Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Modellering og Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

Published: December 7, 2011 doi: 10.3791/3525

Summary

Modeller av svulst celle invasjonen i tre-dimensjonale ekstracellulære matrix bedre reflektere

Abstract

Et særtrekk ved kreft malignitet er invasjon og metastasering 1. I noen kreftformer (e. g. Glioma 2), lokale invasjonen i omliggende friskt vev er roten årsak til sykdom og død. For andre kreftformer (e. g. Bryst, lunge, etc.), Er det prosessen med metastasering, der kreftceller flytte fra en primærtumor masse, kolonisere distal nettsteder og i siste instans bidrar til organsvikt, fører det til slutt til sykelighet og dødelighet 3. Det har blitt anslått at invasjon og metastasering er ansvarlig for 90% av kreft dødsfall fire. Som et resultat, har det vært stor interesse i å identifisere molekylære prosesser og kritiske protein mediatorer av invasjon og metastasering med henblikk på å forbedre diagnostikk og behandling 5.

En utfordring for kreft forskerne er å utvikle invasjonen analyser at tilstrekkelig ligner in vivo situasjonenfor å muliggjøre nøyaktig sykdom modellering 6. To-dimensjonale celle motilitet analysene er kun informative om ett aspekt av invasjonen og ikke tar hensyn til ekstracellulær matrix (ECM) protein remodeling som også er et kritisk element. Nylig har forskning raffinert vår forståelse av svulst celle invasjon og avslørte at individuelle celler kan bevege seg ved avlang eller rund moduser 7. I tillegg har det vært større forståelse for bidraget av kollektive invasjon, i hvilke celler invadere i tråder, ark og klynger, spesielt i høyt differensierte svulster som opprettholder epiteliale egenskaper, til spredning av kreft 8.

Vi presenterer en raffinert metode 9 for å undersøke bidrag av kandidat proteiner til kollektive invasjon 10. Spesielt ved å konstruere separate bassenger av celler til å uttrykke ulike fluorescerende proteiner, er det mulig å molecularly dissekere aktivitetene og proteins kreves i ledende celler versus de som kreves i følgende celler. Bruken av RNAi gir den molekylære verktøy for å eksperimentelt demontere de prosessene som er involvert i den enkelte celle invasjon samt i ulike posisjoner kollektive invasjon. I denne prosedyren, er blandinger av fluorescensmerket-merkede celler belagt på bunnen av en Transwell sett tidligere fylt med Matrigel ECM protein, da lov til å invadere "oppover" gjennom filteret og inn i Matrigel. Rekonstruksjon av z-serien image stabler, fremstilt ved confocal imaging, til tredimensjonale representasjoner tillater visualisering av kollektivt invaderende tråder og analyse av representasjon av fluorescensmerket-merkede celler i ledende versus følgende posisjoner.

Protocol

1. Retrovirale merking av celler med selvlysende proteiner

  1. Plate retrovirale emballasje celler (f.eks Phoenix) ut på 0,25 x 10 6 celler per brønn av en 6-brønn rett i 10% fetal bovine serum (FBS) / DMEM.
  2. Transfektere celler med retrovirale DNA 48 timer senere celler ved hjelp Effectene henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Skyll brønner to ganger med medium 24 timer senere, og deretter legge 1,5 ml av 10% FBS / DMEM per brønn.
  4. Samle pakket virus i vevskultur medium 48 timer senere ved pipettering og overføre til 2 mL Mikrosentrifugerør.
  5. Sentrifuger ved 1600 rpm i 5 min til pellet noen celler.
  6. Fjern supernatanten til et rent rør og oppbevar ved -80 ° C.
  7. Celler som skal retrovirally transduced er belagt ut på 1,5 x 10 5 celler per brønn av en 6 vel rett og plasseres i en fuktet inkubator ved 37 ° C over natten.
  8. Dagen fjerne media fra cellene og add 1 ml av virus lager supplert med 4 mL polybrene (2 mg / ml) til hver brønn. Bytt ut plater i kuvøse.
  9. Etter inkubasjon til 5-6 timer, tilsett 2 ml 10% FBS / DMEM til hver brønn og plater byttes i 37 ° C inbubator natten.
  10. Dagen erstatte media og la celler 24 timer før du legger passende selektive medier.
  11. Når confluent (som avhenger av veksten av cellene, og effektiviteten i retrovirale transduksjon, men vanligvis tar 4-14 dager), trypsinize celler og sorterer for fluorescens bruk av ikke-transduced celler som en referanse, samle og basseng celler med fluorescens større enn ikke-transduced celler og fryse alikvoter ved -80 ° C for fremtidig bruk.

2. Inverse Matrigel invasjonen assay

  1. Sakte tine en delmengde av komplette Matrigel (dvs. inneholder vekstfaktorer) på is (figur 1A).
  2. Når tint, fortynnes Matrigel 1:1 i iskaldt PBS (sammen med eventuelle andrebehandlinger på 2x konsentrasjon i PBS før fortynning; figur 1B). For å gjøre det lettere å håndtere Matrigel før polymerisasjon, alle plasticware (f.eks tips, rør, etc.) skal være iskald.
  3. Sett så mange 8 micron pore 6,5 mm diameter ubestrøket Transwells som kreves i brønnene til en 24 godt vev kultur plate, deretter forsiktig pipette 100 mL av den fortynnede Matrigel i brønnene og la inkuber ~ 30 minutter ved 37 ° C å stivne (figur 1C).
  4. I løpet av denne tiden, utarbeide ett eller flere fluorescensmerket-merket celle suspensjoner på mellom 1 til 4 x 10 5 celler per ml, avhengig cellelinje, fra hver pre-behandlet tilstand (e. g. SiRNA, medikamentell behandling) i deres normal vekst medium (figur 1D).
  5. Når Matrigel har stivnet, snu Transwells og pipette 100 mL av cellesuspensjon på oppover mot undersiden av filteret (figur 1E).
  6. Nøye dekke Transwells med bunnen av en 24 godt vevkultur plate, ta kontakt med hver dråpe av cellesuspensjon (figur 1F).
  7. Inkuber platen i den inverterte staten for 4 timer for å tillate celle vedlegg (Figur 1G).
  8. Etter denne tid, ta platene høyre side opp og vask hver Transwell ved sekvensiell dyppe i 2 x 1 ml serum fritt medium (Figur 2A).
  9. La Transwells i en tredje brønn som inneholder legemidler eller behandlinger som kreves (figur 2B).
  10. Forsiktig pipette 100 mL 10% FBS / DMEM pluss chemoattractant (e. g. EGF ved 25 ng / ml) i Transwell på toppen av størknet Matrigel / PBS blanding, setter på lokket og inkuber i 3-5 dager ved 37 ° C med 5% CO 2 (Figur 2C).

3. Flekker og visualisering

  1. Celler som uttrykker fluoriserende proteiner kan hoppe over trinnene nedenfor før konfokalmikroskopi
  2. Til bilde ikke-fluorescerende cellene invaderer Matrigel, sted Transwells i frisk 24 godt retter og pipette 1 ml av 4 mMCalcein AM flekken løsning på toppen av hver Matrigel plugg, slik at det å smitte over sidene og beis fra toppen og bunnen. Calcein AM (acetoxymethyl ester av calcein) er en levende celle fargestoff som farger hele cellene grønne og krever ingen fiksering.
  3. Inkuber 1 time ved 37 ° C i 5% CO 2 fuktet atmosfære, noe som medførte at cellene er fullt farget og klar til å bli fotografert av konfokalmikroskopi.
  4. Alternativt, kan ikke-fluorescerende cellene invaderer Matrigel være fast og beiset som beskrevet nedenfor i 03.05-03.09.
  5. Overfør hver Transwell til en frisk 24-bra plate. Overlegg 1 ml 4% para-formaldehyde/0.2% Triton-X 100.
  6. Inkuber ved romtemperatur i 0,5 time.
  7. Fjern festing og vask 3 ganger med 1 ml PBS.
  8. Fjern cytoplasmatiske RNA med 30 min RNase behandling med 100 mg / ml RNase. Vask to ganger med PBS.
  9. For visualisering legge til 0,01 mg / ml propidium jodid (PI) fortynnet i PBS og la ved romtemperatur i dark i 0,5 time. Vask 3 ganger med PBS. På dette stadiet, beiset PI transwell kan oppbevares i romtemperatur i mørket i minst 1 måned.
  10. Nøyaktig bildebehandling metoder konfokalmikroskopi er avhengig av tilgjengelige ressurser. Bruke en invertert confocal mikroskop, plasserer Transwell med en liten mengde av gjenværende PBS til store dekkglass (sikre at ingen er luftbobler) over ikke-immersion 20 X objektiv og fange optisk deler hvert 10-15 mikrometer fra bunnen av matrigel pluggen. Individuelle optiske skiver kan brukes til å kvantifisere omfanget av invasjonen (figur 3A) eller å bygge inn 3-dimensjonale objekter ved hjelp av egnet programvare som Volocity (Figur 3B).

Fire. Representant Resultater

Et eksempel på en Z-serie optiske skiver er vist i Figur 3A. I dette tilfellet ble cellene farget med Calcein AM og antall celler invadere opp fra filteret kan sees å avta med avstanden. Kvantifisering av ivasion kan gjøres ved å analysere forholdet mellom Calcein AM positive piksler til negative punkter på hvert intervall, eller ved å bruke fiksering / beising metoden beskrevet ovenfor og telling PI positive cellekjerner ved hver posisjon. En fordel med Calcein AM farging er at 3-dimensjonale rekonstruksjoner av celle invasjon kan monteres ved hjelp av programvare som Volocity, som gir en visuell beskrivelse av modus for invasjonen (Figur 3B). Hvis cellene er merket med uttrykket av fluorescerende proteiner, så posisjonene til hver farge celle kan visualiseres i 3-dimensjonale rekonstruksjoner, verken sett fra siden (Figur 3C) eller ved å gjøre skiver gjennom rekonstruksjon (Figur 3D).

Figur 1
Figur 1. Skjematisk diagram av trinnene involvert i å sette opp inverse invasjon analysen. A) Matrigel ECM tint på is. B) Matrigel er fortynnet 1:1 med PBS som inneholder noen medikamentelle behandlinger på det dobbelte endelig konsentrasjon. C) Transwell innsatser er plassert i multiwell plater, og Matrigel pipetteres til hver. D) Cell suspensjoner gjort på ønsket konsentrasjon. E) Når Matrigel har satt, er platen inverterte og fjernet, er celler belagt på undersiden filter av Transwell inserts. F) I invertert stilling er multiwall plate nøye plassert over Transwell inserts, ta kontakt med cellesuspensjonen. G) Celler får lov til å følge filter for 4 timer.

Figur 2
Figur 2. Videreføring av prinsippskisse for den inverse invasjonen analysen. A) Når cellene har levd, dip hver Transwell inn i serum-free media to ganger for å fjerne løse celler. B) Sett vasket Transwell inn i en siste brønnen inneholder media pluss behandlinger etter behov. C) Media inneholder chemoattractant (f.eks 10% føtale bovint serum) med behandlinger som kreves er forsiktig lagvis på Matrigel.

ent "> Figur 3
Figur 3. Representative bilder av resultatene av inverse invasjon analysen. A) Optisk deler av celler farget med Calcein AM invaderende Matrigel, tatt med 15 mikrometer intervaller av konfokalmikroskopi. B) Rekonstruksjon av en 3-dimensjonal rekonstruksjon av celle invasjon fra en stabel med confocal Z-serie bilder, sett fra siden. Gjengitt fra referanse 10. C) Tredimensjonal rekonstruksjon av GFP og RFP-merkede cellene invaderer Matrigel sett fra siden. D) Optisk skjære gjennom den 3-dimensjonal rekonstruksjon av GFP og RFP-merkede celler. Gjengitt fra referanse 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Matrigel invasjonen analysene har tradisjonelt blitt satt opp med celler plassert på et lag av ekstracellulært matrix protein med chemoattractant-indusert motilitet mot og gjennom et filter nederst. Invasivitet ble scoret som en funksjon av hvor mange celler kan telles på undersiden av filteret. Selv om praksis er det liten forskjell med den "omvendte" invasjon analysen beskrevet ovenfor, er det betydelig mer informasjon om prosessen med invasjonen som kan bestemmes ved å visualisere invadere celler som de beveger seg opp og gjennom Matrigel. For eksempel, i tillegg til å være i stand til å visualisere annerledes merkede cellene til å undersøke ledende versus følgende celler i kollektiv invasjon (Figur 3C og 3D), bruker denne metoden tillater celler å være faste, permeabilized, beiset og avbildes for protein nivåer eller subcellular distribusjon . Den oppløsningsevne med denne metoden ville bli begrenset av grunnlinjen signal intensiteten av fluorescent protein uttrykker cellene og følsomheten til bildebehandling apparater, spesielt hvis to eller flere farger skulle avbildes. Mixing Matrigel med dye-slukket (DQ) kollagen (som er så tungt konjugert med fluorescein at fluorescerende signalet er slukket før proteolyse skiller kollagen fragmenter og dermed senke den lokale fluorescein konsentrasjon og tillater fluorescens) er et annet multi-farge anvendelsen av denne metoden som ville mulighet for visualisering av ECM degradering ved å invadere cellene. Ved hjelp av høyt innhold screening enheter utstyrt med confocal bildebehandling og miljømessige kamre vil aktivere denne prosedyren for å bli forvandlet til en 4-d sanntid invasjonen assay, som også kan være multiplekset med ekstra tiltak som ECM degradering. Kombinert med automatisering, ville det også være mulig å designe high throughput celle-baserte analyser som kunne brukes til å screene kjemiske biblioteker for romanen anti-invasjon mål.

En rekke faktorer shOuld kontrolleres nøye når du bruker denne inverse invasjonen analysen. Cell tetthet kan påvirke den tilsynelatende effektiviteten av invasjonen, så likt antall celler som skal brukes i hvert replikere. Behandlinger som endrer celle nummer (e. g. Cytotoksiske legemidler) kan synes å endre omfanget av invasjonen, men kan også gjenspeile denne cellen tetthet innflytelse. Selv om mange cellelinjer fungere godt i denne analysen, ikke alle invadere godt nok til å være nyttig, slik at hvert bør vurderes fra sak til sak. Tiden som kreves for å oppnå et nivå av invasjon tilstrekkelig til å gi et godt signal vindu bør være empirisk bestemmes for hver celle linje, fungerer MDA MB 231 cellelinje bra på 4 dager etter starten av analysen, for eksempel. I tillegg kan noen av de forholdene foreslo (f.eks 8 micron porestørrelse for Transwell inserts) som ikke passer hver cellelinje, og noen optimalisering kan være nødvendig. Den ekstra verdien som avledes av denne metoden i forhold til standard Matrigel invasjonen assay mÅke det lønner seg å etablere i alle lab seriøst interessert i å studere prosessene som er involvert i 3-D invasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Finansiering for denne forskningen er fra Cancer Research Storbritannia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) GIBCO, by Life Technologies 21969
Fetal Bovine Serum PAA Laboratories A15-101
Penicillin Streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
200 mM L-Glutamine (100x) GIBCO, by Life Technologies 25050-032
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
0.05% Trypsin EDTA GIBCO, by Life Technologies 25300
Polybrene Sigma-Aldrich AL-118
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668019
6.5mm Transwells, 8.0 μm pore size Corning 3422
Complete Matrigel BD Biosciences 354234
Calcein AM Invitrogen C1430
RNase Qiagen 19101
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864
Confocal microcope Leica Microsystems SP2MP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
  2. Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment. J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The Hallmarks of Cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
  5. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
  6. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).
  7. Croft, D. R., Olson, M. F. Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement. Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).
  8. Wolf, K. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).
  9. Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. Fos-transformation activates genes associated with invasion. Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).
  10. Scott, R. W. LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).

Tags

Medisin kreft celle invasjon bildebehandling retrovirale merking RNAi 3D Matrix Matrigel ECM
Modellering og Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scott, R. W., Crighton, D., Olson,More

Scott, R. W., Crighton, D., Olson, M. F. Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion. J. Vis. Exp. (58), e3525, doi:10.3791/3525 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter