Summary
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen, flexiblen Dünnfilm chirurgischen Klebstoff aus FDA zugelassenen Inhaltsstoffen, Chitosan und Indocyaningrün beschrieben. Bonden dieser Klebstoff auf Kollagengewebe durch eine einfache Aktivierung mit einer Low-Power-Infrarotlaser nachgewiesen wird.
Abstract
Nähte sind ein 4.000 Jahre alten Technik, der "goldene Standard" für einen Wundverschluss aufgrund ihrer Reparatur Festigkeit (~ 100 KPa) verbleiben. Allerdings können Nähte als nidus zur Infektion handeln und in vielen Verfahren sind derzeit keine Wundheilung zu bewirken oder zu stören funktionelle Geweberegeneration. 1 Chirurgische Leimen und Klebstoffen, z. B. solche auf Basis von Fibrin und Cyanoacrylaten, sind als Alternativen zu Nähten für entwickelt Die Reparatur dieser Wunden. Jedoch gegenwärtigen kommerziellen Klebstoffen auch erhebliche Nachteile auf, die von viralen und Prion-Transfer und einem Mangel an Reparatur Stärke wie bei den Fibrinkleber, um Gewebe Toxizität und mangelnder Biokompatibilität der Cyanoacrylat basierende Klebstoffe. Weiterhin neigen derzeit verfügbaren chirurgische Klebstoffe sein Gelbasis und kann verlängert Aushärtezeiten, die ihre Anwendung limitieren haben. 2 Ebenso ist die Verwendung von UV-Laser, um eine Vernetzung Mechanismen auf Proteinbasis oder Albumin 'Sol erleichternDers 'kann zu DNA-Schäden führen, während Laser-Gewebe-Schweißen (LTW) prädisponiert thermische Schäden an Geweben. 3 Trotz ihrer Nachteile, Klebstoffe und LTW eingefangen haben ca. 30% der Wundverschluss Markt berichtet über 5 Mrd. US $ pro Jahr betragen, ein signifikanter Beweis für die Notwendigkeit für nahtlose Technologie. 4
Im Streben nach nahtlosen Technik haben wir Chitosan als Biomaterial verwendet für die Entwicklung eines flexiblen, Dünnschicht, laseraktivierten chirurgischen Klebstoff als 'SurgiLux'. Dieser Roman bioadhäsiven nutzt eine einzigartige Kombination von Biomaterialien und Photonik, die FDA zugelassen sind und erfolgreich eingesetzt in einer Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen und Produkte. SurgiLux überwindet alle Nachteile, die mit Nahtmaterial und aktuelle chirurgische Klebstoffe (siehe Tabelle 1) zugeordnet ist.
In dieser Präsentation berichten wir über die relativ einfaches Protokoll für die Herstellung von SurgiLux und demonstrierenihre Laseraktivierung und Gewebe Nahtfestigkeit. SurgiLux Folien haften Kollagengewebe ohne chemische Modifikation wie Vernetzung und durch Bestrahlung mit einer vergleichsweise leistungsschwachen (120 mW) Infrarotlaser anstelle von UV-Licht. Chitosan Filme haben eine natürliche, aber schwachen Kleber Anziehungskraft auf Kollagen (~ 3 KPa), betont Laseraktivierung der Chitosan basierende SurgiLux Filmen die Stärke dieser Haftung durch Polymerkette Interaktionen als Folge von transienten thermischen Ausdehnung. 5 Ohne diese "Aktivierung"-Prozess werden SurgiLux Folien leicht entfernt. 6-9 SurgiLux sowohl in vitro als auch in vivo wurde auf einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Nerven, Darm, Dura mater und Hornhaut getestet. In allen Fällen zeigten gute Biokompatibilität und vernachlässigbare thermische Schädigung als Folge der Bestrahlung. 6-10
Protocol
Ein. Vorbereitung der SurgiLux Lösung
- Bereiten Sie eine 2% (v / v) Lösung von Essigsäure mit deionisiertem Wasser in einem sauberen Becherglas, verwenden Sie einen Laminarströmungshaube, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Wiegen 0,02% (w / v) des Chromophors, Indocyaningrün, IKG, in einer sterilen Eppendorfröhrchen; sicherzustellen das Rohr in Alufolie eingewickelt, um kein Licht eindringen kann.
- Mit einem sauberen, Einwegpipette, übertragen etwa 1 ml der verdünnten Essigsäure-Lösung auf das Rohr, um den Farbstoff zu lösen, leicht schütteln und halten in Folie gewickelt.
- Übertragen des solubilisierten ICG in den Becher und mit 2% (w / v) Chitosan Pulver vor dem Hinzufügen eines sterilen Magnetrührer.
- Das Becherglas mit Parafilm dann in Alufolie zu wickeln, bevor das Mischen der Inhalte bei etwa 125 UpM für 72 h bei Raumtemperatur in einer Sterilbank.
- Transferieren des Inhalts in saubere Röhrchen und Zentrifuge bei 15.000 g für 15 min bei 4 ° C zu entfernen particulate Materie.
- Transferieren es vorsichtig in die grüne SurgiLux Lösung in ein sauberes Becherglas, decken mit Parafilm dann wickeln in Silberfolie, vor dem Speichern in einem Kühlschrank für 12 Stunden, um die Viskosität der Lösung zu erhöhen.
2. Gießen SurgiLux Films
- Mit einer sterilen Spritze verzichten 8 ml des kalten SurgiLux Lösung in einem sauberen, Petrischale von 95 mm Durchmesser und leicht kippen die Platte um eine vollständige Abdeckung von der Lösung zu gewährleisten. Variation des Verhältnisses von Volumen der Lösung zum Gießen Bereich erlaubt die Kontrolle der Schichtdicke, siehe Abbildung 1.
- Entfernen Sie alle sichtbaren Luftblasen in der Lösung mit der Spitze einer sterilen Nadel. Decken Sie die Schale in Alufolie und in einem Kühlschrank, um alle restlichen Mikrometergröße Luftblasen zu entfernen.
- Nach 20 min vorsichtig die Petrischale aus dem Kühlschrank, in einem Laminarströmungshaube decken mit Silberfolie und lassen Sie die Lösung für 3 Wochen verdampfen.
- Nach Kosolute Verdampfung des Gastes die äußeren Kanten der klaren grünen SurgiLux Film in der Petrischale und sanft "Schale" des Films vom Gericht Oberfläche.
- Die SurgiLux Film sollte flexibel und leicht ohne Reißen oder Brechen manipuliert.
- Bewahren Sie die kreisförmige SurgiLux Filme in der Petrischale in Silberfolie unter trockenen Bedingungen verpackt bis zur Verwendung.
3. Laser Aktivierung SurgiLux Klebefolien
- Um den Laser Aktivierung zeigen, verwenden wir ein Stück Rindergewebe wie Steak geschnitten zu einer Größe von 15 mm Breite und 20 mm Länge. Präparieren des Gewebes in einer geraden Linie unter Verwendung eines Number 10 chirurgischen Klinge, um zwei Stücke von 15 × 10 mm zu erzeugen.
- Angleichung der zwei Gewebestücke so daß ihre Kanten sich berühren aber nicht überlappen, und mit einem Wattestäbchen oder Gaze, sanft absorbieren überschüssiges Fluid.
- Dann schneiden Sie ein Stück SurgiLux Film 7 x 9 mm und vorsichtig die Folie in Längsrichtung über die halbierten pIECE von Gewebe; drücken Sie dann vorsichtig mit einem trockenen Wattestäbchen.
- SurgiLux Filme werden aktiviert Verwendung eines Infrarot-Diodenlaser bei einer Einstellung von 120 mW. Da es sich um eine Klasse IIIB Laser, sollten geeignete Sicherheitsmaßnahmen zu treffen, einschließlich der Verwendung von geeigneten Schutzbrille für alle Mitarbeiter sein.
- Ab in die Ecke, bestrahlen die SurgiLux mit einem Infrarot-Laser bei 120 mW eingestellt und eine Fleckgröße von 1 mm Durchmesser. Übergeben der Strahlfleck über den grünen Folie bei einer Geschwindigkeit von etwa 1 mm pro Sekunde. Wiederholen Sie die Bestrahlung zwei weitere Male.
4. Stärke der Reparatur
- Vorsichtig sichern die Enden des Gewebes in den Klemmbacken einer Zugprüfmaschine Instrument. Wir verwenden ein Instron Mini55 System mit einer 50 Newton Kraftmessdose. Die maximale Last, Zugfestigkeit und Bruchdehnung wurden unter Verwendung Bluehill Computersoftware (USA). Mittel aus mindestens 10 Proben wurden bestimmt (n = 10).
- Nehmen Sie die "slack"und dann Trennen der Gewebeteile mit einer Geschwindigkeit von 1 mm pro Sekunde, bis die beiden Teile des Gewebes miteinander durch die SurgiLux Streifens vollständig getrennte gehalten.
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Representative Results
Zentrifugation führt zu einem transparenten grüne Lösung, die Viskosität steigt nach Lagerung bei 4-6 ° C. Nach einer Standzeit von 3 Tagen, die grüne Lösung in einen transparenten Film grünen SurgiLux etwa 20 Mikron dick umgewandelt wird und, wie in dem Video gezeigt, ist leicht flexibel.
Bei Bestrahlung mit dem Laser, die SurgiLux Film-Bindungen an das Gewebe. Dies kann an den Rändern des Films, wo das Gewebe scheint zusammenziehen wie der Laserstrahl über die Folie (2) beobachtet werden. Kein Verkohlung oder Ablation des Gewebes und Film sollte beobachtet werden. Die Bindungsstärke SurgiLux zum Gewebe sollte ausreichend sein, um die halbierte Gewebestücke heben, und wenn die Zugfestigkeit gemessen wird, sollte ca. 15 KPa für den Test über die hier berichtet wird.
Tabelle 1. </ Strong> Vergleich der Eigenschaften für vorgeschlagene SurgiLux und kommerziell erhältlichen Fibrin und Cyanacrylat chirurgische Klebstoffe.
Abbildung 1 Schematische Darstellung des SurgiLux dünne Klebefilm Herstellung und Aktivierung;.. Entsprechend dem Protokoll Text Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2 Fotografisches (x20), die die dünnen Films nach SurgiLux Laseraktivierung eingehalten Rinderdarm Gewebe und "öffentlichen" in das Gewebe Einschnitt (T A, T B:. Separate Stücke of Gewebe I: Einschnitt, S: SurgiLux Film).
Abbildung 3 Graph zeigt Gewebeadhäsion Stärken für verschiedene Klebstoffe:. Chitosan und SurgiLux Folien aufgebracht auf Gewebe, Tisseel (Fibrin) und Histoacryl Gele (Cyanacrylat) auf das Gewebe aufgetragen.
Abbildung 4 Rasterelektronenmikroskopaufnahmen (REM) darstellt, die an Zellen SurgiLux Filme;. Menschlichen Zelllinien (a) olfaktorischen einhüllende Zellen [x1.5k], (b) Stromafibroblasten [x500], und (c) abgeleitet Skelettmuskel Satelliten Stammzellen [x1.7k]. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 5. Schaubild, das die Veränderung der Filmdicke mit zunehmender SurgiLux Lösungsgießen Volumen (ml) und einer konstanten Gießbereich (7,09 x 10 3 mm 2).
Abbildung 6. Rasterelektronenmikrographie (SEM) der Folie, welches das Vorhandensein von 'Nippel' (SN), die von der Oberfläche (S).
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Discussion
Chitosan kann in einer Vielzahl von Molekulargewichten und mit unterschiedlichen Graden an deactylation (DDA) erhalten werden. Variationen in Chitosan Reinheit kann auf das Vorhandensein von Partikeln in der SurgiLux Lösung führen; Zentrifugation wird verwendet, um diese zu beseitigen und sollte in einem transparenten grüne Lösung führen. Allerdings können auch die Filtration als zusätzlichen oder alternativen Herstellungsschritt verwendet werden. Wie bei jedem Materialbearbeitung, Variationen, wie Chitosan DDA und Molekulargewicht haben Auswirkungen auf die physikalisch-chemischen, biologischen und materiellen Eigenschaften der resultierenden SurgiLux Filme, darunter der Stärke ihrer Bindung an Gewebe.
Der Herstellungsprozess für SurgiLux eine beträchtliche Bandbreite. Beispielsweise Veränderungen des Verhältnisses Lösungsvolumen auf Gießoberfläche Bereich (ml: 2 mm) verwendet werden, um die Filmdicke einzustellen 5 zeigt eine lineare Erhöhung in der Dicke der endgültigen SurgiLux Filme als das Volumen.der Lösung in der Petrischale gegossen wurde erhöht. Ähnlich können Modifikationen an der Gießoberfläche zur des Films Oberflächenmorphologie modifizieren. Abbildung 6 zeigt die Anwesenheit von Mikrometergröße 'Nippel' auf der Oberfläche des Films SurgiLux. Solche Matrizenmittel Techniken verwendet werden können, um verschiedene Oberflächen zu erzeugen, um Gewebe Haftung zu verbessern, zu verhindern mikrobiellen Zellanheftung und fördern Gewebe Reintegration werden. 11 Ferner können verschiedene biologisch aktive Wirkstoffe in den Herstellungsprozess eingebunden werden, um eine Klebefolie für regionale Arzneimittelabgabe erzeugen. 10
Tabelle 1 fasst die Vorteile dieser SurgiLux Dünnfilm Klebstoffsystem gegenüber herkömmlichen Fibrin und Cyanacrylat-Klebstoffen. Während die Festigkeit der Reparatur von Gewebe weniger als Nahtmaterial, vermeidet SurgiLux die zahlreichen Nachteile dieser klassischen Wundverschluß Technik sowie der aktuellen bevorzugten kommerziellen chirurgischen Klebstoffen.
Die Fähigkeit von SurgiLux zu binden verschiedenen Kollagengewebe mit seinem Material Flexibilität kombiniert schlagen sein Potenzial in der Laparoskopie, während die Vielseitigkeit des Herstellungsprozesses fördert die weitere Entwicklung für Anwendungen im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich einen Zuschuss von der National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC # 1000674) zu LJR Foster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Indocyanine Green | Sigma-Aldrich | I2633 | Also known as Cardiogreen |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm) | CNI Lasers | Fc-808 | Variable system up to 5 W power |
| Laser safety glasses | CNI Lasers | LS-G | |
| Tensile testing apparatus | Instron Pty Ltd | 5542 | 50 N load cell |
References
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