Summary
Stereotaxic kirurgi på gnavere giver mulighed for målrettet administration af lægemidler eller elektrisk stimulation og optagelser i vågen, opfører dyr. I denne video præsentation vil vi vise de seneste proceduremæssige justeringer af denne langvarige procedure, der med succes forbedret overlevelse sats og reduceret post-operative vægttab.
Abstract
Stereotaxic kirurgi for implantation af kanyler i bestemte områder af hjernen har i mange årtier været en meget vellykket eksperimentel teknik til at undersøge virkningerne af lokalt manipuleret neurotransmitter og signalveje i vågen, opfører dyr. Desuden har stereotaxic implantation af elektroder til elektrofysiologiske stimulering og optagelse undersøgelser været medvirkende til vores nuværende forståelse af neuroplasticitet og hjerne netværk i opfører dyr. Stadig større viden om optimering af kirurgiske teknikker i gnavere 1-4, den offentlige bevidsthed om dyrevelfærd og strengere lovgivning (fx i 2010 EU direktiv om anvendelse af forsøgsdyr 5) fået os til at finpudse disse kirurgiske procedurer, især med hensyn at gennemføre nye procedurer for oxygensupplement og løbende overvågning af blodets iltning og puls niveauer under operationen samtat indføre en standardiseret protokol for post-kirurgisk behandling. Vores observationer tyder på, at disse ændringer resulterede i en øget overlevelsesrate og en forbedring af den generelle tilstand af dyrene efter operationen (f.eks mindre vægttab og en mere aktiv dyr). Denne video præsentation vil vise de generelle procedurer, der er involveret i denne type stereotaxic kirurgi med særlig vægt på vores flere ændringer. Vi vil illustrere disse kirurgiske procedurer hos rotter, men det er også muligt at udføre denne type kirurgi i mus eller andre små forsøgsdyr ved at anvende særlige adaptere for stereotaxic apparatet 6.
Protocol
Bemærk: Antiseptisk teknikker bør anvendes under hele proceduren. Alle instrumenter og materialer (bomuld tippes svaberprøver, gaze, osv.), der vil blive brugt under operationen, bør steriliseres ved autoklavering. En kirurgisk maske, hår motorhjelm og sterile handsker bør anvendes. Arbejdsområdet og stereotaxic apparatet skal rengøres grundigt og desinficeres med en 70% ethanol opløsning.
1. Pre-kirurgiske procedurer
- Konfigurer stereotaxic apparatur og alle nødvendige materialer. Pre-varme varmepude.
- Placer kanylen i sin støtte og kontrollere, om det er lige.
- Tænd for gassystemet - blanding af omgivende luft og ilt (30-35% af det samlede flow skal være ilt).
- Vejes rotten og administrere anæstesi. Vi bruger en blanding af ketamin (37,5 mg / kg) og dexmedetomidin (0,25 mg / kg) injiceret subkutant. For forskellige anæstesi protokoller, se Flecknell 4 og Hellebrekers et al. 7.
- Når rotten mistede bevidstheden, barbere hovedet område ud fra ørerne til bare i mellem øjnene med en elektrisk barbermaskine.
- Placer rotte på varmepude, med sin næse foran luftslangen. Brug en oximeter at sikre, at rotten har et tilstrækkeligt blodets iltning niveau (bør ikke falde <90%). Følg producentens anvisninger for korrekt brug af udstyr.
- Påfør øjencreme (Duratears Z, Alcon) på begge hornhinder til at undgå dehydrering.
- Kontroller rottens reflekser (hale refleks eller tå-knibe refleks, som påvist i Walantus et al. 8) for at sikre, at det er tilstrækkeligt bedøvet. Hvis rotten fortsætter med at vise stærke reflekser, kan tilskud af anæstesi være nødvendig.
- Hvis der ikke tå-pinch refleks er vist, skal du placere rotte i stereotaxic apparatet, justere øre barer, så det viser lige læse på begge sider, og læg igen luftslangen foran dyretved at fastsætte den med næsen bar. Kontroller igen, hvis rotten viser en blodets iltning niveau på 90% eller højere. Hvis ikke, justeres enten slangen, hvilket bringer den tættere på næsen, eller øge tilførslen af ilt. Overvågning af blodets iltning niveau og puls under hele operationen.
- Løbende overvåge rottens temperatur med en rektal termometer (fortrinsvis forbundet med en varmepude) og registrere de værdier i begyndelsen og slutningen af operationen. Juster opvarmning pad eller brug et tæppe for at opretholde en kropstemperatur på 37,5 til 38,5 ° C.
2. Kirurgi
- Injicere smertestillende. Vi bruger en enkelt peri-operativ administration af carprofen (4,0 til 5,0 mg / kg subkutant). For forskellige smertestillende protokoller, se Hellebrekers et al. 7.
- Rengør barberede område af than hud fra centrum til hår perimeter tre gange med et desinfektionsmiddel (fx klorhexidin 0,5%) og lokalt indsprøjte en blanding af lidocain (20 mg / ml) og adrenalin (5 mg / ml) til lokal anæstesi og vasokonstriktion (for at undgå voldsom blødning).
- Lav en anterior-posterior snit på ca 2,5 cm på midterlinjen af hovedbunden, der går fra mellem øjnene, indtil bagsiden af ørerne. Brug 4-6 bulldog klemmer til at klemme ud af huden og til at holde snittet åbent. Fjern eventuelle, sammenfattende væv med en spatel og / eller vatpinde og rense området for at eksponere kraniet overfladen.
- Tjek om hovedet niveau: Først skal du finde Lambda og placer guide kanylen lige over dette sted, røre kraniet. Optag dorso-ventrale koordinat. Herefter sættes guide kanylen lige over Bregma, røre kraniet, og optage sin dorso-ventrale koordinat. Disse to koordinater skal være identiske. Hvis forskellen er> 0,3 mm, justere næsen bar for at rette det.
- MAKE to små huller til fastsættelse af kraniet skruer ved hjælp af en steriliseret håndboremaskine (et cirka 5 mm anterior til kanylen beliggenhed i et af de halvkugler, og de andre 5 mm posteriort for kanyle placering i den kontralaterale halvkugle). Placer to sterile skruer i disse huller, indtil de er tæt forankret, uden at blive indsat helt ind i kraniet.
- Med guide kanylen er placeret præcis på Bregma, registrere anterior-posterior og laterale koordinater. Den korrekte placering af vejledning kanyle placering for hvert område af hjernen kan beregnes ved at tilføje eller trække fra Bregma, ved hjælp af en stereotaxic atlas 9-11.
- Placer guide kanyle i sin korrekte placering, lidt røre kraniet. Optag dorso-ventrale koordinat. For bilaterale kanyle placering, find næste kanylen placering i den anden halvkugle, og igen registrere dorso-ventrale koordinat. Begge koordinater skal være identiske (eller afviger <0,3 mm).
- Mark kanylen steder på kraniet med en steril blyant og med hånden Driller, de Burr huller gør, kontrol af størrelsen og den korrekte placering ved hjælp af guiden kanyle. Når hullerne er lavet, kan du bruge en steril nål til forsigtigt Punch hjernehinden at give mulighed for uhindret indsættelse af kanyle.
- Placer kanylen i det første hul, og sænk den forsigtigt, indtil den når den endelige ventrale koordinat. Forbered dental cement-og generøst anvende det omkring kanylen og en eller begge skruer for at fastsætte kanylen. Vent, indtil cementen er tørret helt. Bagefter, fjern forsigtigt kanylen støtte ved at dreje dorso-ventral bar opad.
- Placer den anden kanyle ind i den støtte og gå til kanyle placering i den anden halvkugle. Sæt kanylen ind i hullet og gentage det forrige trin. Dæk skruer og en stor overflade af kanyler med cement, og før cementen er tør, fjern eventuelle overskud fra huden.
- Injicér varm (~ 37 ° C) sterilt saltvand (~ 10 ml / kg, sc) for at sikre rehydrering.
- Efter at cement er helt tørret, fjernes kanylen støtte og placere en steril pin i hver kanyle for at undgå tilstopning.
- Rens såret med sterilt saltvand og sutur forsiden og bagsiden af såret.
- Fjern dyret fra stereotaxic apparatet, der erstatter den gas slange foran dens næse. Fortsætte med at overvåge iltmætning niveau og kropstemperaturen.
- Hvis en injicerbar bedøvelse med dexmedetomidin anvendes, injicere sin antagonist atipamezol (0,25 mg / kg, sc) og vent, indtil dyret vågner op (ca. 5 minutter).
- Placer rotte ind i et opsving bur. For at undgå hypotermi, placere buret i en inkubator ved 28 ° C eller på en varmepude på et sted, hvor man kan observere dyret i mindst en time, før den returneres til vivarium rummet.
3. Post-kirurgisk behandling
- Under de første 4 dage efter operationen, overvåge rottens opsving ved at holde daglige registreringer af vægt og andre bemærkninger vedrørende betingelsen om dyret i laboratoriet logbøger eller "dyrevelfærd dagbøger".
- Dyr, der viste tydelige tegn på sygdom, infektion i såret, tab af kropsvægt eller andre tegn på nedsat trivsel skal gennemgå særlig forsigtig: f.eks en ekstra dosis analgetika for at minimere post-operative smerter, en blanding af pulver mad og vand Ud over standard Chow at stimulere rottens appetit, og / eller en subkutan injektion af saltvand til at understøtte rehydrering.
- Hvis rotten ikke udviser nogen forbedring efter disse indgreb, eller tab af kropsvægten er> 15% (i forhold til præoperativ vægt), ofrer dyret med en overdosis bedøvelse (humane end-point).
- Rotter som regel brug for at komme i mindst 7 dage før påbegyndelsen af adfærdsmæssige eksperimenter.
4. Repræsentative resultater
jove_content "> At afgøre, om de forskellige ændringer til vores kirurgiske procedure, især med hensyn til oxygensupplement og den løbende overvågning af blodets iltning niveauer, hjertefrekvens og kropstemperatur, udvidet dyrets overlevelse og forbedret sine generelle tilstand efter operationen, at vi sammenlignede ikke-overlevelse på 20 kohorter af dyr (bestående af 20 rotter hver), der blev opereret efter vi har gennemført disse ændringer med den ikke-overlevelse på 24 kohorter (20 rotter hver) betjenes med standard-protokol. Som det fremgår af figur 1a , den ikke-overlevelsen var signifikant reduceret i prøven af kohorter, der blev drevet med den ændrede protokol (P <0,05; Mann-Whitney U test, to tailed). Desuden er som vist i figur 1b, post-kirurgisk vægttab af rotter betjenes med den modificerede protokollen blev også signifikant reduceret i forhold til den af rotter betjenes med den normale procedure (post-operative dag 1: P <0,05; post-operative dag 2: P <0,01; post-operative dag 3: P = 0,17, Student t-test).
Figur 1. Effekt af kirurgiske ændringer på ikke-overlevelsesrate og post-kirurgisk vægttab. (A.) Ikke-overlevelsesrate af rotter betjenes med den modificerede protokollen som sammenlignet med rotter betjenes med en standardprotokol. De ikke-overlevelse (median ± interkvartile intervaller) blev beregnet som den procentdel af rotter pr kohorte af 20 rotter, der ikke overlever operationen. * P <0,05, Mann-Whitney U test to tailed (n = 20 kohorter for den ændrede protokol og 24 kohorter for standard-protokol). (B.) Vægttab (gennemsnit ± SEM procent af præoperativ vægt) i løbet af den første (POD1), andet (POD2) og tredje (POD3) post-operative dag. * P <0,05, ** p <0,01, Student t-test (n = 60 per gruppe).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedformålet med denne video præsentation er at gøre adfærdsmæssige neuroforskere med de grundlæggende principper for stereotaxic kirurgi. Forskere, der allerede klarer stereotaxic kirurgi kan også drage fordel af denne video og overveje nogle af de proceduremæssige justeringer til brug i deres eget laboratorium. En stadig stigende viden om optimering af kirurgiske teknikker 1-3, udvikling af nye anæstetika og analgetika til brug i human-og veterinærmedicin 4,12, den offentlige bevidsthed om dyrevelfærd og strengere lovgivning (fx i 2010 EU direktiv om anvendelse af forsøgsdyr 5) bedt os til at implementere nye procedurer for oxygensupplement og løbende overvågning af blodets iltning og puls niveauer under operationen. Vi observerede, som vist til et repræsentativt udsnit af dyrene, en samlet øget overlevelse og en signifikant reduceret postoperative vægttab.En sådan reduceret postoperative vægttab kan afspejle en mindre belastning af det kirurgiske indgreb på dyret og dermed resultere i en mere aktiv dyret umiddelbart efter indgrebet. Om det også har en gavnlig effekt på de langsigtede sundhed er ikke klart. Men en bemærkelsesværdig observation var, at fjernelse af iltforsyning midlertidigt ført til en markant og pålidelig fald i blodets iltmætning niveauer, der kunne falde endda under 50% (Se video-præsentation til en demonstration heraf). Det er tænkeligt, at langvarig utilstrækkelig blodets indhold af ilt, muligvis som forekommer i dyr, ikke forsynet med nogen oxygensupplement under operation, kan resultere i iltsvind med langsigtede adfærdsmæssige konsekvenser og også en negativ virkning på resultatet og / eller kvalitet af adfærdsmæssige eksperimenter. Vi ved ikke, om en sådan depression af ilt blodforsyning under operationen er specifik for den bedøvende protokol, der bruges i vores laboratorium (dvs. en blanding af ketamine og dexmedetomidin), eller om det er et mere generelt fænomen i forbindelse med injicerbar anæstetika. Brugen af indånding anæstesi, med en blanding af omgivende luft og ilt, der kan en alternativ metode til at overvinde depression af blod ilt niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Peter Gerrits for de tegninger, der anvendes i videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70% | VWR international | ||
| Antisedan (atipamezole) | Orion | ||
| Atropine sulfate 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Bulldog haemostatic clamp | Aesculap | ||
| Cannulas | Component Supply Co. | ||
| Chlorhexidine 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Cleaning powder | Alconox, Inc. | ||
| Cotton sticks | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (dexmedetomidine) | Orion | ||
| Drill | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Durogrip Naaldv–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm | Aesculap | ||
| Gauze | Medicomp (5x5) | ||
| Heating pad | Harvard Apparatus | ||
| Insect pins (stylets) | Entosphinx (Czech Republik) | ||
| Ketamine 10% (ketamine) | Alfasan | ||
| Micro-halsted straight tip | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter Internationl Inc. | ||
| Needles (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oximeter | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Pharmacy of the UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Scalpel blade No. 23 | Swann-Morton | ||
| Scalpelholder NR. 4 133 mm | Aesculap | ||
| Screw driver | Any Supplier | ||
| Simplex Rapid (dental cement) | Kemdent | ||
| Skull screws | Component Supply Co. | ||
| Spatula | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson & Johnson | ||
| Stereotacts | Kopf Instruments | ||
| Surgical forceps 100mm | Aesculap | ||
| Suture material Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Syringe 10 ml | Omnifix | ||
| Syringe 1ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Syringe 5ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidocaine/adrenaline) | AstraZeneca |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
