Summary
Tillverkningen av en roman, flexibel tunn film kirurgiskt klister från FDA godkända ingredienser, kitosan och indocyaningrön beskrivs. Bindning av detta bindemedel för kollagenartad vävnad genom en enkel process för aktivering med en låg effekt infraröd laser visas.
Abstract
Suturer är en 4.000 år gammal teknik som förblir "guldstandard" för sårtillslutning på grund av sin styrka reparation (~ 100 kPa). Emellertid kan suturer verka som en nidus för infektion och i många förfaranden är oförmögna att åstadkomma sårläkning eller störa funktionell vävnadsregenerering. 1 Kirurgiska lim och bindemedel, såsom de baserade på fibrin och cyanoakrylater, har utvecklats som alternativ till suturer för reparation av sådana sår. De nuvarande kommersiella lim har också betydande nackdelar, allt från virus och prioner överföring och en bristande reparation styrka som med fibrinlim, till vävnadstoxicitet och en brist på biokompatibilitet för cyanoakrylat lim. Vidare, för närvarande tillgängliga kirurgiska bindemedel tenderar att vara gel-baserade och kan ha förlängts härdningstider vilket begränsar deras tillämpning. 2 Likaså kan användningen av UV-lasrar underlättar tvärbindande mekanismer i protein-eller albumin "solders "kan leda till skador på DNA, medan laser vävnad svetsning (LTW) predisponerar termisk skada på vävnader. 3 Trots sina nackdelar, lim och LTW har fångat cirka 30% av den sårförslutning marknaden rapporteras vara över 5 miljarder dollar per år, en betydande bevis på behovet av suturfri teknik. 4
I jakten på suturfri teknik vi har använt kitosan som biomaterial för att utveckla en flexibel, tunn film, laser-aktiverad kirurgisk lim kallas "SurgiLux". Denna nya bioadhesiva använder en unik kombination av biomaterial och fotonik som FDA godkända och framgångsrikt används i en mängd olika biomedicinska tillämpningar och produkter. SurgiLux övervinner alla nackdelarna med suturer och aktuella kirurgiska lim (se tabell 1).
I denna presentation rapporterar vi det relativt enkelt protokoll för tillverkning av SurgiLux och visadess laseraktivering och vävnad svetshållfasthet. SurgiLux filmer följer kollagen vävnad utan kemisk modifiering såsom tvärbindning och genom bestrålning med en jämförelsevis låg-powered (120 mW) infraröd laser istället för UV-ljus. Kitosan filmer har en naturlig, men svag klister attraktion till kollagen (~ 3 kPa), betonar laseraktivering av kitosan baserade SurgiLux filmer styrkan i denna vidhäftning genom polymer kedjan interaktioner till följd av övergående termisk expansion. 5 Utan denna "aktivering" process , är SurgiLux filmer lätt avlägsnas. 6-9 SurgiLux har testats både in vitro och in vivo på en mängd vävnader inklusive nerv, tarm, dura mäter och hornhinna. I samtliga fall visade god biokompatibilitet och försumbar termisk skada som en följd av bestrålning. 6-10
Protocol
1. Beredning av SurgiLux lösning
- Bered en 2% (v / v) lösning av ättiksyra med avjoniserat vatten i en ren glasbägare, använd en huva laminärt flöde för att undvika kontaminering.
- Väg 0,02% (vikt / volym) av kromoforen, indocyaningrönt, ICG, i ett sterilt Eppendorf-rör, se röret lindas i silver folie för att förhindra ljuspenetrering.
- Använd en ren, engångspipett, överför ca 1 ml av den utspädda ättiksyralösningen till röret att upplösa färgämnet, skaka försiktigt och hålla inslagna i aluminiumfolie.
- Överför den solubiliserade ICG i bägaren och tillsätt 2% (vikt / vol) av kitosan pulver innan tillsats av en steril magnetisk omrörare.
- Täck bägaren med Parafilm linda sedan i silver folie, före blandning av innehållet vid ca 125 rpm under 72 timmar vid rumstemperatur i ett dragskåp med laminärt flöde.
- Överför innehållet i rena centrifugrör och centrifugera vid 15.000 x g under 15 minuter vid 4 ° C för att avlägsna eventuella particulate frågan.
- Töm den gröna SurgiLux lösningen i en ren glasbägare, täcka med Parafilm sedan packa i silver folie, innan du förvarar i kylskåp i 12 timmar för att öka viskositeten hos lösningen.
2. Gjutning av SurgiLux filmer
- Med användning av en steril spruta, dispensera 8 ml av den kalla SurgiLux lösningen i en ren, petriskål med 95 mm diameter, och försiktigt luta plattan för att säkerställa fullständig täckning av lösningen. Variera förhållandet lösningen volym till gjutning område medger reglering av filmens tjocklek, se figur 1.
- Avlägsna eventuella synliga bubblor i lösningen med hjälp av spetsen på en steril nål. Täck skålen i silver folie och lägg i kylskåp för att ta bort eventuella kvarvarande micron stora bubblor.
- Efter 20 minuter försiktigt bort petriskål från kylskåpet, placera i ett laminärt flöde huva, täck med silverfolie och lämna lösningen avdunsta i 3 veckor.
- Efter complete avdunstning, poäng ytterkanter den klara gröna SurgiLux film i petriskål och försiktigt "skal" filmen bort från skålen yta.
- Den SurgiLux Filmen bör vara flexibel och lätt manipuleras utan att riva eller brista.
- Förvara de cirkulära SurgiLux filmerna i petriskålen inslagna i silver folie på torrt väglag tills produkten ska användas.
3. Laser Aktivering av SurgiLux Adhesive Films
- För att demonstrera processen laseraktivering kommer vi att använda en bit av bovin vävnad, såsom biff skars till en storlek av 15 mm bredd och 20 mm längd. Dissekera vävnad i en rät linje med användning av en nummer 10 kirurgiskt blad, för att producera 2 stycken 15 med 10 mm.
- Ungefärlig de två bitar av vävnad så att deras kanter vidrör men inte överlappande, och använda en bomullspinne eller gasväv, försiktigt absorbera överflödig vätska.
- Därefter skär en bit SurgiLux filmen 7 x 9 mm och noggrant placera filmen längden över Halverat pIECE av vävnad, tryck därefter försiktigt med en torr bomullspinne.
- SurgiLux filmer aktiveras med en infraröd diodlaser vid en inställning av 120 mW. Eftersom detta är en klass IIIB laser bör lämpliga säkerhetsåtgärder vidtas, inklusive användning av lämpliga skyddsglasögon för all personal.
- Starta i hörnet, bestråla SurgiLux med en infraröd laser inställd på 120 mW och en strålpunkt storlek på 1 mm i diameter. Passera strålpunkten över den gröna filmen med en hastighet av ungefär 1 mm per sekund. Upprepa bestrålningsprocessen två gånger.
4. Styrka Reparation
- Försiktigt säkra ändarna av vävnaden i klämmorna hos en draghållfasthet testinstrument. Vi använder en Instron Mini55 system med en 50 Newton belastningscell. Den maximala belastningen, draghållfasthet och förlängning vid brott beräknades med användning Bluehill datorprogramvara (USA). Medel från minst 10 prover bestämdes (n = 10).
- Ta upp den "slappa"och sedan separera vävnadsbitar med en hastighet av 1 mm per sekund, tills de två bitar av vävnad hålls samman av SurgiLux remsan separata helt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Centrifugering leder till en transparent grön lösning, vilket ökar viskositeten efter lagring vid 4-6 ° C. Efter att ha stått i 3 veckor, är den gröna lösningen omvandlas till en transparent grön SurgiLux film ca 20 mikrometer tjockt och, som visas i videon är lätt flexibel.
Vid bestrålning med lasern, att SurgiLux filmen bindningarna till vävnaden. Detta kan observeras vid kanterna av filmen där vävnaden tycks ihop som laserstrålen passerar över filmen (figur 2). Ingen förkolning eller ablation av vävnaden och film bör observeras. Bindningsstyrkan av SurgiLux till vävnaden bör vara tillräcklig för att lyfta de halverade bitar av vävnad, och när draghållfastheten mätes bör vara ungefär 15 kPa för testet rapporteras här.
Tabell 1. </ Strong> Jämförelse av egenskaper för föreslagna SurgiLux system och kommersiellt tillgängligt fibrin och cyanoakrylat kirurgiska lim.
Figur 1 Schematisk illustration av SurgiLux tunn film självhäftande tillverkning och aktiveringsprocessen,.. Motsvarande protokoll texten Klicka här för att se större bild .
Figur 2 Fotografi (x20) som visar den tunna SurgiLux filmen efter laseraktivering följs nötkreatur tarmen vävnad och "upphandlande" i vävnaden snittet (T A, T B:. Separata delar of vävnad, I: snitt, S: SurgiLux film).
Figur 3 Diagram som visar styrka vävnadsadhesion för olika lim:. Chitosan och SurgiLux filmer tillämpas på vävnad, Tisseel (fibrin) och Histoacryl geler (cyanoakrylat) tillämpas på vävnad.
Figur 4 svepelektronmikrofotografier (SEM) visar celler fästa till SurgiLux filmer,. Humana cellinjer (a) olfaktoriska ensheathing celler [x1.5k], (b) stromala fibroblaster [x500], och (c) skelettmuskel härledda satellit stamceller [x1.7k]. Klicka här för att se större bild .
Figur 5. Diagram som visar förändringen i filmtjocklek med ökande SurgiLux lösning gjutning volym (ml) och en konstant gjutning område (7,09 x 10 3 mm 2).
Figur 6. Svepelektronmikrofotografi (SEM) av film som visar närvaron av "nipplar" (SN) skjuter ut från ytan (S).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kitosan kan erhållas i en mängd olika molekylvikter och med olika grader av deactylation (DDA). Variationer i kitosan renhet kan leda till förekomsten av partiklar i SurgiLux lösning, centrifugering används för att eliminera dessa och bör resultera i en genomskinlig grön lösning. Emellertid kan filtreringen även användas som en extra eller alternativt tillverkningssteg. Som med alla material bearbetning, variationer, såsom kitosan DDA och molekylvikt, har konsekvenser för de fysiokemiska, biologiska och materiella egenskaperna hos de resulterande SurgiLux filmerna, inklusive styrkan i bindning till vävnad.
Tillverkningsprocessen för SurgiLux möjliggör stor variation. Till exempel, ändringar i förhållandet mellan lösningens volym till gjutning ytarea (ml: mm 2) kan användas för att justera filmtjocklek Figur 5 visar en linjär ökning av tjockleken slutliga SurgiLux filmer som volymen.lösning hälldes i petriskålen ökades. Likaså, kan modifieringar av gjutytan kan användas för att modifiera filmens yta morfologi. Figur 6 visar närvaron av mikron-storlek "nipplar" på ytan av SurgiLux filmen. Sådana mönsterbildande tekniker kan användas för att framställa olika ytor för att förbättra vävnadsadhesion, förhindra mikrobiell cellvidhäftning och främja vävnad återintegrering. 11 Vidare kan olika biologiskt aktiva medel kan införlivas i tillverkningsprocessen för att åstadkomma en adhesiv film för regional läkemedelsavgivning. 10
Tabell 1 sammanfattar fördelarna med denna SurgiLux tunnfilm limsystem jämfört med konventionell fibrin och cyanoakrylatlim. Medan styrka vävnadsreparation är mindre än suturer, undviker SurgiLux de många nackdelarna med denna traditionella sårtillslutning teknik liksom de nuvarande gynnade kommersiella kirurgiska lim.
Förmåga SurgiLux att binda olika kollagenartade vävnader i kombination med dess materiella flexibilitet antyder sin potential i laparoskopi, medan mångsidighet tillverkningsprocessen främjar den fortsatta utvecklingen för applikationer i vävnadsteknik och regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna erkänner ett stipendium från National Health and Medical Research Council i Australien (NHMRC # 1.000.674) till LJR Foster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Indocyanine Green | Sigma-Aldrich | I2633 | Also known as Cardiogreen |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm) | CNI Lasers | Fc-808 | Variable system up to 5 W power |
| Laser safety glasses | CNI Lasers | LS-G | |
| Tensile testing apparatus | Instron Pty Ltd | 5542 | 50 N load cell |
References
- Kjaergard, H. K. Suture support: is it advantageous. Am. J. Surg. 182, 15S-20S (2001).
- Lauto, A., Mawad, D., Foster, L. J. R. Adhesive biomaterials for tissue reconstruction. J. Chem. Tech. Biotech. 83, 464-472 (2008).
- Fung, L. C., Mingin, G. C., Massicotte, M., Felsen, D., Poppas, D. P. Effects of temperature on tissue thermal injury and wound strength after photochemical wound closure. Lasers Surg. Med. 25, 285-290 (1999).
- Piribo, Glues & Sealants: Industry Background Report. , (2005).
- Lauto, A., Hook, J., Doran, M., Camacho, F., Poole-Warren, L. A., Avolio, A., Foster, L. J. R. Chitosan adhesive for laser tissue-welding: in vitro characterisation. Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).
- Lauto, A., Stoodley, M., Marcel, H., Avolio, A., Sarris, M., McKenzie, G., Sampson, D. D., Foster, L. J. R. In vitro and in vivo tissue repair with laser-activated chitosan adhesive. Lasers Surg. Med. 39, 19-27 (2007).
- Lauto, A., Foster, L. J. R., Avolio, A., Sampson, D., Raston, C., Sarris, M., McKenzie, G., Stoodley, M. Sutureless Nerve Repair with Laser-Activated Chitosan Adhesive: A Pilot in vivo Study. J. Photomed. Laser. Surg. 26 (3), 227-234 (2008).
- Marçal, H., Badylak, S. F., Sellaro, T. L., Lauto, A., Foster, L. J. R., Mahler, S. The coalescence of decellularized tissue scaffolds, laser-activated chitosan bioadhesive and olfactory ensheathing cells for tissue repair and regeneration of the spinal cord. Lasers Med. Sci. 23 (1), 96 (2008).
- Foster, L. J. R., Thomson, K., Marcal, H., Butt, J., Watson, S., Wakefield, D. A chitosan-vancomycin composite biomaterial as a laser activated surgical adhesive with regional antimicrobial activity. Biomacromolecules. 11 (12), 3563-3570 (2010).
- Shahbazi, J., Marcal, H., Watson, S., Wakefield, D., Sarris, M., Foster, L. J. R. Sutureless sealing of penetrating corneal wounds using a laser-activated thin film adhesive. Lasers Surg. Med. , accepted 15/05/2011 Forthcoming.
- Meyers, M. A., Chen, P. -Y., Lin, A. Y. -M., Seki, Y. Biological materials: Structure and mechanical properties. Prog. Mater. Sci. 53 (1), 1-206 (2008).
