Summary
Modeller af tumor celle invasion i tre-dimensionelle ekstracellulære matrix bedre afspejler de
Abstract
Et kendetegn ved kræft malignitet er invasion og metastasering 1. I visse kræftformer (e. g. Gliom 2), lokal invasion ind i det omgivende raske væv er den egentlige årsag til sygdom og død. For andre kræftformer (e. g. Bryst-, lunge, osv..), Er det processen med metastaser, hvor tumorceller flytter fra en primær tumor masse, kolonisere distal steder og i sidste ende bidrage til organsvigt, som i sidste ende fører til sygelighed og dødelighed 3. Det er blevet anslået, at invasion og metastasering er ansvarlige for 90% af alle kræftdødsfald 4. Som følge heraf har der været intense interesse i at identificere de molekylære processer og kritiske protein mediatorer af invasion og metastasering med henblik på at forbedre diagnostik og behandling 5.
En udfordring for kræft forskerne er at udvikle invasion assays, at tilstrækkeligt svarer til in vivo-situationentil muliggør nøjagtig sygdom modellering 6. To-dimensionelle celle motilitet assays er kun informativ om ét aspekt af invasion og ikke tager hensyn til ekstracellulære matrix (ECM) protein remodeling, der er også et kritisk element. For nylig har forskning forfinet vores forståelse af tumor celle invasion og afslørede, at de enkelte celler kan bevæge sig ved runde eller aflange tilstande 7. Derudover har der været større anerkendelse af det bidrag kollektive invasion, hvor celler invaderer i tråde, plader og klynger, især i stærkt differentierede tumorer, der opretholder epitel egenskaber, til spredning af kræft 8.
Vi præsenterer et raffineret metode 9 for at undersøge bidrag kandidat proteiner til kollektive invasion 10. I særdeleshed, ud fra et teknisk adskilte puljer af celler til at udtrykke forskellige fluorescerende proteiner, er det muligt at molekylemæssigt dissekere de aktiviteter og proteins kræves i førende celler versus dem, der kræves i følgende celler. Brugen af RNAi giver molekylære værktøj til eksperimentelt adskille de processer, der er involveret i enkelte celle invasion samt i forskellige positioner af kollektive invasion. I denne procedure, er blandinger af fluorescens-mærkede celler belagt på bunden af en Transwell indsætte tidligere fyldt med Matrigel ECM protein, derefter lov til at invadere "opad" gennem filteret og ind i Matrigel. Genopbygning af Z-serien Billedstakke, fremstillet ved konfokal billedbehandling, i tre-dimensionelle repræsentationer giver mulighed for visualisering af kollektivt invaderende tråde og analyse af repræsentationen af fluorescens-mærkede celler i ledende versus følgende positioner.
Protocol
1. Retroviral mærkning af celler med fluorescerende proteiner
- Plate retrovirale emballage celler (f.eks Phoenix) ud på 0,25 x 10 6 celler pr brønd i en 6-godt fad i 10% føtalt bovint serum (FBS) / DMEM.
- Transfect celler med retrovirale DNA 48 timer senere celler, der bruger Effectene efter fabrikantens anvisninger.
- Skyl brønde to gange med medium 24 timer senere, hvorefter der tilsættes 1,5 ml 10% FBS / DMEM per brønd.
- Saml pakket virus i vævnæringssubstrat 48 timer senere ved pipettering og overførsel til 2 mL mikrocentrifugerør.
- Centrifugeres ved 1600 rpm i 5 min til pellet alle celler.
- Fjern supernatanten til et rent glas og opbevares ved -80 ° C.
- Celler, der skal retrovirally transduced er belagt ud på 1,5 x 10 5 celler pr brønd i en 6 godt fad og placeres i en fugtig inkubator ved 37 ° C natten over.
- Den næste dag, skal du fjerne mediet fra cellerne og add 1 ml af virus lager suppleret med 4 μl polybrene (2 mg / ml) til hver brønd. Udskift plader i kuvøse.
- Efter inkubation i 5-6 timer, 2 ml tilsættes 10% FBS / DMEM til hvert hul, og pladerne er blevet udnævnt i 37 ° C inbubator natten over.
- Den næste dag, erstatter medier og lad celler 24 timer før tilføjer passende selektive medier.
- Når sammenflydende (som afhænger af vækstraten af cellerne, og effektiviteten af retroviral transduktion, men typisk tager fra 4-14 dage), trypsinize celler og sortere for fluorescens ved hjælp af ikke-transduced celler som reference, indsamle og pool celler med fluorescens større end ikke-transduced celler og fryse alikvoter ved -80 ° C til senere brug.
2. Inverse Matrigel invasion assay
- Langsomt tø en portion af komplette Matrigel (dvs. indeholder vækstfaktorer) på is (Figur 1A).
- Når afrimes, fortyndes Matrigel 1:1 i iskold PBS (sammen med enhver anden yderligerebehandlinger på 2x koncentration i PBS inden fortynding; figur 1B). For at gøre det lettere at håndtere Matrigel før polymerisering, alle plastvarer (fx tips, rør, osv.) skal være iskold.
- Indsæt så mange 8 mikron pore 6,5 mm ubelagte diameter som Transwells kræves ind i brønde af en 24 vel vævskultur plade, derefter omhyggeligt pipette 100 μl af den fortyndede Matrigel ind i brøndene og lad inkuber i ~ 30 min ved 37 ° C at størkne (Figur 1C).
- I løbet af denne tid, forberede et eller flere fluorescens-mærkede cellesuspensioner på mellem 1 til 4 x 10 5 celler pr ml, afhængig cellelinie, fra hver forbehandlet tilstand (e. g. SiRNA, narkotikabehandling) i deres normale vækst medium (Figur 1D).
- Når Matrigel er størknet, vendes Transwells og pipette 100 μl af cellesuspensionen på den opadgående mod undersiden af filteret (Figur 1E).
- Omhyggeligt dække Transwells med bunden af en 24 godt vævagarplade, at komme i kontakt med hver dråbe cellesuspension (figur 1F).
- Inkubér pladen i inverteret tilstand i 4 timer for at give mulighed for celle vedhæftet fil (figur 1G).
- Efter denne tid, pladerne drejes til højre-side-up og vask hver Transwell ved sekventiel dyppe i 2 x 1 ml serum frit medium (Figur 2A).
- Lad Transwells i en tredje og indeholder stoffer eller behandlinger påkrævet (Figur 2B).
- Forsigtigt pipette 100 μl 10% FBS / DMEM plus chemoattractant (e. g. Globaliseringsfonden på 25 ng / ml) i Transwell på toppen af det størknede Matrigel / PBS blanding, udskifte låget og inkuber i 3-5 dage ved 37 ° C med 5% CO 2 (Figur 2C).
3. Farvning og visualisering
- Celler, der udtrykker fluorescerende proteiner kan springe trinene nedenfor, før konfokal mikroskopi
- For at billedet ikke-fluorescerende celler invaderer Matrigel, sted Transwells i frisk 24 godt retter og pipette 1 ml af 4 μMCalcein AM plet løsning på toppen af hver Matrigel stik, som gør det muligt at smitte af på siderne og pletten fra toppen og bunden. Calcein AM (acetoxymethyl ester af calcein) er en levende celle, farvestof, der pletter hele celler grønne og kræver ingen fiksering.
- Inkuber 1 time ved 37 ° C i 5% CO 2 fugtet atmosfære, hvorefter cellerne er fuldt farves og klar til at blive afbildet ved konfokal mikroskopi.
- Alternativt, kan ikke-fluorescerende celler invaderer Matrigel være faste og farves som beskrevet nedenfor i 3,5 til 3,9.
- Overfør hver Transwell til en frisk 24-brønds plade. Overlay 1 ml 4% para-formaldehyde/0.2% Triton-X 100.
- Inkubér ved stuetemperatur i 0,5 time.
- Fjern fiksativ og vask 3 gange med 1 ml PBS.
- Fjern cytoplasmatisk RNA med 30 min RNase behandling med 100 mg / ml RNase. Vask 2 gange med PBS.
- For visualisering tilføje 0,01 mg / ml Propidium Iodid (PI) fortyndes i PBS og henstår ved stuetemperatur i dark for 0,5 time. Vask 3 gange med PBS. På dette stadium, bejdset PI transwell kan opbevares ved stuetemperatur i mørke i mindst 1 måned.
- Præcis billeddiagnostiske metoder ved konfokal mikroskopi er afhængige af tilgængelige ressourcer. Ved hjælp af en omvendt konfokal mikroskop, sted Transwell med en lille mængde af resterende PBS på stort dækglas (sikre, at ingen bobler) i forhold til ikke-nedsænkning 20 X objektive og indfange optisk sektioner hver 10-15 μm fra bunden af matrigel stikket. Individuelle optiske skiver kan bruges til at kvantificere omfanget af invasion (Figur 3A), eller til at bygge ind i 3-dimensionelle objekter ved hjælp af passende software som Volocity (figur 3B).
4. Repræsentative resultater
Et eksempel på en Z-serie af optiske skiver er vist i figur 3A. I dette tilfælde blev cellerne farvet med calcein AM og antallet af celler invaderer op fra filteret kan ses at falde med afstanden. Kvantificering af ivasion kan gøres ved at analysere forholdet mellem calcein AM positive pixels til negative punkter ved hvert interval, eller ved at bruge fiksering / farvning metoden beskrevet ovenfor og tælle PI positive kerner på hver position. En fordel ved calcein AM farvning er, at 3-dimensionelle rekonstruktioner af celle invasion kan samles ved hjælp af software som Volocity, hvilket giver en visuel skildring af den form for invasion (figur 3B). Hvis celler er mærket med udtryk af fluorescerende proteiner, så placeringen af hver farve celle kan visualiseres i 3-dimensionelle rekonstruktioner, enten set fra siden (figur 3C) eller ved at gøre skiver ved rekonstruktion (Figur 3D).
Figur 1. Skematisk diagram af trin i forbindelse med etablering omvendt invasion analysen. A) Matrigel ECM optøet på is. B) Matrigel fortyndes 1:1 med PBS indeholdende nogen medicinsk behandling på det dobbelte af den endelige koncentration. C) Transwell skær er placeret i multiwell plader, og Matrigel afpipetteres i hver. D) cellesuspensioner foretaget på den ønskede koncentration. E) Når Matrigel har sat, er pladen vendes og fjernet, er cellerne belagte på undersiden filter Transwell indstik. F) I den omvendte stilling, er den flerlags pladen omhyggeligt placeret over Transwell skær, hvilket gør kontakt med cellesuspension. G) celler får lov til at holde sig til filteret for 4 timer.
Figur 2. Fortsættelse af den skematiske diagram for den inverse invasion analysen. A) Når cellerne har levet, dyp hver Transwell i serum-frie medier to gange for at fjerne løse celler. B) Anbring vasket Transwell ind i en endelig vel indeholder Media Plus behandlinger efter behov. C) medier, der indeholder chemoattractant (fx 10% føtalt bovint serum) med behandlinger, som kræves, er omhyggeligt lag på Matrigel.
Figur 3. Repræsentant billeder af resultaterne af invers invasion analysen. A) Optisk dele af celler farvet med calcein AM invaderende Matrigel, taget ved 15 μm mellemrum af konfokal mikroskopi. B) Rekonstruktion af en 3-dimensionel rekonstruktion af celle invasion fra en stak konfokal Z-serie billeder, set fra siden. Genoptrykt fra reference 10. C) Tre-dimensionel rekonstruktion af GFP og RFP-mærkede celler invaderer Matrigel set fra siden. D) Optisk skære gennem 3-dimensionel rekonstruktion af GFP og RFP-mærkede celler. Genoptrykt fra reference 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matrigel invasion analyser har traditionelt været oprettet med celler placeret på et lag af ekstracellulære matrix protein med chemoattractant-induceret motilitet hen imod og gennem et filter i bunden. Invasionsevne blev scoret som en funktion af, hvor mange celler kunne tælles på undersiden af filteret. Selvom stort set at der er lidt forskel med "omvendte" invasionen assay beskrevet ovenfor, er der betydeligt flere oplysninger om processen med invasion, som kan bestemmes ved at visualisere invaderende celler, når de bevæger sig op og gennem Matrigel. For eksempel, at være i stand til at visualisere forskelligt mærkede celler til at undersøge førende versus efterfølgende celler i kollektive invasion (Figur 3C og 3D), ved hjælp af denne metode ud over gør cellerne skal fastsættes, permeabilized, farves og derefter filmede for protein niveauer eller subcellulære fordeling . Den opløsningsevne af denne metode ville blive begrænset af den baseline signal intensiteten af fluorescerernt protein udtrykker celler og følsomheden af den billeddiagnostiske apparater, specielt hvis to eller flere farver skulle afbildet. Blanding Matrigel med dye-slukkes (DQ) kollagen (som er så stærkt konjugeret med fluorescein, at det fluorescerende signal er slukket, indtil proteolyse adskiller collagen fragmenter dermed sænke den lokale fluorescein koncentration og tillader fluorescens) er en anden multi-farve anvendelse af denne metode, der ville mulighed for visualisering af ECM nedbrydning ved at invadere celler. Ved hjælp af høj-indhold screening udstyret med konfokal billedbehandling og miljømæssige kamre ville gøre det muligt for denne procedure, der skal omdannes til en 4-d realtid invasion assay, som også kunne multiplex med yderligere foranstaltninger som f.eks ECM nedbrydning. Kombineret med automatisering, ville det også være muligt at designe high throughput cellebaserede assays, der kunne bruges til at screene kemiske biblioteker for nye anti-invasion mål.
En række faktorer shOuld blive nøje kontrolleret ved brug af denne omvendte invasion analyse. Celletæthed kan påvirke den tilsyneladende effektiviteten af invasion, så lige mange celler skal anvendes i hver gentagelse. Behandlinger, der ændrer celle nummer (e. g. Cytostatika) kan synes at ændre omfanget af invasionen, men kan også afspejle denne celletætheden indflydelse. Selvom mange cellelinjer fungerer godt i denne analyse, er ikke alle invadere godt nok til at være nyttig, så hver bør vurderes fra sag til sag. Længden af tid, der kræves for at opnå en grad af invasion tilstrækkelig til at give et godt signal vindue bør være empirisk bestemmes for hver cellelinie, arbejder MDA MB 231 cellelinie godt i 4 dage efter starten af analysen, f.eks. Desuden kan nogle af de betingelser foreslået (fx 8 mikron porestørrelse for Transwell indstik), der ikke passer til hver celle linie, og nogle optimering kan være påkrævet. Den ekstra værdi er afledt af denne metode i forhold til den standard Matrigel invasionen assay mAKE det kan betale sig på en eller anden lab seriøst interesseret i at studere de processer, der er involveret i 3-D invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Finansieringen af denne forskning er fra Cancer Research Storbritannien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO, by Life Technologies | 21969 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO, by Life Technologies | 25050-032 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| 6.5mm Transwells, 8.0 μm pore size | Corning | 3422 | |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 | |
| RNase | Qiagen | 19101 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Confocal microcope | Leica Microsystems | SP2MP |
References
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment. J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The Hallmarks of Cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Croft, D. R., Olson, M. F. Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement. Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).
- Wolf, K. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).
- Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. Fos-transformation activates genes associated with invasion. Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).
- Scott, R. W. LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).
