Summary
הייצור של רומן, הדבק גמיש סרט דק כירורגית ממרכיבי ה-FDA אשרו, chitosan וירוק indocyanine מתואר. מליטה של דבק זה לרקמת collagenous באמצעות תהליך הפעלה פשוט עם ליזר נמוך מופעל אינפרא אדום הפגינה.
Abstract
תפרים הם טכנולוגיה ישנה 4000 שנה שתישאר "זהב הסטנדרטי" לסגירת פצע מכוח כוח תיקונם (~ 100 kPa ב). עם זאת, תפרים יכולים לפעול כnidus לזיהום ובנהלים רבים אינם מסוגלים לחולל תיקון פצע או להפריע לשיקום רקמות פונקציונליים. 1 דבקי כירורגים ודבקים, כגון אלה המבוססים על פיברין וcyanoacrylates, פותחו כתחליף לתפרים ל התיקון של פצעים כאלה. עם זאת, דבקים מסחריים נוכחיים יש גם חסרונות משמעותיים, החל מהעברת נגיפים ופריונים וחוסר כוח התיקון כמו עם דבקי הפיברין, לרעילות רקמה וחוסר biocompatibility לדבקים המבוססים cyanoacrylate. יתר על כן, דבקים כירורגיים זמינים כרגע נוטים להיות מבוסס ג'ל ויכולים הרחיבו זמני ריפוי המגבילים את יישומם. 2 באופן דומה, השימוש בלייזרי UV כדי להקל על מנגנוני צלב מקשר-ב 'סול המבוסס על חלבון או אלבומיןders 'יכול להוביל לניזק לדנ"א בזמן ריתוך רקמות ליזר (LTW) לתשומת ניזק תרמי לרקמות. 3 למרות החסרונות, הדבקים וLTW כבשו כ 30% משוק סגירת הפצע דיווחו להיות בעודף של 5 מליארד דולרים ארה"ב לשנה, עדות משמעותית לצורך בטכנולוגית sutureless. 4
במרדף האחר טכנולוגית sutureless יש לנו מנוצלים chitosan כחומר ביולוגי לפיתוח סרט גמיש, דק, דבק ניתוחי ליזר הופעל מכונה 'SurgiLux'. bioadhesive רומן זה משתמש בשילוב ייחודי של חומרים ביולוגיים ופוטוניקה שאשרו ה-FDA ושמש בהצלחה במגוון רחב של יישומים ומוצרים ביו. SurgiLux מתגבר על כל החסרונות הקשורים לתפרים ודבקים כירורגיים שוטפים (ראה טבלה 1).
במצגת זו אנו מדווחים פרוטוקול פשוט יחסית עבור הייצור של SurgiLux ולהפגיןהפעלתה הליזר וכוח ריתוך רקמות. סרטי SurgiLux לדבוק רקמת collagenous ללא שינוי כימי כגון צלב קישור ודרך הקרנה באמצעות (120 MW) ליזר אינפרא אדום נמוך יחסית מונע במקום אור UV. סרטי Chitosan יש משיכת דבק טבעית, אבל חלשה לקולגן (~ 3 kPa ב), הפעלת ליזר של chitosan המבוססים SurgiLux הסרטים מדגישה את כוחה של הידבקות זה דרך אינטראקציות שרשרת פולימר כתוצאה מהתפשטות תרמית חולפת. 5 ללא תהליך זה 'הפעלה' , סרטי SurgiLux יוסרו בקלות. 6-9 SurgiLux נבדק במבחנת in vivo על מגוון רקמות כוללים עצב, מעי, מאטר וקרנית דורה. בכל המקרים שהוכיח biocompatibility טוב וניזק תרמי זניח כתוצאה מקרינה. 6-10
Protocol
1. הכנת פתרון SurgiLux
- הכן את פתרון 2% (v / v) של חומצה אצטית באמצעות מי deionized בכוס זכוכית נקיה; להשתמש ברדס זרימה למינרית כדי למנוע זיהום.
- שוקל 0.02% (w / v) של chromophore, indocyanine ירוק, ICG, בצינור אפנדורף סטרילית, ולהבטיח את הצינור עטוף בנייר כסף כדי למנוע חדירת אור.
- באמצעות פיפטה נקיה, חד פעמית, להעביר כ 1 מ"ל של תמיסת החומצה אצטית המדוללת לצינור להמסת הצבע, ללחוץ בעדינות ולשמור עטופים בנייר כסף.
- העברת ICG solubilized לתוך הכוס ולהוסיף 2% (w / v) של אבקת chitosan לפני הוספת stirrer מגנטי סטרילי.
- לכסות את הכוס בParafilm אז לעטוף בנייר כסף, לפני שערבבתי את התוכן בכ 125 סל"ד במשך 72 שעות בטמפרטורת חדר ובברדס זרימה למינרית.
- מעביר את התוכן לתוך צינורות צנטריפוגות נקיים וצנטריפוגות ב15000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C כדי להסיר כל particulaעניין טה.
- בזהירות להעביר את פתרון SurgiLux הירוק לתוך כוס זכוכית נקיה, לכסות באמצעות Parafilm אז לעטוף בנייר כסף, לפני האחסון במקרר למשך 12 שעות כדי להגדיל את הצמיגות של הפתרון.
2. ליהוק של SurgiLux סרטים
- שימוש במזרק סטרילי, לוותר על 8 מ"ל של פתרון SurgiLux הקר לתוך צלחת נקיה, פטרי בקוטר מ"מ 95, ובעדינות להטות את הצלחת כדי להבטיח כיסוי מלא של הפתרון. משנה את היחס בין נפח פתרון לאזור יציקה מאפשרת שליטה בעובי הסרט, ראה איור 1.
- הסר את כל בועות גלויות בפתרון באמצעות קצה מחט סטרילית. מכסה את התבנית בנייר כסף ומניחים במקרר כדי להסיר כל בועות שיורית בגודל מיקרון.
- לאחר 20 דקות להסיר בזהירות את צלחת פטרי מהמקרר, מקום במכסת מנוע זרימה למינרית, מכסה בנייר כסף ולהשאיר את הפתרון להתאדות למשך 3 שבועות.
- לאחר שיתוףאידוי mplete, ניקוד הקצוות החיצוניים של סרט SurgiLux הירוק והצלול בצלחת הפטר ובעדינות "לקלף" את הסרט ממשטח הצלחת.
- סרט SurgiLux צריך להיות גמיש ומניפולציות בקלות מבלי לקרוע או לשבור.
- אחסן את סרטי SurgiLux המעגליים בצלחת פטרי עטופים בנייר כסף בתנאים יבשים עד לשימוש.
3. הפעלת ליזר של סרטי SurgiLux הדבקים
- כדי להדגים את תהליך הפעלת הליזר נשתמש פיסת רקמת בקר כגון סטייק לחתוך לגודל של 15 מ"מ רחב ואורך 20 מ"מ. מנתח את הרקמה בקו ישר באמצעות סכין כירורגית מספר 10, כדי לייצר 2 חתיכות של 15 על ידי 10 מ"מימ.
- מקורב לשתי החתיכות של רקמות, כך שקצותיהם נוגעים אך לא חופפים, ובאמצעות קיסם אוזניים או גזה, בעדינות לקלוט את כל נוזלים עודפים.
- בשלב בא, לחתוך חתיכת סרט SurgiLux 7 x 9 מ"מ ואורכו למקם את הסרט בזהירות על פני עמ 'החצויiece של רקמה, ולאחר מכן לחץ כלפי מטה בעדינות עם צמר גפן יבש.
- סרטי SurgiLux מופעלים באמצעות דיודת ליזר אינפרא אדום בהגדרה של 120 mW. היות שמדובר בליזר IIIB כיתה, אמצעי בטיחות המתאימה יש לנקוט, ובכלל זה השימוש במשקפי בטיחות המתאימים לכל האדם.
- החל בפינה, תקרין SurgiLux עם ליזר אינפרא אדום נקבע על 120 mW וגודל נקודת קרן בקוטר 1 מ"מ. להעביר את מקום אלומת האור על הסרט הירוק בשיעור של כ 1 מ"מ לשנייה. חזור על תהליך ההקרנה פעמים נוספות.
4. כוחו של התיקון
- זהירות להבטיח את הקצוות של הרקמה במהדק של כלי בדיקת מתיחה. אנחנו משתמשים במערכת Mini55 Instron עם תא 50 ניוטון עומס. העומס המרבי, חוזק מתיחה, והסיומת בהפסקה חושבו באמצעות תוכנת מחשב Bluehill (ארה"ב). אמצעים מלפחות 10 דגימות נקבעו (n = 10).
- קח את 'הרפוי'ולאחר מכן להפריד את חלקי רקמות בשיעור של 1 מ"מ לשנייה, עד ששתי פיסות רקמה שהוחזקו יחד ברצועה הנפרדת לחלוטין SurgiLux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צנטריפוגה מובילה לפתרון שקוף ירוק, דבר המגדיל את הצמיגות לאחר אחסון ב4-6 ° C. לאחר שעמד במשך 3 שבועות, פתרון הירוק הופך לסרט SurgiLux ירוק שקוף מיקרון כ 20 עבה ו, כפי שמודגם בוידאו, הוא בקלות גמישה.
לאחר ההקרנה עם הליזר, את קשרי סרט SurgiLux לרקמות. כך ניתן לראות בקצוות של הסרט שבו מופיעה הרקמה להתכווץ כקרן הליזר עוברת על הסרט (איור 2). לא חריכה או אבלציה של הרקמה וסרט צריכה להיות שנצפתה. הכח המלכד של SurgiLux לרקמה צריך להיות מספיק כדי להרים את החלקים המבותרים של רקמה, וכאשר חוזק המתיחה נמדד צריך להיות כ 15 kPa במבחן דיווח כאן.
טבלת 1. </ Strong> השוואה של מאפיינים עבור מערכת SurgiLux מוצעת והפיברין הזמין מסחרי ודבקים כירורגיים cyanoacrylate.
איור 1 איור Diagrammatic של פברוק SurgiLux סרט הדק הדבק ותהליך הפעלה;.. המקביל לטקסט הפרוטוקול לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2 צילום (x20) המציג את סרט SurgiLux הדק לאחר הפעלת ליזר דבקה ברקמת מעי שור ו'מתקשרים 'לחתך הרקמה (T, T-B:. חלקים נפרדים o רקמת F, אני: חתך, S: SurgiLux סרט).
איור 3 גרף מראה חוזק הידבקות רקמות לדבקים שונים:. סרטי SurgiLux מיושם על רקמה, Tisseel (פיברין) וג'לי Histoacryl (cyanoacrylate) מיושם על רקמת Chitosan ו.
איור 4 סריקה micrographs אלקטרונים (SEM) הממחיש תאים המחוברים לסרטים; SurgiLux. שושלות תאי אדם (א) תאי ensheathing ריח [x1.5k], (ב) פיברובלסטים סטרומה [X500] ותאי גזע, (ג) שמקורם בשרירי שלד לווין [X1.7k]. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
ילדה = "jove_content" fo: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 5. גרף המציג את השינוי בעובי סרט עם הגדלת נפח SurgiLux פתרון ליהוק (מ"ל) ואזור ליהוק קבוע (7.09 x 10 3 מ"מ 2).
איור 6. סריקת האלקטרונים מיקרוסקופ (SEM) של סרט שמראה נוכחות "הפטמות" (SN) הבולטות מפני השטח (S).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chitosan ניתן להשיג במגוון משקלים מולקולריים ועם דרגות שונות של deactylation (DDA). וריאציות על טוהר chitosan עלולות להוביל לנוכחות של חלקיקים בפתרון SurgiLux; צנטריפוגה משמשת לחסל אלה ואמורים לגרום פתרון ירוק שקוף. עם זאת, סינון יכול לשמש גם כצעד ייצור נוסף או חלופי. כמו בכל עיבוד חומרים, וריאציות, כגון chitosan DDA ומשקל מולקולרי, יש השלכות על מאפייני physiochemical, הביולוגיים וחומריים של סרטי SurgiLux תוצאה, כולל כוח של מליטתו לרקמות.
תהליך הייצור עבור SurgiLux מאפשר לשונות ניכרות. לדוגמה, שינויים ביחס נפח פתרון לשטח ליהוק (מ"ל: מ"מ 2) יכולים להיות מנוצלים כדי להתאים את עובי סרט איור 5 מראה גידול ליניארי בעובי של סרטי SurgiLux סופיים כנפח.של הפתרון שפכו לתוך צלחת פטרי היה גבוה יותר. כמו כן, שינויים במשטח היציקה ניתן להשתמש כדי לשנות את מורפולוגיה השטח של הסרט. איור 6 מציג את נוכחותו של "פטמות" בגודל מיקרון על פני השטח של סרט SurgiLux. טכניקות בניית תבנית מסוג זה יכול להיות מנוצלות כדי לייצר משטחים שונים כדי לשפר את הידבקות רקמות, למנוע מצורף תא החיידקי ולקדם שילוב מחדש רקמות. 11 יתר על כן, סוכנים פעילים ביולוגי שונים יכולים להיות משולבים בתוך תהליך הייצור כדי לייצר סרט דבק למשלוח סמים אזוריים. 10
טבלה 1 מסכמת את היתרונות של מערכת זו SurgiLux סרט הדקה דבק הפיברין לעומת קונבנציונלי ודבקי cyanoacrylate. למרות כוחו של תיקון רקמות הוא פחות מתפרים, SurgiLux ימנע את החסרונות הרבים של טכניקה זו מסורתית פצע סגירה, כמו גם את הדבקים המסחריים המועדפים נוכחי כירורגיות.
היכולת של SurgiLux לרקמות שונות collagenous אג"ח בשילוב עם גמישות החומר שלו מציעה את הפוטנציאל שלה בלפרוסקופיה, תוך הצדדי של תהליך הייצור מקדמת את המשך התפתחותו ליישומים בהנדסת רקמות ורפואת רגנרטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
החוקרים מכירים במענק הלאומית לבריאות והמועצה למחקר הרפואי של אוסטרליה (NHMRC # 1000674) לLJR פוסטר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Indocyanine Green | Sigma-Aldrich | I2633 | Also known as Cardiogreen |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm) | CNI Lasers | Fc-808 | Variable system up to 5 W power |
| Laser safety glasses | CNI Lasers | LS-G | |
| Tensile testing apparatus | Instron Pty Ltd | 5542 | 50 N load cell |
References
- Kjaergard, H. K. Suture support: is it advantageous. Am. J. Surg. 182, 15S-20S (2001).
- Lauto, A., Mawad, D., Foster, L. J. R. Adhesive biomaterials for tissue reconstruction. J. Chem. Tech. Biotech. 83, 464-472 (2008).
- Fung, L. C., Mingin, G. C., Massicotte, M., Felsen, D., Poppas, D. P. Effects of temperature on tissue thermal injury and wound strength after photochemical wound closure. Lasers Surg. Med. 25, 285-290 (1999).
- Piribo, Glues & Sealants: Industry Background Report. , (2005).
- Lauto, A., Hook, J., Doran, M., Camacho, F., Poole-Warren, L. A., Avolio, A., Foster, L. J. R. Chitosan adhesive for laser tissue-welding: in vitro characterisation. Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).
- Lauto, A., Stoodley, M., Marcel, H., Avolio, A., Sarris, M., McKenzie, G., Sampson, D. D., Foster, L. J. R. In vitro and in vivo tissue repair with laser-activated chitosan adhesive. Lasers Surg. Med. 39, 19-27 (2007).
- Lauto, A., Foster, L. J. R., Avolio, A., Sampson, D., Raston, C., Sarris, M., McKenzie, G., Stoodley, M. Sutureless Nerve Repair with Laser-Activated Chitosan Adhesive: A Pilot in vivo Study. J. Photomed. Laser. Surg. 26 (3), 227-234 (2008).
- Marçal, H., Badylak, S. F., Sellaro, T. L., Lauto, A., Foster, L. J. R., Mahler, S. The coalescence of decellularized tissue scaffolds, laser-activated chitosan bioadhesive and olfactory ensheathing cells for tissue repair and regeneration of the spinal cord. Lasers Med. Sci. 23 (1), 96 (2008).
- Foster, L. J. R., Thomson, K., Marcal, H., Butt, J., Watson, S., Wakefield, D. A chitosan-vancomycin composite biomaterial as a laser activated surgical adhesive with regional antimicrobial activity. Biomacromolecules. 11 (12), 3563-3570 (2010).
- Shahbazi, J., Marcal, H., Watson, S., Wakefield, D., Sarris, M., Foster, L. J. R. Sutureless sealing of penetrating corneal wounds using a laser-activated thin film adhesive. Lasers Surg. Med. , accepted 15/05/2011 Forthcoming.
- Meyers, M. A., Chen, P. -Y., Lin, A. Y. -M., Seki, Y. Biological materials: Structure and mechanical properties. Prog. Mater. Sci. 53 (1), 1-206 (2008).
