En Chitosan Based, Laser aktiveret Thin Film Kirurgisk Adhesive, 'SurgiLux': Forberedelse og Demonstration

Summary

Fremstilling af en hidtil ukendt, fleksibel tynd film kirurgisk klæbemiddel fra FDA godkendte ingredienser, chitosan og indocyaningrøn er beskrevet. Binding af dette klæbemiddel til kollagent væv gennem en enkel aktiveringsproces med en laveffekt infrarød laser påvises.

Abstract

Suturer er en 4.000 år gammel teknologi, der fortsat er den "gyldne standard" for sårlukning i kraft af deres reparation styrke (~ 100 kPa). Imidlertid kan suturer fungere som nidus for infektion og i mange procedurer er i stand til at bevirke sårheling eller forstyrre funktionel vævsregenerering. ^En Kirurgiske klæbemidler og klæbemidler, såsom dem baseret på fibrin og cyanoacrylater, er blevet udviklet som alternativer til suturer til reparation af sådanne sår. De nuværende kommercielle klæbestoffer har også betydelige ulemper, der spænder fra virale og prion overførsel og mangel på reparation styrke som med fibrinlim, til væv toksicitet og mangel på biokompatibilitet for de cyanoacrylat-klæbemidler. Endvidere tiden tilgængelige kirurgiske klæbemidler tendens til at være gel-baseret og kan have udvidet hærdetider, der begrænser deres anvendelse. ² Tilsvarende kan anvendelsen af UV-lasere letter tværbindende mekanismer i protein-baserede eller albumin 'solunderværker "kan føre til DNA-skader, mens laser væv svejsning (LTW) prædisponerer termisk skader på væv. ^{3 På} trods af deres ulemper, lim og LTW har erobret omkring 30% af sårlukning markedet rapporteres at være på over 5 milliarder US $ om året, en betydelig bevis på behovet for suturfri teknologi. ^fire

I jagten på suturfri teknologi, vi har anvendt chitosan som et biomateriale til udvikling af en fleksibel, tynd film, laser-aktiveret kirurgisk klæbemiddel betegnes "SurgiLux«. Denne hidtil ukendte bioadhæsive anvender en unik kombination af biomaterialer og fotonik, der er FDA godkendt og anvendt med succes i mange forskellige biomedicinske anvendelser og produkter. SurgiLux overvinder alle ulemperne forbundet med suturer og nuværende kirurgiske klæbemidler (se tabel 1).

I denne præsentation rapporterer vi den relativt enkel protokol til fremstilling af SurgiLux og demonstreredens laseraktivering og væv svejsestyrke. SurgiLux film klæbe til kollagent væv uden kemisk modifikation, såsom tværbinding og ved bestråling under anvendelse af en forholdsvis lav-drevne (120 mW) infrarød laser i stedet for UV-lys. Chitosan film har en naturlig, men svagt klæbende tiltrækning til collagen (~ 3 kPa), laser aktivering af chitosan baserede SurgiLux film fremhæver styrken af denne adhæsion ved polymerkædens interaktioner som følge af forbigående varmeudvidelse. ^5. Uden dette "aktivering"-proces , er SurgiLux film let fjernes. ^6-9 SurgiLux er testet både in vitro og in vivo på forskellige væv, herunder nerve-, tarm, dura mater og hornhinder. I alle tilfælde er det påvist god biokompatibilitet og ubetydelig termisk beskadigelse som følge af bestråling. ^6-10

Protocol

1. Fremstilling af SurgiLux Solution

1. En 2% (v / v) opløsning af eddikesyre anvendelse af deioniseret vand i et rent bægerglas, anvender en laminar strømningshætte for at undgå forurening.
2. Afvej 0,02% (vægt / volumen) af kromoforen, indocyaningrøn, ICG, i et sterilt Eppendorf-rør, at røret er omviklet med sølvfolie at forhindre lysgennemtrængning.
3. Under anvendelse af en ren, engangspipette, omkring 1 ml fortyndet eddikesyreopløsning overføres til røret for at opløse farvestoffet, rystes forsigtigt og holde indpakket i folie.
4. Overfør den solubiliserede ICG i bægerglasset, og der tilsættes 2% (vægt / volumen) af chitosan pulver før tilsætning af en steril magnetomrører.
5. Bægerglasset dækkes med Parafilm så wrap i sølvfolie, før blanding af indholdet ved ca 125 rpm i 72 timer ved stuetemperatur i et stinkskab med sideværts luftstrømning.
6. Overfør indholdet i rene centrifugeglas og centrifugeres ved 15.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C for at fjerne eventuelle particulate materiale.
7. Omhyggeligt overføre den grønne SurgiLux opløsning i et rent bægerglas, omfatter anvendelse af Parafilm så wrap i sølvfolie, før opbevaring i et køleskab i 12 timer for at forøge viskositeten af ​​opløsningen.

2. Støbning af SurgiLux Films

1. Under anvendelse af en steril sprøjte, dispensere 8 ml af den kolde SurgiLux opløsning i en ren, petriskål på 95 mm i diameter, og forsigtigt vippe pladen for at sikre fuldstændig dækning af opløsningen. Variere forholdet mellem opløsningens rumfang til støbning område tillader styring af filmtykkelsen, se figur 1.
2. Fjern alle synlige bobler i opløsningen under anvendelse af spidsen af ​​en steril nål. Dæk skålen i sølvpapir og sted i køleskab for at fjerne eventuelle rester mikrometerstørrelse bobler.
3. Efter 20 min forsigtigt fjerne petriskålen fra køleskabet, sted i en laminar strømning hætte, dække med sølvpapir og lad den løsning at fordampe i 3 uger.
4. Efter complete fordampning, score de ydre kanter af den klare grønne SurgiLux film i petriskålen og forsigtigt »skind« filmen væk fra fadet overflade.
5. Den SurgiLux film skal være fleksibel og let manipuleres uden at rive eller bryde.
6. Opbevar cirkulære SurgiLux film i petriskålen pakket i sølvfolie på tør vej indtil den skal bruges.

3. Laser Aktivering af SurgiLux klæbefolier

1. For at demonstrere laseraktivering proces vil vi anvende et stykke bovint væv, såsom bøf skåret til en størrelse på 15 mm bredt og 20 mm længde. Åbnes vævet i en lige linie under anvendelse af en Number 10 kirurgisk kniv, til fremstilling af to stykker 15 med 10 mm.
2. Anslået de to stykker væv, således at deres kanter rører men ikke overlappende, og ved hjælp af en vatpind eller gaze, blidt absorbere overskydende væske.
3. Dernæst skar et stykke af SurgiLux film 7 x 9 mm og anbring forsigtigt filmen langs hele gennemskæres pIECE af væv, tryk forsigtigt ned med en tør vatpind.
4. SurgiLux film aktiveres ved hjælp af en infrarød diodelaser ved en indstilling på 120 mW. Da dette er en klasse IIIB laser, bør passende sikkerhedsforanstaltninger skal træffes, herunder anvendelse af relevante beskyttelsesbriller til alle medarbejdere.
5. Start i hjørnet, det SurgiLux bestråle med en infrarød laser sat til 120 mW og en stråle spot størrelse på 1 mm i diameter. Passere strålepletten over den grønne film med en hastighed på omkring 1 mm per sekund. Gentag bestråling fremgangsmåde to gange mere.

4. Styrken i Repair

1. Omhyggeligt sikre enderne af vævet i klemmerne i en trækprøvning instrument. Vi anvendelse af en Instron Mini55 system med en 50 Newton belastningscelle. Den maksimale belastning, trækstyrke og forlængelse ved brud blev beregnet under anvendelse Bluehill computersoftware (USA). Midler fra mindst 10 prøver blev bestemt (n = 10).
2. Tag op 'slap'og derefter adskille de vævsstykker med en hastighed på 1 mm pr sekund, indtil de to stykker væv holdes sammen af ​​SurgiLux strimlen adskilt fuldstændigt.

Representative Results

Centrifugering fører til en transparent grøn opløsning, som forøger viskositeten efter opbevaring ved 4-6 ° C. Efter henstand i 3 uger, er den grønne løsning omdannet til en gennemsigtig grøn SurgiLux film cirka 20 mikrometer tyk, og som det fremgår af videoen, er let fleksibel.

Ved bestråling med laseren, den SurgiLux film bindinger til vævet. Dette kan observeres ved kanterne af filmen, hvor vævet synes at kontrahere som laserstrålen passerer over filmen (figur 2). Ingen forkulning eller ablation af vævet og filmen bør observeres. Bindingsstyrken af ​​SurgiLux til vævet skal være tilstrækkelig til at løfte de halverede vævsstykker, og når trækstyrken måles skal være ca 15 kPa til prøven rapporteret her.

Tabel 1. </ Strong> Sammenligning af egenskaber for foreslåede SurgiLux system og kommercielt tilgængelige fibrin og cyanoacrylat kirurgiske klæbemidler.

Figur 1 Skematisk illustration af den SurgiLux tynde film lim fremstilling og aktivering proces.. Svarende til protokollen tekst Klik her for at se større figur .

Figur 2 Foto (x20), der viser den tynde SurgiLux film efter laseraktivering klæbet til bovin tarm væv og »kontraherende« ind i vævet indsnit (T _A, T _B:. Separate stykker of væv, I: indsnit, S: SurgiLux film).

Figur 3 Graph viser væv adhæsionsstyrkerne til forskellige klæbemidler:. Chitosan og SurgiLux film påført på væv, Tisseel (fibrin) og Histoacryl geler (cyanoacrylat) anvendt på væv.

Figur 4 scanningselektronmikrografer (SEMs) illustrerer celler fastgjort til SurgiLux film;. Humane cellelinier (a) olfaktoriske ensheathing celler [x1.5k], (b) stromale fibroblaster [X500], og (c) skeletmuskel afledt satellit stamceller [x1.7k]. Klik her for at se større figur .

Figur 5. Graf, der viser ændringen i filmtykkelsen med stigende SurgiLux opløsningsstøbning volumen (ml) og en konstant støbning område (7,09 x 10 ³ mm ^2).

Figur 6. Scanningelektronmikrofotografi (SEM) af film, der viser tilstedeværelsen af "brystvorter" (SN) rager ud fra overfladen (S).

Discussion

Chitosan kan fås i en række forskellige molekylvægte og med forskellige grader af deactylation (DDA). Variationer i chitosan renhed kan føre til tilstedeværelsen af ​​partikler i SurgiLux opløsning, centrifugering anvendes til at eliminere disse og bør resultere i en transparent grøn opløsning. Imidlertid kan filtrering også anvendes som en ekstra eller alternativ fremstillingstrin. Som med enhver materialebearbejdning, variationer, såsom chitosan DDA og molekylvægt, har konsekvenser for de fysisk-kemiske, biologiske og materialemæssige egenskaber for de resulterende SurgiLux film, herunder styrken af ​​den binding til væv.

Den fabrikationsproces for SurgiLux tillader betydelige variationer. For eksempel ændringer i forholdet mellem opløsningens rumfang til støbning overfladeareal (ml: mm ²⁾ kan anvendes til at justere filmtykkelsen Figur 5 viser en lineær stigning i tykkelsen af de endelige SurgiLux film som volumenet.af opløsningen hældt i petriskålen blev forøget. Ligeledes kan modifikationer af overfladen af støbningen anvendes til at modificere filmens overflademorfologi. Figur 6 viser tilstedeværelsen af mikrometerstore 'nipler' på overfladen af SurgiLux film. Sådanne skabelonmidler teknikker kan anvendes til fremstilling af forskellige overflader for at forbedre vævsadhæsion, forhindre mikrobiel cellebinding og fremme vævs reintegration. ¹¹ Endvidere kan forskellige biologisk aktive midler inkorporeres i fremstillingsprocessen til fremstilling af en klæbende film til regional lægemiddelafgivelse. ¹⁰

Tabel 1 opsummerer fordelene ved denne SurgiLux tyndfilm klæbemiddelsystem sammenlignet med traditionelle fibrin og cyanoacrylat-klæbemidler. Mens styrken af ​​vævsheling er mindre end suturer, SurgiLux undgår de talrige ulemper ved denne traditionelle sårlukning teknik såvel som de nuværende stillede kommercielle kirurgiske klæbemidler.

Evne til SurgiLux til bond forskellige collagene væv kombineret med dets materielle fleksibilitet tyder sit potentiale i laparoskopi, mens alsidighed fremstillingsprocessen fremmer den videre udvikling til applikationer i tissue engineering og regenerativ medicin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chitosan	Sigma-Aldrich	448877
Indocyanine Green	Sigma-Aldrich	I2633	Also known as Cardiogreen
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm)	CNI Lasers	Fc-808	Variable system up to 5 W power
Laser safety glasses	CNI Lasers	LS-G
Tensile testing apparatus	Instron Pty Ltd	5542	50 N load cell