Summary
げっ歯類での定位手術は動物の行動を、目を覚ましに薬物の標的投与や電気刺激やレコーディングが可能になります。このビデオプレゼンテーションでは、この長年の手順その成功生存率向上と縮小手術後の体重減少に、最近の手続き型の改良を紹介します。
Abstract
特定の脳領域へのカニューレの移植のための定位手術は何十年も目を覚まし、行動を動物に局所的に操作する神経伝達物質やシグナル伝達経路の効果を調べるために非常に成功した実験的な手法となっている。さらに、電気生理学的刺激と記録の研究のための電極の定位注入は、動物の振る舞いにおける神経可塑性と脳のネットワークの私達の現在の理解に役立っている。げっ歯類1-4、動物福祉の問題に関する国民意識と厳格な法律（例えば、実験動物5の使用に関する2010年欧州連合（EU）の指令）の手術手技の最適化について、増え続ける知識は特に関連して、これらの外科的処置を絞り込むために私たちを促しただけでなく、手術中の酸素補給のための新しい手順や血液の酸素と心拍数のレベルの連続監視を実装する手術後のケアのための標準化プロトコルを導入する。我々の観察では、これらの変更が増加生存率と手術後の動物の一般状態（例えば、以下の体重減少とより積極的な動物）の改善をもたらしたことを示している。このビデオプレゼンテーションでは、私たちのいくつかの変更に特別な注意と定位手術のこのタイプに関係する一般的な手順が表示されます。我々は、ラットではこれらの外科的処置を説明しますが、それは定位固定装置6の特別なアダプタを使用して、マウスまたは他の小実験動物に手術のこのタイプを実行することも可能です。
Protocol
注：消毒技術はプロシージャ全体を通して採用する必要があります。手術中に使用されるすべての楽器と材料（綿棒、ガーゼなど）はオートクレーブで滅菌する必要があります。手術用マスク、髪のボンネットと滅菌手袋を着用してください。作業領域と定位固定装置は、徹底的に清掃し、及び70％エタノール溶液で消毒する必要があります。
1。術前の手続き
- 定位固定装置と必要なすべてのマテリアルを設定します。プレ暖かい暖房パッド。
- そのサポートにカニューレを配置し、それがまっすぐであるかどうか確認して下さい。
- ガスシステムの電源をONしてください - 周囲の空気と酸素の混合物（総流量の30〜35パーセントは酸素でなければなりません）。
- ラットを秤量し、麻酔剤を投与する。私たちは、ケタミン（37.5 mg / kg体重）とデクスメデトミジン（0.25 mg / kg）を皮下注射の混合物を使用しています。異なる麻酔プロトコルの場合、Flecknell 4 Hellebrekerを参照してください。S ら。7。
- ラットが意識を失った後、耳からだけで電気かみそりと目の間にしようと頭の面積を削る。
- エアチューブの前でその鼻で、加温パッド上にラットを置きます。ラットは、十分な血液の酸素化のレベルを（<90％を削除してはいけません）があることを確認するために酸素濃度計を使用しています。機器の適切な使用については、製造元の指示に従ってください。
- 脱水症状を避けるために、両方の角膜の眼クリーム（Duratears Z、アルコン）を適用します。
- それは十分に麻酔であることを保証するためにラットの反射神経（尾反射またはつま先-ピンチの反射、などのWalantus ら 8で示した）を確認してください。ラットは強い反射を示すために続ける場合、麻酔の補充が必要になることがあります。
- 動物の前でエアチューブを何つま先-ピンチの反射が表示されていない場合は、定位固定装置にラットを置き、それが両側に同じ読みが表示されるように耳のバーを調整し、再配置鼻のバーでそれを固定すること。ラットが90％以上の血液の酸素化のレベルを示している場合、もう一度確認してください。されていない場合は、鼻に近づけるもたらす、どちらチューブを調整する、または酸素の流量を増加させる。手術中の血液の酸素化レベルと心拍数を監視します。
- 継続的に直腸温度計（優先的に加熱パッドに接続されている）とラットの温度を監視し、手術の最初と最後に値を記録します。加熱パッドを調整するか、38.5に37.5体温を維持するために毛布を使用して℃に
2。手術
- 鎮痛剤を注入する。我々は、カルプロフェンのシングル周術期管理を（4.0〜5.0 mg / kg体重、皮下）を使用している。別の鎮痛剤のプロトコルについては、Hellebrekers ら7を参照してください。
- tの剃毛面積を清掃彼消毒剤を使って、中心からの髪の周囲に皮膚三回（例えば、クロルヘキシジン0.5％）と局所的に防止するために局所麻酔と血管収縮（のためにリドカイン（20 mg / mlの）とアドレナリン（5 mg / ml）の混合物を注入過度の出血）。
- 耳の裏まで、両眼の間から行く、頭皮の正中線上に約2.5cmの前後切開を加えます。肌をピンチオフすると切開を開いたまま4〜6ブルドッグクランプを使用してください。へらおよび/または綿棒を持つ任意の論理積組織を取り出して、頭蓋骨の表面を露出する面積を掃除。
- ヘッドが水平になっているかどうかを確認します：まず、ラムダを見つけて、正確にこの場所を介してガイドカニューレを置いて、頭蓋骨に触れる。背腹座標を記録します。次に、頭蓋骨に触れて、正確にブレグマ上のガイドカニューレを挿入して、その背腹座標を記録する。これら2つの座標は同一である必要があります。違いは> 0.3mmである場合、それを修正するために鼻のバーを調整します。
- M滅菌ハンドドリル（反対側の半球でカニューレの位置の後方半球と他の5 mmのいずれかでカニューレの位置に前方one約5 mm）を使用して頭蓋骨のネジを固定するためのAKE二つの小さな穴。それらがしっかりと固定されるまで完全に頭蓋骨に挿入されることなく、これらの穴に2本の滅菌のネジを置きます。
- ブレグマで正確に配置されたガイドカニューレで、前後と横方向の座標を記録する。各脳の領域のためのガイドカニューレの配置の正しい場所は、脳地図9-11助けを借りて、ブレグマから加算または減算することによって計算することができます。
- わずかに頭蓋骨に触れ、その正しい場所にガイドカニューレを置きます。背腹座標を記録します。二国間カニューレを配置するため、他の半球でカニューレの位置次を検索、そして再び背腹座標を記録する。両方の座標は（または<0.3 mmの異なる）同じにする必要があります。
- 手のドリラーで、滅菌鉛筆で頭蓋骨にカニューレの位置をマークすると、ガイドカニューレの助けを借りて、サイズと正しい場所を確認し、バリの穴を作成します。穴が行われると、静かにカニューレの遮るもののない挿入を可能にする髄膜を開ける滅菌針を使用してください。
- 最初の穴にカニューレを配置し、それが最後の腹側の座標に到達するまで、慎重に下ろします。歯科用セメントを準備し、寛大にカニューレを固定するためにカニューレと、1つまたは両方のネジの周りにそれを適用します。セメントが完全に乾くまで待ちます。その後、慎重に背腹バーを上方向に回して、カニューレのサポートを削除します。
- サポートへの2番目のカニューレを置き、他の半球のカニューレの位置に移動します。穴にカニューレを置き、前の手順を繰り返します。ネジとセメントとカニューレの大きな面を覆う、そしてセメントが乾燥する前に、皮膚からの剰余金を削除する。
- 注入暖かい（〜37 ° C）補水を確保するために滅菌生理食塩水（〜10 ml / kgを、SC）。
- セメントが完全に乾いた後、カニューレのサポートを削除し、閉塞を防ぐために各カニューレに無菌のピンを配置。
- 滅菌生理食塩水で創傷面積を清掃し、フロントと傷の背中を縫合。
- その鼻の前にガスチューブを交換し、定位固定装置から動物を取り外します。酸素飽和度のレベルと体温を監視し続ける。
- デクスメデトミジンと注射麻酔薬が使用されている場合は、その拮抗薬のatipamezoleを注入（0.25 mg / kgの、SC）と動物が目覚める（約5分）まで待ちます。
- 回復のケージにラットを置きます。低体温を避けるために、ビバリウムの部屋にそれを返す前に、少なくとも1時間のために動物を観察できる場所で28℃でまたは加熱パッド上にインキュベーターにケージを置きます。
3。手術後のケア
- 中手術後の最初の4日間、体重と実験室の日誌や"動物福祉の日記"における動物の状態に関する他の観察の日々の記録を保つことによって、ラットの回復を監視する。
- 病気の明白な徴候を示す動物、傷の感染、体重や福利削減の他の徴候の損失は、特別なケアを受ける必要があります：手術後の痛みを最小限に抑えるために鎮痛薬の余分線量を、例えば、粉の食物と水の混合液を標準固形飼料に加えて、水分補給をサポートするために、ラットの食欲、および/または生理食塩水の皮下注射を刺激する。
- ラットではこれらの介入後に改善、または体重の損失が表示されない場合は犠牲が麻酔薬の過剰摂取（人道的エンドポイント）を持つ動物、（手術前の体重に比べて）> 15％です。
- ラットは、通常、行動実験の開始前に少なくとも7日間で回復する必要があります。
4。代表的な結果
jove_content"特に酸素補給と血中酸素濃度、心拍数と体温の継続的なモニタリングに関して、私たちの外科手術への様々な変更かどうかを判断するには>、強化された動物の生存率と手術後に全身状態を改善し、我々は比較我々は標準プロトコルで動作24のコホート（20匹ずつ）の非生存率はこれらの変更を実装した後に手術を受けた動物の20コホートの非生存率（20ラットそれぞれで構成される）。図1aに示すように、非生存率が大幅に変更されたプロトコル（P <0.05、Mann - WhitneyのU検定、二つの両側）で運転されたコホートのサンプルで減少した。また、図1b、手術後の体重減少のに表示されている修正されたプロトコルで操作したラットのもかなりのような標準的な手順（術後1日目で運転ラットのそれに比べて減少した：P <0.05、術後2日目：P <0.01、術後3日目：P = 0.17、スチューデントt検定）。
図1非生存率や手術後の体重減少に対する外科的改変の影響。標準プロトコルで動作ラットのそれと比較して変更されたプロトコルで動作ラットの（A.）非生存率。非生存率は、（中央値±四分位範囲）手術を生存しなかったラット20匹、のコホートごとに、ラットの割合として算出した。 * P <0.05、Mann - WhitneyのU検定両側二つ（変更プロトコルと標準プロトコルのための24のコホートにn = 20のコホート）。最初の（POD1）、秒（POD2）とサード（POD3）術後日中（B.）体重減少（手術前の重量の割合として平均± SEM）。 * P <0.05、** P <0.01、スチューデントt -検定（N = 60あたりのグループ）。
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Discussion
このビデオプレゼンテーションの主な目的は、定位手術の基本原則と行動の神経科学を理解することです。すでに定位手術を行っている研究者はまた、このビデオの恩恵を受けると、自分の研究室で使用するための手続きの改良のいくつかを検討するかもしれない。手術手技1-3を最適化する方法についてますます知識、人間と獣医学4,12、国民意識に関する動物福祉の問題と厳格な法律（例えば、上の2010年欧州連合（EU）の指令で使用するための新しい麻酔薬や鎮痛薬の開発実験動物の使用5）私たちは酸素の補給、手術時の血液の酸素化および心拍数のレベルの継続的な監視のための新しい手続きを実施するように指示。動物の代表的なサンプル、全体的な生存率の増加率と有意に減少した外科手術後の体重減少のために示されるように我々は、観察。このような縮小手術後の体重減少は小さい動物の外科手術の負担と、その結果、手術の直後でより積極的な動物の結果を反映しているかもしれません。それはまた、長期的な健康に有益な効果を持っているかどうかは明らかではない。しかし、驚くべき観察は、酸素供給を削除すると、一時的に（デモ本契約のためのビデオプレゼンテーションを参照）、50％を下回る可能性が血中酸素飽和濃度の著しいと信頼性の低下につながったということでした。それは酸素の長期不十分な血中濃度は、おそらく手術中に酸素補給が設けられていない動物に発生するとして、長期的な行動の結果を伴う低酸素症を引き起こす可能性があるとも否定的に行動実験の結果および/または品質に影響を与えることが考えられる。我々は、手術中の酸素の血液供給のようなうつ病は、我々の研究室で使用される麻酔プロトコル（すなわち、ketamiの混合物に固有であるかどうかわからないNEとデクスメデトミジン）またはそれは注射麻酔に関連するより一般的な現象であるかどうか。吸入麻酔の使用は、周囲の空気と酸素の混合物で、血中酸素濃度のうつ病を克服する別の方法かもしれません。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ビデオで使用されている図面の博士ピーターGerritsに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70% | VWR international | ||
| Antisedan (atipamezole) | Orion | ||
| Atropine sulfate 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Bulldog haemostatic clamp | Aesculap | ||
| Cannulas | Component Supply Co. | ||
| Chlorhexidine 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Cleaning powder | Alconox, Inc. | ||
| Cotton sticks | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (dexmedetomidine) | Orion | ||
| Drill | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Durogrip Naaldv–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm | Aesculap | ||
| Gauze | Medicomp (5x5) | ||
| Heating pad | Harvard Apparatus | ||
| Insect pins (stylets) | Entosphinx (Czech Republik) | ||
| Ketamine 10% (ketamine) | Alfasan | ||
| Micro-halsted straight tip | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter Internationl Inc. | ||
| Needles (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oximeter | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Pharmacy of the UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Scalpel blade No. 23 | Swann-Morton | ||
| Scalpelholder NR. 4 133 mm | Aesculap | ||
| Screw driver | Any Supplier | ||
| Simplex Rapid (dental cement) | Kemdent | ||
| Skull screws | Component Supply Co. | ||
| Spatula | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson & Johnson | ||
| Stereotacts | Kopf Instruments | ||
| Surgical forceps 100mm | Aesculap | ||
| Suture material Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Syringe 10 ml | Omnifix | ||
| Syringe 1ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Syringe 5ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidocaine/adrenaline) | AstraZeneca |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
