Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Gnagare Stereotaxic Kirurgi och välbefinnande Förbättringar Utfall för Behavioral Neuroscience

Published: January 30, 2012 doi: 10.3791/3528

Summary

Stereotaxic kirurgi på gnagare möjliggör riktad behandling med läkemedel eller elektrisk stimulering och inspelningar i vaken, beter djur. I den här videon presentationen kommer vi att visa de senaste processuella förbättringar av denna långvariga förfarande som framgångsrikt förbättrat överlevnad och minskad postoperativ viktminskning.

Abstract

Stereotaxic operation för implantation av kanyler in i specifika delar av hjärnan har under många decennier varit en mycket framgångsrik experimentell teknik för att undersöka effekterna av lokalt manipulerade neurotransmittorer och signalvägar i vaken, beter djur. Dessutom har stereotaxic implantation av elektroder för elektrofysiologiska stimulans och studier inspelning varit avgörande för vår nuvarande förståelse av neuroplasticitet och nätverk hjärnan beter djur. Ständigt ökande kunskap om optimering av kirurgiska tekniker hos gnagare 1-4, allmänhetens medvetenhet om djurskydd och strängare lagstiftning (t.ex. 2010 EU direktiv om användning av försöksdjur 5) fick oss att förfina dessa kirurgiska ingrepp, särskilt med avseende att genomföra nya rutiner för syre tillskott och kontinuerlig övervakning av blodets syresättning och hjärtat nivåer takt under operationen samtinföra ett standardiserat protokoll för postoperativa vården. Våra observationer tyder på att dessa ändringar resulterade i en ökad överlevnad och en förbättring av det allmänna tillståndet av djuren efter operationen (t.ex. mindre viktminskning och en mer aktiv djur). Denna video presentation kommer att visa den allmänna förfarandena i denna typ av stereotaxic kirurgi med särskild hänsyn till våra flera ändringar. Vi kommer att belysa dessa kirurgiska ingrepp hos råttor, men det är också möjligt att utföra denna typ av kirurgi hos möss eller andra smådjur laboratorium med hjälp av speciella adaptrar för stereotaxic apparater 6.

Protocol

Obs: Antiseptisk tekniker bör användas under hela proceduren. Alla instrument och material (bomullspinne kompresser, gasväv, etc.) som kommer att användas under operation bör steriliseras genom autoklavering. En kirurgisk mask, hår motorhuv och sterila handskar. Arbetsområdet och stereotaxic apparaten ska rengöras noggrant och desinficeras med ett 70% etanol.

1. Pre-kirurgiska ingrepp

  1. Sätt upp stereotaxic apparater och allt material som behövs. Förvärma värmedyna.
  2. Placera kanyl i sitt stöd och kontrollera om det är rakt.
  3. Slå på gassystem - blandning av luft och syrgas (30-35% av det totala flödet bör syre).
  4. Väg råttan och administrera bedövningsmedel. Vi använder en blandning av ketamin (37,5 mg / kg) och dexmedetomidin (0,25 mg / kg) injiceras subkutant. För olika anestesi protokoll, se Flecknell 4 och Hellebrekers et al. 7.
  5. Efter råttan förlorade medvetandet, raka huvudet området går från öronen för att bara mellan ögonen med en elektrisk rakapparat.
  6. Placera råttan på värmedyna, med nosen framför luftslangen. Använd en oximeter att se till att råttan har en adekvat nivå blodets syresättning (bör inte släppa <90%). Följ tillverkarens anvisningar för korrekt användning av utrustningen.
  7. Applicera Eye Cream (Duratears Z, Alcon) på båda hornhinnor för att undvika uttorkning.
  8. Kontrollera råttans reflexer (svans reflex eller toe-nypa reflex, som visats i Walantus et al. 8) för att säkerställa att den är tillräckligt sövd. Om råttan fortsätter att visa starka reflexer, kan tillskott av anestesi behövas.
  9. Om ingen toe-nypa reflex visas, placera råttan i stereotaxic apparaten, justera örat barer så att den visar samma läsning på båda sidor och plats igen luftslangen framför djuretgenom att fastställa den med näsan bar. Kontrollera igen om råttan visar en nivå blodets syresättning på 90% eller högre. Om inte, justera antingen slangen, föra den närmare näsan, eller öka flödet av syre. Övervaka nivån blodets syresättning och puls under hela operationen.
  10. Kontinuerligt följa råttans temperaturen med en rektal termometer (företrädesvis kopplad till en värmedyna) och registrera värdena i början och slutet av operationen. Justera värmedyna eller använda en filt för att hålla en kroppstemperatur på 37,5 till 38,5 ° C.

2. Kirurgi

  1. Injicera smärtstillande. Vi använder samma peri-operativ administrering av karprofen (4,0-5,0 mg / kg subkutant). För olika smärtstillande protokoll, se Hellebrekers et al. 7.
  2. Rengör rakade området tHan hud från centrum till hår omkrets tre gånger med ett desinfektionsmedel (t ex klorhexidin 0,5%) och lokalt injicera en blandning av lidokain (20 mg / ml) och adrenalin (5 mg / ml) för lokalbedövning och vasokonstriktion (för att förhindra kraftig blödning).
  3. Gör en främre-bakre snitt på ca 2,5 cm på mittlinjen i hårbotten, som går från mellan ögonen till baksidan av öronen. Använd 4-6 bulldog klämmor att nypa bort från huden och hålla snittet öppen. Ta bort alla bindväv med en spatel och / eller bomullspinnar och rengöra området för att exponera skallen ytan.
  4. Kontrollera om huvudet är nivån: Först, hitta Lambda och placera guiden kanylen precis över denna plats, röra skallen. Anteckna Dorso-ventrala samordna. Placera guiden kanylen precis över Bregma, röra skallen, samt dokumentera sitt Dorso-ventrala samordna. Dessa två koordinater ska vara identiska. Om skillnaden är> 0,3 mm, justera näsan stapel för att rätta till det.
  5. Make två små hål för fastsättning i skallen skruvarna med en steriliserad handborr (en ca 5 mm främre till den kanyl läge i ett av halvkloten och den andra 5 mm posteriort kanylen plats i kontralaterala hemisfären). Placera två sterila skruvarna i dessa hål tills de är ordentligt förankrade, utan att föras in helt i skallen.
  6. Med guiden kanylen placeras exakt vid Bregma, spela in den främre-bakre och laterala koordinater. Rätt plats för vägledning kanyl placering för varje hjärna region kan beräknas genom att addera eller subtrahera från Bregma, med hjälp av en stereotaxic atlas 9-11.
  7. Placera guiden kanyl på rätt plats, något att röra skallen. Anteckna Dorso-ventrala samordna. För bilaterala kanyl placering, hitta nästa kanylen plats i den andra halvklotet, och återigen spela in Dorso-ventrala samordna. Både koordinater ska vara identiska (eller avvika <0,3 mm).
  8. Markera kanylen platser på skallen med ett sterilt penna och, med handen borraren, gör Burr hål, kontrollera storlek och på rätt plats med hjälp av guiden kanylen. När hålen är gjorda, använder en steril nål för att försiktigt punch hjärnhinnorna för att möjliggöra fri insättning av kanylen.
  9. Placera kanyl i det första hålet och sänk det försiktigt tills den når den slutliga ventrala koordinat. Förbered dentala cement och generöst tillämpa det runt kanylen och en eller båda skruvarna för att fixera kanylen. Vänta tills cementen har torkat helt. Därefter försiktigt bort kanylen stöd genom att vrida Dorso-ventrala bar uppåt.
  10. Placera den andra kanylen i stöd och gå till kanylen plats i det andra halvklotet. Placera kanyl i hålet och upprepa föregående steg. Täck skruvar och en stor yta av kanyler med cement, och innan cementen är torr, ta bort eventuella överskott från huden.
  11. Injicera varma (~ 37 ° C) steril koksaltlösning (~ 10 ml / kg, sc) för att säkerställa rehydrering.
  12. När cementen har torkat helt, ta bort kanylen stöd och placera ett sterilt stift i varje kanyl för att förhindra obstruktion.
  13. Rengör sårområdet med steril koksaltlösning och sutur fram-och baksidan av såret.
  14. Ta bort djuret från stereotaxic apparaten, byta ut gasen rör framför nosen. Fortsätta att övervaka nivån syrgasmättnad och kroppstemperatur.
  15. Om ett injicerbart bedövning med dexmedetomidin används injicera sin antagonist atipamezol (0,25 mg / kg sc) och vänta tills djuret vaknar (ca 5 minuter).
  16. Placera råttan i en återhämtning bur. För att undvika hypotermi, placera buren i en inkubator vid 28 ° C eller på en värmedyna på en plats där man kan följa djuret under minst en timme, innan den till vivarium rummet.

3. Post-kirurgisk vård

  1. Under de första 4 dagarna efter operationen, övervaka råttans återhämtningen genom att hålla dagliga anteckningar om vikt och andra iakttagelser om tillståndet för djur i laboratorium loggböcker eller "djurens dagböcker välfärd".
  2. Djur som visar uppenbara tecken på sjukdom, infektion i såret, viktminskning eller andra tecken på nedsatt välbefinnande måste genomgå särskild vård: t.ex. en extra dos av analgetika för att minimera postoperativ smärta, en blandning av pulver mat och vatten i tillägg till standardbehandling chow att stimulera råttans aptit och / eller en subkutan injektion av koksaltlösning för att stödja rehydrering.
  3. Om råttan inte visar någon förbättring efter dessa åtgärder, eller förlust av kroppsvikt är> 15% (jämfört med innan operation vikt), offra djur med en överdos av narkosmedel (humana end-point).
  4. Råttor behöver vanligtvis att återvinna minst 7 dagar före påbörjandet av beteende experiment.

4. Representativa resultat

jove_content "> För att avgöra om de olika modifieringar av våra kirurgiskt ingrepp, särskilt med avseende på syre tillskott och kontinuerlig kontroll av blodets syresättning, hjärtfrekvens och kroppstemperatur, ökad djurets överlevnad och förbättrat allmäntillstånd efter operation, jämförde vi icke-överlevnad på 20 kohorter av djur (som består av 20 råttor vardera) som genomgick operation efter att vi genomfört dessa ändringar med den icke-överlevnad 24 årskullar (20 råttor varje) manövreras med standardprotokoll. Som framgår av Figur 1a , den icke-överlevnaden var signifikant reducerad i urval av kohorter som manövreras med den modifierade protokollet (P <0,05, Mann-Whitney U test, två tailed). Såsom visas i Figur 1b, postoperativa viktminskning råttor som drivs med den modifierade protokollet reducerades också signifikant jämfört med den som råttor som drivs med standardförfarandet (postoperativ dag 1: P <0,05, postoperativ dag 2: P <0,01, postoperativ dag 3: P = 0,17; Student t-test).

Figur 1
Figur 1. Effekt av kirurgiska ändringar på icke-överlevnad och efter kirurgiska viktminskning. (A.) Icke-överlevnad på råttor som drivs med det modifierade protokoll som jämfört med råttor som drivs med standardprotokoll. Den icke-överlevnad (median ± interkvartilt områden) har beräknats som andelen råttor, per kohort av 20 råttor som inte överlevde operationen. * P <0,05, Mann-Whitney U test två tailed (n = 20 årskullar för ändrade protokollet och 24 årskullar för standardprotokoll). (B.) Viktminskning (medelvärde ± SEM i procent av innan operation vikt) under den första (POD1), andra (POD2) och tredje (POD3) postoperativ dag. * P <0,05, ** P <0,01, Students t-test (n = 60 per grupp).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det huvudsakliga syftet med denna video presentation är att bekanta beteende neuroforskare med de grundläggande principerna för stereotaxic kirurgi. Forskare som redan utför stereotaxic kirurgi kan också dra nytta av denna video och fundera några av de processuella förbättringar för användning i sina egna laboratorium. En ständigt ökande kunskap om optimering av kirurgiska tekniker 1-3, utveckling av nya narkosmedel och smärtstillande medel för användning i human-och veterinärmedicin 4,12, allmänhetens medvetenhet om djurskydd och strängare lagstiftning (t.ex. 2010 EU direktiv om användning av försöksdjur 5) fick oss att implementera nya rutiner för syrgastillskott och kontinuerlig övervakning av blodets syresättning och hjärtat nivåer takt under operationen. Vi observerade, som visas för ett representativt urval av djur, en total ökad överlevnad och en kraftigt minskad postoperativ viktminskning.En sådan minskad postoperativ viktminskning kan återspegla en mindre belastning av kirurgiskt ingrepp på djuret, och därmed resultera i en mer aktiv djur omedelbart efter operation. Vare sig det har också positiva effekter på hälsan på lång sikt är inte klart. Det var en märklig iakttagelse att ta bort syretillförseln tillfälligt lett till en markant och pålitlig minskning i färgmättnad blodet syre nivå, vilket kan sjunka under 50% (Se videopresentation för en demonstration härav). Det är tänkbart att långvarig otillräcklig syre nivåer i blodet, eventuellt också hos djur inte försedda med någon syrgastillskott under operationen, kan resultera i hypoxi med långsiktiga beteendemässiga konsekvenser och också inverka negativt på resultatet och / eller kvalitet beteendemässiga experiment. Vi vet inte huruvida en sådan depression av syre blodförsörjning under operationen är specifik för bedövningsmedel protokoll som används i vårt laboratorium (dvs en blandning av ketamine och dexmedetomidin) eller om det är ett mer allmänt fenomen i samband med Injektionsanestetika. Användning av inhalationsanestesi, med en blandning av luft och syre, kan vara en alternativ metod för att övervinna depressionen blodet syre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna tackar Dr Peter Gerrits för ritningar som används i videon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol 70% VWR international
Antisedan (atipamezole) Orion
Atropine sulfate 0,5 Teva Pharmachemie
Bulldog haemostatic clamp Aesculap
Cannulas Component Supply Co.
Chlorhexidine 0.5% APP Pharmaceuticals
Cleaning powder Alconox, Inc.
Cotton sticks Hartmann BV
Dexdomitor (dexmedetomidine) Orion
Drill Dremel
Duratears Z Alcon
Durogrip Naaldv–rder converse 130mm Aesculap
Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm Aesculap
Gauze Medicomp (5x5)
Heating pad Harvard Apparatus
Insect pins (stylets) Entosphinx (Czech Republik)
Ketamine 10% (ketamine) Alfasan
Micro-halsted straight tip Aesculap
Molinea Hartmann BV
NaCl 0,9% Baxter Internationl Inc.
Needles (25G) Terumo Medical Corp.
Oximeter Edan Instruments, Inc.
Pentobarbital Pharmacy of the UMCG
Rimadyl Pfizer Pharma GmbH
Scalpel blade No. 23 Swann-Morton
Scalpelholder NR. 4 133 mm Aesculap
Screw driver Any Supplier
Simplex Rapid (dental cement) Kemdent
Skull screws Component Supply Co.
Spatula VWR international
Spongestan special Johnson & Johnson
Stereotacts Kopf Instruments
Surgical forceps 100mm Aesculap
Suture material Safil 5/0 Aesculap
Syringe 10 ml Omnifix
Syringe 1ml Terumo Medical Corp.
Syringe 5ml Omnifix
Xylocaine (lidocaine/adrenaline) AstraZeneca

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
  2. Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
  3. Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
  4. Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
  5. DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
  6. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
  7. Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
  8. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
  9. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
  10. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
  11. Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).

Tags

Neurovetenskap 59 stereotaxic kirurgi kanyl implantation råtta förfining
Gnagare Stereotaxic Kirurgi och välbefinnande Förbättringar Utfall för Behavioral Neuroscience
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fornari, R. V., Wichmann, R., Atsak, More

Fornari, R. V., Wichmann, R., Atsak, P., Atucha, E., Barsegyan, A., Beldjoud, H., Messanvi, F., Thuring, C. M. A., Roozendaal, B. Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience. J. Vis. Exp. (59), e3528, doi:10.3791/3528 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter