans med några andra extrabehandlingar på 2x koncentration i PBS före utspädning, Figur 1B). För att göra det lättare att hantera Matrigel innan polymerisation, alla plasten (t.ex. tips, rör, etc.) bör iskall.
  3. Sätt så många 8 micron pore 6,5 mm i diameter obestruket Transwells som krävs i brunnarna på en 24 och vävnadsodling tallrik, sedan försiktigt pipettera 100 l av den utspädda Matrigel i brunnar och låt inkubera i ~ 30 minuter vid 37 ° C för att stelna (Figur 1C).
  4. Under denna tid, förbereda ett eller flera fluorescerande-märkta cellsuspensioner på mellan 1 till 4 x 10 5 celler per ml, beroende på cellinje från varje förbehandlat tillstånd (e. g. SiRNA, missbruksbehandling) i normal tillväxt medium (Figur 1D).
  5. När Matrigel har stelnat, vänd Transwells och pipettera 100 l av cellsuspensionen på uppåt mot undersidan av filtret (Figur 1E).
  6. Försiktigt täcka Transwells med basen av en 24 väl vävnadodlingsplatta, att ta kontakt med varje droppe cellsuspension (Figur 1F).
  7. Inkubera plattan i inverterat tillstånd för 4 timmar för att möjliggöra för cellbindning (Figur 1G).
  8. Efter denna tid, vrid plattor höger sida upp och tvätta varje Transwell av sekventiella doppa i 2 x 1 ml serum fritt medium (Figur 2A).
  9. Lämna Transwells i en tredje väl som innehåller läkemedel eller behandlingar som krävs (Figur 2B).
  10. Försiktigt pipettera 100 l med 10% FBS / DMEM plus chemoattractant (e. g. EGF på 25 ng / ml) i Transwell ovanpå den stelnade Matrigel / PBS blandningen, lägg tillbaka locket och inkubera i 3-5 dagar vid 37 ° C med 5% CO 2 (Figur 2C).

3. Färgning och visualisering

  1. Celler som uttrycker fluorescerande proteiner kan hoppa över stegen nedan innan konfokalmikroskopi
  2. För att bilden icke-fluorescerande celler invaderar Matrigel, placera Transwells i färska 24 bra rätter och pipett 1 ml 4 mikroMKalcein AM fläck lösning på toppen av varje Matrigel kontakt, gör det möjligt att spilla över sidorna och fläcken från toppen och botten. Kalcein AM (acetoximetyl ester av kalcein) är en levande cell färgämne som färgar hela celler gröna och kräver ingen fixering.
  3. Inkubera 1 timme vid 37 ° C i 5% CO 2 fuktad atmosfär, då cellerna är helt färgade och redo att avbildas av konfokalmikroskopi.
  4. Alternativt kan icke-fluorescerande celler invaderar Matrigel fastställas och färgas som beskrivs nedan i 3,5-3,9.
  5. Överför varje Transwell till en ny 24-brunnar. Overlay 1 ml 4% para-formaldehyde/0.2% Triton-X 100.
  6. Inkubera i rumstemperatur i 0,5 timme.
  7. Ta fixativ och tvätta tre gånger med 1 ml PBS.
  8. Ta bort cytoplasmiska RNA med 30 min RNas behandling med 100 mikrogram / ml RNas. Tvätta två gånger med PBS.
  9. För visualisering lägga till 0,01 mg / ml propidiumjodid (PI) som spätts i PBS och låt stå i rumstemperatur i dark för 0,5 timme. Tvätta tre gånger med PBS. I detta skede målat PI transwell kan förvaras i rumstemperatur i mörker under minst 1 månad.
  10. Exakt avbildningsmetoder av konfokalmikroskopi är beroende av tillgängliga resurser. Med ett inverterat konfokalmikroskop, placera Transwell med en liten mängd kvarvarande PBS på stort täckglas (garantera att inga bubblor) över icke-immersion 20 X objektiv och fånga optiska delar varje 10-15 ìm från botten av matrigel kontakten. Individuella optiska skivor kan användas för att kvantifiera omfattningen av invasionen (figur 3a) eller att bygga in i 3-dimensionella objekt med hjälp av lämplig mjukvara såsom Volocity (Figur 3B).

4. Representativa resultat

Ett exempel på en Z-serie av optiska skivor visas i Figur 3A. I detta fall var cellerna färgas med kalcein AM och antalet celler invaderar upp från filtret kan ses att minska med avståndet. Kvantifiering av ivasion kan göras genom att analysera förhållandet mellan kalcein AM positiva pixlar negativa pixlar vid varje intervall, eller genom att använda fixering / färgningsmetod beskrivs ovan och räkna PI positiva kärnor i varje position. En fördel med kalcein AM färgning är att 3-dimensionella rekonstruktioner av cell invasion kan monteras med hjälp av programvara som Volocity, vilket ger en visuell bild av läget för invasionen (Figur 3B). Om celler är märkta med uttryck av fluorescerande proteiner, då positionerna för varje färg cell kan visualiseras i 3-dimensionella rekonstruktioner, antingen från sidan (figur 3C) eller genom att göra skivor genom rekonstruktion (Figur 3D).

Figur 1
Figur 1. Skiss av stegen i inrättandet omvänt invasion analys. A) Matrigel ECM tinas på is. B) Matrigel späds 1:01 med PBS som innehåller något läkemedelsbehandlingar dubbelt slutlig koncentration. C) Transwell insatser placeras i multispot tallrikar och Matrigel pipetteras till vardera. D) cellsuspensioner görs på önskad koncentration. E) När Matrigel har satt är plattan inverterad och tas bort, är celler klädd på undersidan filtret i Transwell skär. F) I den inverterade läget är flerskikts plattan noggrant placeras över Transwell inlägg, att ta kontakt med cellsuspension. G) Celler får följa filtret i 4 timmar.

Figur 2
Figur 2. Fortsättning av schematiska diagrammet för inversen invasionen analysen. A) När cellerna har följt, doppa varje Transwell i serum-fria medier två gånger för att ta bort lösa celler. B) Placera tvättas Transwell i en slutlig väl som innehåller Media Plus behandlingar som krävs. C) Medier som innehåller chemoattractant (t.ex. 10% fetalt bovint serum) med behandlingar som krävs är noggrant skiktade på Matrigel.

ENT "> Figur 3
Figur 3. Representant bilder av resultaten av invers invasion analysen. A) optisk delar av celler färgas med kalcein AM invadera Matrigel, tagen vid 15 ìm mellanrum av konfokalmikroskopi. B) Rekonstruktion av en 3-dimensionell rekonstruktion av cellen invasion från en bunt konfokala Z-serie bilder, sett från sidan. Omtryckt från referens 10. C) Tredimensionell rekonstruktion av GFP och RFP-märkta celler invaderar Matrigel betraktas från sidan. D) Optisk skiva genom 3-dimensionell rekonstruktion av GFP och RFP-märkta celler. Omtryckt från referens 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Matrigel invasionen analyser har traditionellt satts upp med celler placeras på ett lager av extracellulärt matrix protein med chemoattractant-inducerad motilitet mot och genom ett filter i botten. Invasivt var fick som en funktion av hur många celler kunde räknas på undersidan av filtret. Även om praktiskt taget det är liten skillnad med den "omvända" invasion analys som beskrivs ovan, finns det betydligt mer information om processen för invasion som kan bestämmas genom att visualisera invaderande celler när de rör sig upp och genom en Matrigel. Till exempel, förutom att kunna visualisera olika märkta celler för att undersöka ledande kontra följande cellerna i kollektiva invasion (figur 3C och 3D), med den här metoden gör att celler som skall fastställas, permeabilized, betsad och sedan avbildade för protein nivåer eller subcellulära distributionen . Den upplösningsförmåga denna metod skulle vara begränsad av baslinjen signalstyrkan i fluorescerarnt protein innehållande celler och känslighet Apparater för bildåtergivning, särskilt om två eller fler färger skulle avbildas. Blandning Matrigel med dye-kylda (DQ) kollagen (som är så tungt konjugerade med fluorescein att fluorescerande signalen är släckt tills proteolys separerar kollagen fragment och därmed sänka den lokala fluorescein koncentration och tillåter fluorescens) är en annan flerfärgade tillämpning av denna metod som skulle möjliggör visualisering av ECM nedbrytning genom att invadera celler. Använda hög halt screening enheter utrustade med konfokala imaging och miljömässiga kammare skulle göra detta förfarande för att omvandlas till en 4-d realtid invasion analys, som också kan vara multiplexade med ytterligare åtgärder, såsom ECM nedbrytning. I kombination med automation, skulle det också vara möjligt att utforma hög genomströmning cellbaserade testmetoder som kan användas för att screena kemiska bibliotek för nya anti-invasionen mål.

Ett antal faktorer shOuld kontrolleras noggrant vid användning av denna invers invasion analys. Celltäthet kan påverka den skenbara effektivitet invasion, så lika många celler som ska användas i varje replikat. Behandlingar som ändrar cellens nummer (e. g. Cytostatika) kan visas att ändra omfattningen av invasionen, men kan också återspegla detta inflytande celltäthet. Trots att många cellinjer fungerar bra i denna analys, inte alla invadera tillräckligt bra för att vara användbar, så varje bör utvärderas från fall till fall. Den tid som krävs för att uppnå en invasion tillräckliga för att ge en bra signal fönster bör vara empiriskt fastställas för varje cellinje arbetar MDA MB 231 cellinje bra i 4 dagar efter start av analysen, till exempel. Dessutom kan vissa av villkoren föreslås (t.ex. 8 micron porstorlek för Transwell skär) passar inte varje cellinje, och en del optimering kan behövas. Den extra värde som härrör från denna metod jämfört med den standard Matrigel invasionen analys make att det är värt att etablera sig i något labb seriöst intresserade av att studera processer som ingår i 3-D-invasionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Finansieringen av denna forskning är från Cancer Research Storbritannien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) GIBCO, by Life Technologies 21969
Fetal Bovine Serum PAA Laboratories A15-101
Penicillin Streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
200 mM L-Glutamine (100x) GIBCO, by Life Technologies 25050-032
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
0.05% Trypsin EDTA GIBCO, by Life Technologies 25300
Polybrene Sigma-Aldrich AL-118
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668019
6.5mm Transwells, 8.0 μm pore size Corning 3422
Complete Matrigel BD Biosciences 354234
Calcein AM Invitrogen C1430
RNase Qiagen 19101
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864
Confocal microcope Leica Microsystems SP2MP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
  2. Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment. J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The Hallmarks of Cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
  5. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
  6. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).
  7. Croft, D. R., Olson, M. F. Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement. Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).
  8. Wolf, K. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).
  9. Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. Fos-transformation activates genes associated with invasion. Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).
  10. Scott, R. W. LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).

Tags

Medicin 58 cancer cell invasion bildbehandling retrovirus märkning RNAi 3D Matrix Matrigel ECM
Modellering och Imaging 3-dimensionell Kollektiv Cell Invasion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scott, R. W., Crighton, D., Olson,More

Scott, R. W., Crighton, D., Olson, M. F. Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion. J. Vis. Exp. (58), e3525, doi:10.3791/3525 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter