Summary
Stereotaxische operatie aan knaagdieren zorgt voor doelgerichte toediening van geneesmiddelen of elektrische stimulatie en opnamen in wakker gedragen dieren. In deze video presentatie zullen we zien de laatste procedurele verfijningen aan deze langdurige procedure die met succes een verbeterde overleving en verminderde post-operatieve gewichtsverlies.
Abstract
Stereotaxische chirurgie voor de implantatie van canules in specifieke gebieden van de hersenen is al vele decennia lang een zeer succesvolle experimentele techniek om de effecten van lokaal gemanipuleerd neurotransmitter en signaalwegen in wakker, gedragen dieren te onderzoeken. Bovendien heeft de stereotaxische implantatie van elektroden voor elektrofysiologische stimulatie en het opnemen van studies geweest voor ons huidige begrip van neuroplasticiteit en de hersenen netwerken in gedragen dieren. Steeds toenemende kennis over het optimaliseren van chirurgische technieken bij knaagdieren 1-4, voorlichting te geven over het welzijn van dieren en strenge wetgeving (bijvoorbeeld de 2010 EU-richtlijn over het gebruik van proefdieren 5) voor ons aanleiding om deze chirurgische procedures te verfijnen, met name wat betreft de uitvoering van nieuwe procedures voor toedienen van zuurstof en de continue bewaking van bloedoxygenatie en de hartslag niveaus tijdens de operatie alsde invoering van een gestandaardiseerd protocol voor post-operatieve zorg. Onze waarnemingen wijzen erop dat deze wijzigingen geresulteerd in een verhoogde overleving en een verbetering van de algemene conditie van de dieren na de operatie (bijv. minder gewichtsverlies en een meer actieve dier). Deze video presentatie zal geven van de algemene procedures die betrokken zijn bij dit type van stereotaxische chirurgie met speciale aandacht voor onze verschillende wijzigingen. We zullen illustreren deze chirurgische ingrepen bij ratten, maar het is ook mogelijk om dit type van chirurgie uit te voeren in muizen of andere kleine proefdieren met behulp van speciale adapters voor de stereotaxische apparaat 6.
Protocol
Let op: Antiseptische technieken moeten worden gebruikt tijdens de gehele procedure. Alle instrumenten en materialen (katoen-tip wattenstaafjes, gaas, etc.) die gebruikt zullen worden tijdens de operatie moet worden gesteriliseerd door autoclaveren. Een chirurgisch masker, haar muts en steriele handschoenen worden gedragen. Het werkgebied en de stereotaxische apparaat moet grondig worden gereinigd en ontsmet met een 70% ethanol-oplossing.
1. Pre-chirurgische procedures
- Stel de stereotaxische apparatuur en alle benodigde materialen. Pre-warm de verwarming pad.
- Plaats de canule in haar steun en controleer of het recht.
- Zet het gas systeem - mengsel van lucht en zuurstof (30-35% van de totale stroom moet worden zuurstof).
- Weeg de rat en het beheer van de verdoving. Wij maken gebruik van een mengsel van ketamine (37,5 mg / kg) en dexmedetomidine (0,25 mg / kg) subcutaan geïnjecteerd. Voor verschillende anesthesie-protocollen, zie Flecknell 4 en Hellebrekers et al.. 7.
- Na de rat verloor het bewustzijn, scheer het hoofd gebied gaande van de oren tot net tussen de ogen met een elektrisch scheerapparaat.
- Plaats de rat op de verwarming pad, met zijn neus in de voorkant van de luchtslang. Gebruik een oximeter om ervoor te zorgen dat de rat een adequaat bloedoxygenatie niveau (mag niet vallen <90%) heeft. Volg de instructies van de fabrikant voor een juist gebruik van apparatuur.
- Van toepassing oogcrème (Duratears Z, Alcon) aan beide hoornvliezen om uitdroging te voorkomen.
- Controleer of de rat reflexen (staart reflex of teen-snuifje reflex, zoals aangetoond in Walantus et al.. 8) om ervoor te zorgen dat deze adequaat verdoofd. Als de rat blijft een sterke reflexen, kan suppletie van de anesthesie nodig zijn.
- Als er geen toe-snuifje reflex wordt weergegeven, plaatst u de rat in de stereotaxische apparaat, past het oor bars, zodat het toont gelijk te lezen aan beide zijden, en plaats opnieuw de luchtslang in de voorkant van het dierdoor de vaststelling van het met de neus bar. Controleer nogmaals of de rat toont een bloedoxygenatie niveau van 90% of hoger. Zo niet, aanpassen of de slang, waardoor deze dichter bij de neus, of verhoging van de toevoer van zuurstof. Bewaken van de bloedoxygenatie niveau en de hartslag gedurende de operatie.
- Permanent toezicht op de rat temperatuur met een rectale thermometer (bij voorkeur aangesloten op een verwarmings-pad) en noteer de waarden aan het begin en einde van de operatie. Pas de verwarming pad of gebruik een deken om een lichaamstemperatuur van 37,5 te behouden tot 38,5 ° C.
2. Chirurgie
- Injecteer de pijnstillende. We maken gebruik van een peri-operatieve toediening van carprofen (4.0-5.0 mg / kg, subcutaan). Voor verschillende pijnstillende protocollen, zie Hellebrekers et al.. 7.
- Reinig het geschoren gebied van thij de huid van het midden naar de haren omtrek drie keer met een desinfecterend middel (bijvoorbeeld chloorhexidine 0,5%) en lokaal een mengsel van lidocaïne (20 mg / ml) en adrenaline (5 mg / ml) geïnjecteerd voor de lokale verdoving en vasoconstrictie (om te voorkomen dat overmatig bloeden).
- Maak een anterior-posterior incisie van ongeveer 2,5 cm op de middellijn van de hoofdhuid, gaande van tussen de ogen tot aan de achterkant van de oren. Gebruik 4-6 bulldog klemmen om knijpen van de huid en om de incisie te openen. Verwijder eventuele bindweefsel met een spatel en / of wattenstaafjes en reinig het gebied om de schedel oppervlak bloot te leggen.
- Controleer of het hoofd niveau: Zoek eerst Lambda en plaats de gids canule precies over deze locatie, het aanraken van de schedel. Neem de dorso-ventrale coördineren. Plaats vervolgens de gids canule precies over Bregma, het aanraken van de schedel, en neem de dorso-ventrale coördineren. Deze twee coördinaten moeten identiek zijn. Als het verschil> 0,3 mm, pas de neus balk om dit te corrigeren.
- Make twee kleine gaten voor de vaststelling van de schedel schroeven met een gesteriliseerde handboor (een ongeveer 5 mm juist voor de canule locatie in een van de hemisferen en de andere 5 mm achter de canule locatie in de contralaterale hemisfeer). Plaats twee steriele schroeven in deze gaten tot ze stevig verankerd zijn, zonder te worden opgenomen volledig in de schedel.
- Met de gids canule geplaatst precies op Bregma, noteer de anterior-posterior en lateraal coördinaten. De juiste locatie van gids canule plaatsing voor elk gebied van de hersenen kan worden berekend door het optellen of aftrekken van Bregma, met behulp van een atlas stereotaxische 9-11.
- Plaats de gids canule in de juiste locatie, licht aanraken van de schedel. Neem de dorso-ventrale coördineren. Voor de bilaterale canule plaatsing, vinden naast de canule locatie in het andere halfrond, en opnieuw opnemen van de dorso-ventrale coördineren. Beide coördinaten moeten identiek zijn (of anders <0,3 mm).
- Markeer de canule locaties op de schedel met een steriele potlood en, met de hand boormeester, maken de braam gaten, het controleren van de grootte en de juiste locatie met behulp van de gids canule. Nadat de gaten zijn gemaakt, gebruik maken van een steriele naald voorzichtig punch de hersenvliezen te zorgen voor onbelemmerd inbrengen van de canule.
- Plaats de canule in het eerste gat en voorzichtig zakken totdat hij uiteindelijk terecht bij de ventrale coördineren. Bereid de tandheelkundig cement en royaal toe te passen rond de canule en een of twee schroeven in om de canule op te lossen. Wacht tot het cement volledig is opgedroogd. Daarna, verwijder voorzichtig de canule te ondersteunen door het draaien van de dorso-ventrale bar naar boven.
- Plaats de tweede canule in de steun en ga naar de canule locatie in het andere halfrond. Plaats de canule in het gat en herhaal de vorige stap. Bedek de schroeven en een groot oppervlak van de buisjes, met het cement, en voordat het cement droog is, het eventuele overschot verwijderen uit de huid.
- Injecteren warm (~ 37 ° C) steriele zoutoplossing (~ 10 ml / kg, sc) te rehydratie te verzekeren.
- Nadat het cement volledig is gedroogd, verwijdert u de canule te ondersteunen en plaats een steriele pin in elke canule om obstructie te voorkomen.
- Reinig de wond met een steriele zoutoplossing en hechtdraad de voor-en achterkant van de wond.
- Verwijder het dier uit de stereotaxische apparaat, het vervangen van de gas-buizen voor zijn neus. Blijf de zuurstofverzadiging niveau en de lichaamstemperatuur te controleren.
- Als een injecteerbaar anestheticum met dexmedetomidine wordt gebruikt, injecteren zijn antagonist atipamezol (0,25 mg / kg, sc) en wacht tot het dier wakker wordt (ongeveer 5 minuten).
- Zet de rat in een kooi herstel. Om te voorkomen dat onderkoeling, plaats de kooi in een incubator bij 28 ° C of op een verwarmingselement in een plek waar je kunt het dier acht te nemen voor ten minste een uur, voordat hij terugkeerde naar de vivarium kamer.
3. Post-operatieve zorg
- Gedurende de eerste 4 dagen na de operatie, toezicht op de rat het herstel door het houden van de dagelijkse administratie van het gewicht en de andere opmerkingen over de toestand van het dier in het laboratorium logboeken of "het welzijn van dieren dagboeken".
- Dieren die duidelijke tekenen van ziekte, infectie van de wond, verlies van lichaamsgewicht of andere tekenen van een verminderde welzijn moeten ondergaan speciale zorg geven: bijvoorbeeld een extra dosis pijnstillers tot post-operatieve pijn, een mengsel van poeder voedsel en water te minimaliseren Naast de standaard Chow van de rat de eetlust, en / of een subcutane injectie van zoutoplossing om rehydratie ondersteuning te stimuleren.
- Als de rat vertoont geen verbetering na deze ingrepen, of het verlies van lichaamsgewicht is> 15% (in vergelijking met pre-operatie gewicht), offeren het dier met een overdosis van verdoving (humane eindpunt).
- Ratten meestal moet gedurende ten minste 7 dagen te herstellen voor de aanvang van gedragsexperimenten.
4. Representatieve resultaten
jove_content "> Om te bepalen of de verschillende wijzigingen aan onze chirurgische procedure, in het bijzonder met betrekking tot toedienen van zuurstof en de continue monitoring van bloedoxygenatie niveaus, hartslag en lichaamstemperatuur, het dier overleven uitgebreid en verbeterd de algemene conditie na een operatie, vergeleken we de niet-overlevingspercentage van 20 cohorten van dieren (bestaande uit 20 ratten per stuk) die geopereerd nadat wij deze wijzigingen uitgevoerd met de niet-overlevingskans van 24 cohorten (20 ratten elk) bediend met het standaard protocol. Zoals weergegeven in figuur 1a , de niet-overleving was significant verminderd in de steekproef van de cohorten die werd bediend met de gewijzigde protocol (P <0,05; Mann-Whitney U test, twee tailed). Bovendien, zoals is weergegeven in figuur 1b, post-operatieve gewichtsverlies van ratten bediend met de gewijzigde protocol was ook significant verminderd in vergelijking met dat van ratten bediend met de standaard procedure (post-operatieve dag 1: P <0,05; post-operatieve dag 2: P <0.01; post-operatieve dag 3: P = 0,17; Student t-tests).
Figuur 1. Effect van chirurgische wijzigingen op non-overleving en post-chirurgische gewichtsverlies. (A.) Niet-survival rate van ratten bediend met de gewijzigde protocol vergeleken met dat van ratten gebruikt met het standaard protocol. De niet-overleving (mediaan ± interkwartielafstand reeksen) werd berekend als het percentage van de ratten, per cohort van 20 ratten, die niet overleven chirurgie. * P <0,05, Mann-Whitney U test twee tailed (n = 20 cohorten voor de gewijzigde protocol en 24 cohorten voor de standaard-protocol). (B.) Gewichtsverlies (gemiddelde ± SEM als percentage van de pre-operatie gewicht) gedurende de eerste (Pod1), tweede (POD2) en derde (POD3) post-operatieve dag. * P <0,05, ** p <0,01, Student t-test (n = 60 per groep).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste doel van deze video presentatie is om gedrag neurowetenschappers vertrouwd te maken met de basisprincipes van stereotaxische chirurgie. Onderzoekers die al het uitvoeren van stereotaxische operatie kan ook profiteren van deze video en overwegen een deel van de procedurele verbeteringen voor gebruik in hun eigen laboratorium. Een steeds toenemende kennis over het optimaliseren van chirurgische technieken 1-3, de ontwikkeling van nieuwe anesthetica en analgetica voor gebruik in de humane en veterinaire geneeskunde 4,12, voorlichting te geven over het welzijn van dieren en strenge wetgeving (bijvoorbeeld de 2010 Europese Unie Richtlijn betreffende de gebruik van proefdieren 5) voor ons aanleiding om nieuwe procedures voor de toedienen van zuurstof en de continue bewaking van bloedoxygenatie en de hartslag niveaus tijdens de operatie uit te voeren. Zagen we, zoals te zien voor een representatief monster van dieren, een algemeen verhoogde overleving en een significant lagere post-operatieve gewichtsverlies.Een dergelijk verlaagd post-operatieve gewichtsverlies zou kunnen wijzen op een minder last van de chirurgische ingreep op het dier en dus resulteren in een meer actieve dier in de onmiddellijke nasleep van de operatie. Of het heeft ook gunstige effecten op de gezondheid op lange termijn is niet duidelijk. Echter, een opmerkelijke observatie was dat het verwijderen van de zuurstoftoevoer tijdelijk geleid tot een duidelijke en betrouwbare afname in het bloed zuurstofverzadiging niveaus, die zouden kunnen dalen, zelfs minder dan 50% (Zie de video presentatie voor een demonstratie hiervan). Het is denkbaar dat langdurige onvoldoende bloed van zuurstof, eventueel ook bij dieren, die niet met enig toedienen van zuurstof tijdens de operatie, kan leiden tot hypoxie met een lange-termijn gedrag gevolgen en ook een negatieve invloed hebben op de uitkomst en / of kwaliteit van gedrags experimenteren. We weten niet of een dergelijke depressie van zuurstof bloedtoevoer tijdens de operatie is specifiek voor de anesthesie protocol dat wordt gebruikt in ons laboratorium (dwz een mengsel van ketamine en dexmedetomidine) of dat het een meer algemeen fenomeen in verband met injecteerbare anesthetica. Het gebruik van inhalatie-anesthesie, met een mengsel van lucht en zuurstof, zou een alternatieve methode om de depressie van het bloed zuurstof te overwinnen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken dr. Peter Gerrits voor de tekeningen die in de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70% | VWR international | ||
| Antisedan (atipamezole) | Orion | ||
| Atropine sulfate 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Bulldog haemostatic clamp | Aesculap | ||
| Cannulas | Component Supply Co. | ||
| Chlorhexidine 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Cleaning powder | Alconox, Inc. | ||
| Cotton sticks | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (dexmedetomidine) | Orion | ||
| Drill | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Durogrip Naaldv–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm | Aesculap | ||
| Gauze | Medicomp (5x5) | ||
| Heating pad | Harvard Apparatus | ||
| Insect pins (stylets) | Entosphinx (Czech Republik) | ||
| Ketamine 10% (ketamine) | Alfasan | ||
| Micro-halsted straight tip | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter Internationl Inc. | ||
| Needles (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oximeter | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Pharmacy of the UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Scalpel blade No. 23 | Swann-Morton | ||
| Scalpelholder NR. 4 133 mm | Aesculap | ||
| Screw driver | Any Supplier | ||
| Simplex Rapid (dental cement) | Kemdent | ||
| Skull screws | Component Supply Co. | ||
| Spatula | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson & Johnson | ||
| Stereotacts | Kopf Instruments | ||
| Surgical forceps 100mm | Aesculap | ||
| Suture material Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Syringe 10 ml | Omnifix | ||
| Syringe 1ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Syringe 5ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidocaine/adrenaline) | AstraZeneca |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
