Summary
De vervaardiging van een nieuwe, flexibele dunne film chirurgische kleefmiddel van FDA goedgekeurde ingrediënten, chitosan en indocyaninegroen beschreven. Binding van deze lijm collageenachtig weefsel via een eenvoudige activeringsproces met een laag vermogen infrarode laser wordt aangetoond.
Abstract
Hechtingen zijn een 4.000 jaar oude technologie die nog de 'gouden standaard' voor wondsluiting op grond van hun reparatie sterkte (~ 100 kPa). Echter, hechtingen als een infectiehaard voor infectie en in vele procedures zijn niet wondheling te bewerkstelligen of functionele weefselregeneratie verstoren. Een chirurgische lijmen, zoals die op basis van fibrine en cyanoacrylaten, zijn ontwikkeld als alternatief voor hechtingen voor de reparatie van dergelijke wonden. De huidige commerciële hechtmiddelen ook aanzienlijke nadelen, van virale en prion overdracht en een gebrek aan reparatie sterkte met fibrinelijmen te weefseltoxiciteit en een gebrek aan biocompatibiliteit van het cyanoacrylaat gebaseerde kleefstoffen. Bovendien beschikbaar chirurgische kleefmiddelen vaak gel gebaseerd zijn en zijn uitgebreid hardingstijden die hun toepassing beperken. Twee Ook het gebruik van UV lasers om verknoping mechanismen eiwit gebaseerde of albumine 'sol vergemakkelijkenders 'kan leiden tot DNA-schade, terwijl laser weefsel lassen (LTW) predisponeert thermische schade aan weefsels. 3 Ondanks hun nadelen, kleefstoffen en LTW hebben gevangen ongeveer 30% van de wondsluiting markt naar verluidt meer dan US $ 5 miljard per jaar, een significant bewijs van de noodzaak van hechtingen technologie. 4
In het streven hechtingen technologie hebben we gebruik chitosan als biomateriaal voor de ontwikkeling van een flexibele, dunne film, laser-geactiveerde chirurgische kleefmiddel zogenaamde "SurgiLux. Deze nieuwe bioadhesieve met een unieke combinatie van biomaterialen en optische die FDA goedgekeurd en succesvol gebruikt in verschillende biomedische toepassingen en producten. SurgiLux overwint de nadelen van hechtingen en huidige chirurgische lijm (zie tabel 1).
In deze presentatie rapporteren wij de relatief eenvoudige protocol voor de vervaardiging van SurgiLux en tonende laser activering en weefsel lassterkte. SurgiLux films zich aan collageenachtig weefsel zonder chemische modificatie zoals vernetten en door bestraling met een relatief laag vermogen (120 mW) infrarood laser in plaats van UV licht. Chitosan films hebben een natuurlijke maar zwak hechtende aantrekkingskracht collageen (~ 3 kPa), laser activering van de chitosan gebaseerde films SurgiLux benadrukt de kracht van deze hechting door polymeerketen interactie als gevolg van transiënte thermische uitzetting. 5 Zonder deze activering 'proces worden SurgiLux films gemakkelijk verwijderd. SurgiLux 6-9 is getest zowel in vitro en in vivo een verscheidenheid van weefsels zoals zenuw, darm, dura mater en cornea. In alle gevallen aangetoond goede biocompatibiliteit en verwaarloosbare thermische schade als gevolg van bestraling. 6-10
Protocol
1. Bereiding van SurgiLux Solution
- Bereid een 2% (v / v) oplossing van azijnzuur met gedeïoniseerd water in een schoon glazen bekerglas met een laminaire stroming kap te voorkomen.
- Weeg 0,02% (w / v) van de chromofoor, indocyaninegroen, ICG, in een steriele Eppendorf buis waarborgen de buis gewikkeld in zilverfolie eventuele lichtinval voorkomen.
- Met een schone, wegwerp pipet ongeveer 1 ml van de verdunde azijnzuuroplossing de buis aan de kleurstof op te lossen, schud en verpakt in folie houden.
- Breng het opgeloste ICG in het bekerglas en voeg 2% (w / v) van chitosan poeder vóór het toevoegen van een steriel magnetische roerder.
- Bedek het bekerglas met Parafilm wikkel in zilverfolie, vóór het mengen van de inhoud bij ongeveer 125 rpm gedurende 72 uur bij kamertemperatuur in een laminaire stroming kap.
- Breng de inhoud in schone centrifugebuis en centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C op een particula verwijderente stof.
- Zorgvuldig de groene SurgiLux oplossing over in een schone glazen beker met betrekking Parafilm vervolgens in zilver wikkel, voor opslag in de koelkast gedurende 12 uur om de viscositeit van de oplossing te verhogen.
2. Gieten van SurgiLux Films
- Gebruik een steriele injectiespuit, afzien 8 ml van de koude SurgiLux oplossing in een schone, petrischaal van 95 mm diameter, en Kantel de plaat om volledige dekking te verzekeren door de oplossing. Variëren van de verhouding van volume oplossing te gieten gebied maakt controle van de filmdikte, zie figuur 1.
- Verwijder alle zichtbare luchtbellen in de oplossing met de punt van een steriele naald. Dek de schotel in zilverfolie en plaats in de koelkast om eventueel resterende microscopisch kleine belletjes te verwijderen.
- Na 20 minuten verwijder voorzichtig de petrischaal uit de koelkast, in een laminaire stroming kap, dek af met zilverfolie en laat de oplossing te verdampen gedurende 3 weken.
- Na complete verdamping, de score van de buitenste randen van de heldere groene SurgiLux film in de petrischaal en voorzichtig 'schil' van de film uit de buurt van de schotel oppervlak.
- De SurgiLux film moet flexibel en gemakkelijk gemanipuleerd zonder scheuren of breken.
- Sla de cirkelvormige SurgiLux films in de petrischaal verpakt in zilverfolie bij droge condities tot aan gebruik.
3. Laser Activering van SurgiLux lijmfilms
- Om de laser activeringsproces te tonen zullen we gebruik maken van een stuk van runderen weefsel, zoals biefstuk gesneden tot een grootte van 15 mm breed en 20 mm lang. Prepareer het weefsel in een rechte lijn met een chirurgisch mes Number 10, tot 2 stukken van 15 produceren door 10 mm.
- Onderlinge aanpassing van de twee stukken weefsel, zodat de randen elkaar raken maar niet overlappen, en met behulp van een wattenstaafje of gaasje voorzichtig absorberen het overtollige vocht.
- Daarna, snijd een stukje van SurgiLux film 7 x 9 mm en zorgvuldig de film de lengte plaatst de overkant van de doorsneden pIECE van weefsel; zet vervolgens zachtjes druk met een droog wattenstaafje.
- SurgiLux films worden geactiveerd met behulp van een infrarood-diode laser op een instelling van 120 mW. Aangezien dit is een klasse IIIB laser, dienen passende veiligheidsmaatregelen worden genomen, met inbegrip van het gebruik van geschikte veiligheidsbril voor alle personeelsleden.
- Beginnend in de hoek, bestralen de SurgiLux met een infrarood laser ingesteld op 120 mW en een straal puntgrootte van 1 mm diameter. Langs de bundelvlek over de groene film met een snelheid van ongeveer 1 mm per seconde. Herhaal de bestraling proces nog twee keer.
4. Sterkte van de Reparatie
- Zorgvuldig Bevestig de uiteinden van het weefsel in de klauwen van een trektesten instrument. We gebruikt een Instron Mini55 systeem met een 50 Newton load cell. De maximale belasting, treksterkte en breukrek zijn bepaald met Bluehill computer software (USA). Middelen van ten minste 10 monsters werden bepaald (n = 10).
- Neem de 'slack'en scheiden weefselstukken met een snelheid van 1 mm per seconde, totdat de twee stukjes weefsel bijeengehouden door SurgiLux strip volledig gescheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Centrifugeren tot een transparante groene oplossing die viscositeit toeneemt na opslag bij 4-6 ° C. Na staan gedurende 3 weken de groene oplossing wordt omgezet in een transparante groene SurgiLux film 20 micrometer dik en, zoals in de video, gemakkelijk flexibel.
Bij bestraling met de laser, de SurgiLux film bindingen met het weefsel. Dit kan worden waargenomen aan de randen van de film waar het weefsel lijkt krimpen waardoor de laserstraal passeert de film (figuur 2). Geen verkoling of ablatie van het weefsel en de film moet in acht worden genomen. De bindingssterkte van SurgiLux het weefsel moet voldoende zijn om de doorsneden stukjes weefsel heffen, en wanneer de treksterkte gemeten moet ongeveer 15 KPa voor de proef die hier zijn.
Tabel 1. </ Strong> Vergelijking van eigenschappen voor de voorgestelde SurgiLux systeem en in de handel verkrijgbare fibrine en cyanoacrylaat chirurgische kleefstoffen.
Figuur 1 Schematische weergave van de SurgiLux dunne film lijm fabricage en activering proces;.. Die overeenkomt met het protocol tekst Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2 Foto (x20) met de dunne SurgiLux film na laseractivering gehandeld op grond van runderen darm weefsel en "contractpartij" in het weefsel incisie (T A, T B:. Afzonderlijke stukken of weefsel, I: incisie, S: SurgiLux film).
Figuur 3 Grafiek toont weefselverklevingen sterktes voor verschillende lijmen:. Chitosan en SurgiLux films toegepast op weefsel, Tisseel (fibrine) en Histoacryl gels (cyanoacrylaat) toegepast op weefsel.
Figuur 4 Rasterelektronenmicrografieën (SEMS) illustreert cellen aan SurgiLux films;. Humane cellijnen (a) olfactorische cellen ensheathing [x1.5k], (b) stromale fibroblasten [x500], en (c) skeletspier afgeleide stamcellen satelliet [x1.7k]. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. Grafiek die de verandering van de filmdikte bij toenemende SurgiLux oplossing casting volume (ml) en een constant gebied casting (7,09 x 10 3 mm 2).
Figuur 6. Aftastelektronmicrofoto (SEM) van de film toont de aanwezigheid van tepels (SN) uitsteken vanaf het oppervlak (S).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chitosan kan worden verkregen in een verscheidenheid van molecuulgewichten en met verschillende graden van deacetylering (DDA). Variaties in chitosan zuiverheid kan leiden tot de aanwezigheid van deeltjes in de oplossing SurgiLux, centrifugeren wordt gebruikt om deze te elimineren en moet resulteren in een transparante groene oplossing. Echter, filtratie ook gebruikt worden als een extra of alternatieve fabricage stap. Zoals bij elke materiaalbewerking, variaties, zoals chitosan en DDA molecuulgewicht hebben voor de fysiochemische, biologische en materiaaleigenschappen van de resulterende SurgiLux films, inclusief de sterkte van de binding aan weefsel.
Het fabricageproces voor SurgiLux kan aanzienlijke variatie. Bijvoorbeeld veranderingen aan de verhouding van volume oplossing te gieten oppervlak (ml: mm 2) kan worden gebruikt om de filmdikte te passen Figuur 5 toont een lineaire toename van de dikte van de uiteindelijke SurgiLux films als volume.oplossing gegoten in een petrischaal werd verhoogd. Ook kunnen wijzigingen in het aandrukoppervlak worden gebruikt om de film oppervlaktemorfologie wijzigen. Figuur 6 toont de aanwezigheid van microscopisch kleine tepels 'op het oppervlak van SurgiLux film. Dergelijke template technieken kunnen worden gebruikt om verschillende oppervlakken te produceren weefsel hechting voorkomen microbiële celhechting en bevorderen weefsel reïntegratie. 11 Voorts kunnen diverse biologisch actieve middelen worden opgenomen in het fabricageproces om een adhesieve film te produceren voor regionale geneesmiddelafgifte 10.
Tabel 1 geeft de voordelen van deze SurgiLux dunne film lijmsysteem vergelijking met conventionele fibrine en cyanoacrylaatlijmen. Terwijl de sterkte van weefselherstel minder dan hechtingen SurgiLux vermijdt vele nadelen van deze traditionele wondsluiting techniek en de huidige commerciële begunstigde chirurgische kleefmiddelen.
Het vermogen van SurgiLux te binden verschillende collagene weefsels combinatie met de materiaalflexibiliteit suggereert het potentieel in laparoscopie, terwijl de veelzijdigheid van het fabricageproces bevordert de verdere ontwikkeling voor toepassingen in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs erkennen een subsidie van de National Health and Medical Research Council van Australië (NHMRC # 1000674) aan LJR Foster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Indocyanine Green | Sigma-Aldrich | I2633 | Also known as Cardiogreen |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm) | CNI Lasers | Fc-808 | Variable system up to 5 W power |
| Laser safety glasses | CNI Lasers | LS-G | |
| Tensile testing apparatus | Instron Pty Ltd | 5542 | 50 N load cell |
References
- Kjaergard, H. K. Suture support: is it advantageous. Am. J. Surg. 182, 15S-20S (2001).
- Lauto, A., Mawad, D., Foster, L. J. R. Adhesive biomaterials for tissue reconstruction. J. Chem. Tech. Biotech. 83, 464-472 (2008).
- Fung, L. C., Mingin, G. C., Massicotte, M., Felsen, D., Poppas, D. P. Effects of temperature on tissue thermal injury and wound strength after photochemical wound closure. Lasers Surg. Med. 25, 285-290 (1999).
- Piribo, Glues & Sealants: Industry Background Report. , (2005).
- Lauto, A., Hook, J., Doran, M., Camacho, F., Poole-Warren, L. A., Avolio, A., Foster, L. J. R. Chitosan adhesive for laser tissue-welding: in vitro characterisation. Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).
- Lauto, A., Stoodley, M., Marcel, H., Avolio, A., Sarris, M., McKenzie, G., Sampson, D. D., Foster, L. J. R. In vitro and in vivo tissue repair with laser-activated chitosan adhesive. Lasers Surg. Med. 39, 19-27 (2007).
- Lauto, A., Foster, L. J. R., Avolio, A., Sampson, D., Raston, C., Sarris, M., McKenzie, G., Stoodley, M. Sutureless Nerve Repair with Laser-Activated Chitosan Adhesive: A Pilot in vivo Study. J. Photomed. Laser. Surg. 26 (3), 227-234 (2008).
- Marçal, H., Badylak, S. F., Sellaro, T. L., Lauto, A., Foster, L. J. R., Mahler, S. The coalescence of decellularized tissue scaffolds, laser-activated chitosan bioadhesive and olfactory ensheathing cells for tissue repair and regeneration of the spinal cord. Lasers Med. Sci. 23 (1), 96 (2008).
- Foster, L. J. R., Thomson, K., Marcal, H., Butt, J., Watson, S., Wakefield, D. A chitosan-vancomycin composite biomaterial as a laser activated surgical adhesive with regional antimicrobial activity. Biomacromolecules. 11 (12), 3563-3570 (2010).
- Shahbazi, J., Marcal, H., Watson, S., Wakefield, D., Sarris, M., Foster, L. J. R. Sutureless sealing of penetrating corneal wounds using a laser-activated thin film adhesive. Lasers Surg. Med. , accepted 15/05/2011 Forthcoming.
- Meyers, M. A., Chen, P. -Y., Lin, A. Y. -M., Seki, Y. Biological materials: Structure and mechanical properties. Prog. Mater. Sci. 53 (1), 1-206 (2008).
