Summary
Kemirgenler üzerinde stereotaksik cerrahi, ilaçlar ya da uyanık davranmak hayvanlar elektriksel stimülasyon ve kayıtları, hedeflenen yönetim için izin verir. Bu video sunumu biz bu uzun soluklu bir prosedür başarıyla sağkalım oranı ve düşük ameliyat sonrası kilo kaybı son usul ayrıntılandırmaları gösterecektir.
Abstract
Implantasyonu için belirli beyin bölgelerine kanüller stereotaksik cerrahi, onlarca yıl boyunca, uyanık davranmak hayvanların yerel olarak manipüle nörotransmitter ve sinyal yolları etkilerini araştırmak için çok başarılı bir deney tekniği olmuştur. Dahası, elektrofizyolojik stimülasyon ve kayıt çalışmaları için elektrodlar stereotaksik implantasyon hayvanlar davranıyor nöroplastisite ve beyin ağları mevcut anlayış etkili olmuştur. Kemirgenler 1-4, halkın bilinçlendirilmesi hayvan refahı ile ilgili sorunlar ve katı mevzuat (örneğin, laboratuar hayvanlarının kullanımı 5, 2010 Avrupa Birliği Direktifi) cerrahi tekniklerin en iyi duruma getirme hakkında giderek artan bilgi, bize saygı ile özellikle bu cerrahi işlemler rafine istenir ameliyat sırasında oksijen takviyesi için yeni usul ve kan oksijenlenme ve kalp hızı seviyeleri sürekli izlenmesi uygulanması yanı sıraameliyat sonrası bakım için standart bir protokol tanıtan. Gözlemlerimiz bu değişiklikler artan bir hayatta kalma oranı ve cerrahi sonrası hayvanların genel durumu (örneğin, daha az kilo kaybı ve daha aktif bir hayvan) bir iyileşme yol açtığını göstermektedir. Bu video sunumu bazı değişiklikler özel bir dikkat ile stereotaksik cerrahi bu tip ilgili genel prosedürleri gösterecektir. Biz sıçanlarda bu cerrahi prosedürleri göstermek, ancak stereotaksik aparat 6 için özel bir adaptör kullanarak fare ya da diğer küçük laboratuvar hayvanlarında bu tip ameliyatlar gerçekleştirmek de mümkündür.
Protocol
Not: Antiseptik teknikleri tüm prosedürü sırasında istihdam edilmelidir. Ameliyat sırasında kullanılan tüm alet ve malzemeler (pamuklu çubuklar, gazlı bez, vb.) Otoklav ile sterilize edilmelidir. Cerrahi maske, saç kaput ve steril eldiven giyilmelidir. Çalışma alanı ve stereotaksik aparatı iyice temizlenmiş, ve% 70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edilmelidir.
1. Pre-cerrahi prosedürler
- Stereotaksik aparatı ve gerekli tüm malzemeleri ayarlayın. Pre-ılık ısıtma yastığı.
- Verdiği destek kanül yerleştirin ve düz olup olmadığını kontrol edin.
- Gaz sistemi açın ortam hava ve oksijen karışımı (toplam akışının% 30-35 oksijen olmalıdır).
- Rat tartılır ve anestezi yönetmek. Biz subkutan enjekte ketamin (37.5 mg / kg) ve deksmedetomidin (0.25 mg / kg) oluşan bir karışım kullanıyoruz. Farklı anestezi protokolleri için, bkz. Flecknell 4 ve Hellebreker.s ve ark. [7 ].
- Sıçan bilinci kaybettikten sonra, sadece bir elektrikli tıraş makinesi ile gözleri arasındaki kulakları giden kafa alan tıraş.
- Hava hortumu önünde burun, ısıtma pedi sıçan yerleştirin. Rat yeterli bir kan oksijenlenme düzeyi (<% 90 damla) olduğundan emin olmak için bir oksimetre kullanın. Ekipmanın uygun kullanımı için üreticinin talimatlarını takip ediniz.
- Dehidratasyonu önlemek için her iki kornealar göz kremi (Duratears Z, Alcon) uygulayın.
- Sıçan refleksler (kuyruk refleks veya toe-tutam refleks, Walantus ve ark. 8 gösterdiği gibi) yeterli anestezi olduğundan emin olmak için kontrol edin. Sıçan, güçlü refleksleri göstermeye devam ederse, anestezi takviyesi gerekebilir.
- Hayvanın önünde hava hortumu, hiçbir ayak tutam refleks ise, stereotaksik aparat sıçan, her iki tarafta eşit okuma gösterir böylece kulak çubukları ayarlamak ve tekrar yereburun bar ile sabitleme. Sıçan,% 90 veya daha yüksek bir kan oksijenlenme düzeyi gösterir eğer tekrar kontrol edin. Aksi takdirde, yakın buruna getiren, ya da tüp ayarlamak için, ya da oksijen akışını artırmak. Ameliyat süresince kan oksijenlenme düzeyi ve kalp hızı izleyin.
- Sürekli bir rektal termometre (tercihen bir ısıtma pedi bağlı) ile sıçan sıcaklığı izlemek ve ameliyatın başında ve sonunda değerleri kaydedin. Isıtma yastığı ayarlayın veya 38,5 için 37,5 bir vücut sıcaklığını korumak için bir battaniye kullanın ° C
2. Cerrahi
- Analjezik enjekte edilir. Biz carprofen (subkutan 4,0-5,0 mg / kg) tek bir peri-operatif yönetim kullanıyor. Hellebrekers et al. 7 farklı analjezik protokoller için, bkz.
- T traş alanı temizleyino merkezinden bir dezenfektan (örn., klorheksidin% 0.5) ile üç kez ve yerel lokal anestezi ve vazokonstriksiyon için lidokain (20 mg / ml) ve adrenalin (5 mg / ml) bir karışımı enjekte önlemek için (saçlı bir çevre için cilt aşırı kanama).
- Kulak arkasına kadar gözleri arasındaki orta hat kafa derisi yaklaşık 2.5 cm ön-arka kesi olun. 4-6 bulldog kelepçeler cilt çimdik ve kesi açık tutmak için kullanın. Spatula ve / veya pamuklu ve alanını temiz kafatası yüzeyi ortaya çıkarmak için herhangi bir birleşik doku çıkarın.
- Birinci, Lambda bulmak ve konumu üzerinde tam olarak bu kılavuz kanül, kafatası dokunmadan: baş düzeyi ise kontrol edin. Dorso-ventral koordinat kaydedin. Sonra, kafatası dokunmadan tam bregma üzerinde kılavuz kanül ve dorso-ventral koordinat kayıt. Bu iki koordinat aynı olmalıdır. Fark> 0,3 mm ise, bunu düzeltmek için burun çubuğunu ayarlayabilirsiniz.
- MAKE iki küçük delik steril bir el matkabı (hemisferlerin biri kanül konumu ve diğer 5 mm kontralateral yarımkürede kanül konumu posterior anterior biri yaklaşık 5 mm) kullanılarak kafatası sabitleme vidaları. Tamamen kafatasının içine takılı olmadan, onlar sıkıca demirlemiş kadar bu deliklerin içine iki steril vida yerleştirin.
- Kılavuz kanül bregma tam olarak yerleştirilir, ön-arka ve lateral koordinatları kaydedin. Her bir beyin bölgesi için doğru konuma kılavuzu kanül yerleştirilmesi, stereotaksik atlas 9-11 yardımı ile, ekleme veya bregma gelen çıkarılarak hesaplanabilir.
- Kafatası hafifçe dokunarak, doğru yerde kılavuz kanül yerleştirin. Dorso-ventral koordinat kaydedin. Ikili kanül yerleştirilmesi için, diğer yarımkürede kanül konuma gelecek ve tekrar dorso-ventral koordinat kayıt. Her iki koordinatları (veya <0.3 mm farklı) aynı olmalıdır.
- , Steril bir kalem ile kafatası kanül yerleri işaretleyin ve el delici, boyutu ve doğru konumda kılavuz kanül yardımı ile kontrol çapak delik açmak. Delikler yapıldıktan sonra, yavaşça kanül engelsiz ekleme için izin vermek için meninksler yumruk steril bir iğne kullanın.
- Kanül ilk deliğe yerleştirin ve nihai ventral koordinat ulaşıncaya kadar dikkatle düşük. Diş çimento hazırlayın ve cömertçe kanül düzeltmek için kanül ve bir ya da iki vida çevresinde uygulamak. Çimento tamamen kuruyana kadar bekleyin. Daha sonra, dikkatli bir kanül destek dorso-ventral çubuk yukarı doğru çevirerek çıkarın.
- Ikinci kanül destek içine yerleştirin ve diğer yarımkürede kanül konuma gidin. Kanül deliğe yerleştirin ve bir önceki adımı tekrarlayın. Kapak vidaları ve çimento ile kanüller büyük bir yüzey ve çimento kuru cilt, herhangi bir artı kaldırmak.
- Enjekte sıcak (~ 37 ° C) rehidrasyon sağlamak için steril tuzlu su (~ 10 ml / kg, sc).
- Çimento tamamen kuruduktan sonra, kanül desteğini kaldırmak ve tıkanıklığı önlemek için her kanül içine steril bir iğne yerleştirin.
- Yara yeri temiz ve steril serum fizyolojik ile ön ve arka yara sütür.
- , Burun önünde gaz boru yerine, stereotaksik aparat hayvan çıkarın. Oksijen doygunluğu düzeyini ve vücut ısısı izlemeye devam edin.
- Deksmedetomidin ile bir enjektabl anestezi kullanılırsa, antagonist atipamezole enjekte (0.25 mg / kg, sc) ve hayvan (yaklaşık 5 dakika) geçinceye kadar bekleyin.
- Sıçan bir kurtarma kafesi içine yerleştirin. Hipotermi önlemek için, vivaryum odaya dönmeden önce, size en az bir saat için hayvan izleyebilirsiniz bir yerde 28 ° C ya da ısıtma yastığı bir kuluçka kafesine yerleştirin.
3. Ameliyat sonrası bakım
- Sırasında Ameliyattan sonraki ilk 4 gün, sıçan, ağırlık ve diğer laboratuar seyir veya "hayvan refahı günlükleri" hayvan durumuna ilişkin gözlemler günlük kayıtlarının tutulması ayilmanizi.
- Post-operatif ağrı, toz gıda ve su karışımı en aza indirmek için, hastalık, enfeksiyon, yara vücut ağırlığı ya da diğer işaretler refahı geçmeleri gerekir özel bakım azalma, kayıp aşikar belirtileri göstermeye Hayvanlar: örneğin fazladan bir doz analjezik standart yem ek olarak sıçan iştah kaybı, ve / veya rehidrasyon desteklemek için serum fizyolojik subkutan enjeksiyon teşvik etmek.
- Sıçan, bu müdahalelerden sonra herhangi bir iyileşme ya da vücut ağırlığı kaybı görünmüyorsa kurban hayvan, aşırı dozda anestezi (insancıl bir son nokta) (ameliyat öncesi ağırlığı ile karşılaştırıldığında)>% 15'tir.
- Sıçanlar genellikle davranışsal deneyler başlamadan önce en az 7 gün süreyle kurtarmak gerekir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
özellikle oksijen takviyesi ve kan oksijenlenme seviyeleri, kalp hızı ve vücut ısısı sürekli izleme açısından bizim cerrahi prosedür çeşitli değişiklikler,, hayvanın yaşam gelişmiş ve cerrahi sonrası, genel durum gelişmiş olsun üzere jove_content ">, biz karşılaştırıldığında Hayvanlar biz standart bir protokol ile işletilen 24 kohortlarında (20 sıçan her) olmayan hayatta kalma oranı ile bu değişiklikleri uygulamaya koymasının ardından cerrahi uygulandı (20 sıçan, her oluşan) 20 kohortlarında olmayan hayatta kalma oranı Şekil 1a gösterildiği gibi , non-hayatta kalma oranı önemli ölçüde modifiye edilmiş protokolü (p <0.05, Mann-Whitney U testi, iki kuyruklu) ile ameliyat edildi kohortlarında örnek azalmıştır. Dahası, Şekil 1b, cerrahi sonrası kilo kaybı gösterilmiştir değiştirilmiş protokolü ile işletilen sıçanlarda anlamlı olarak standart prosedür (post-operatif 1. gün ile işletilen bu sıçanların kıyasla azalmıştır: P <0.05; post-operatif gün 2: p <0.01; post-operatif 3. gün: p = 0.17; Öğrenci t-testi).
Şekil 1. etkisi olmayan, hayatta kalma oranı ve cerrahi sonrası kilo kaybı cerrahi değişiklikler . Standart bir protokol ile işletilen sıçanların göre değiştirilmiş protokolü ile işletilen sıçanların (A) Sigara hayatta kalma oranı. Olmayan hayatta kalma oranı (ortanca ± interquartil aralıkları) cerrahi hayatta değildi 20 sıçan, kohort başına sıçan yüzdesi olarak hesaplandı. * P <0.05, Mann-Whitney U testi, iki kuyruklu (standart bir protokol için modifiye edilmiş protokol ve 24 kohortlarında n = 20 kohortlarında) . (B) Kilo kaybı (ameliyat öncesi ağırlık yüzdesi olarak ortalama ± SEM) ilk (POD1), ikincisi (POD2) ve üçüncü (POD3) post-operatif gün boyunca. * P <0.05, ** p <0.01, Student t-testi (n = 60) grup başına.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video sunumu ana amacı, stereotaksik cerrahi temel ilkeleri ile davranış Nörobilimadamları tanımak için. Zaten stereotaksik cerrahi yapıyorsanız Araştırmacılar ayrıca bu video yararlanmak ve kendi laboratuarında kullanılmak üzere bazı usul ayrıntılandırmaları düşünebilirsiniz. Giderek artan bir cerrahi teknikler 1-3 optimize hakkında bilgi, insan ve veteriner hekimlik 4,12, halkın bilinçlendirilmesi hayvan refahı ile ilgili sorunlar ve katı mevzuat (örneğin, 2010 yılında Avrupa Birliği Direktifi kullanmak için yeni anestezik ve analjezik gelişimi laboratuar hayvanlarının kullanımı 5) bize oksijen takviyesi ve ameliyat sırasında kan oksijenlenme ve kalp hızı seviyeleri sürekli izlenmesi için yeni prosedürler uygulamak için istenir. Biz hayvanların temsili bir örnek, bir genel sağkalım oranı artış ve önemli ölçüde azaltılmış bir ameliyat sonrası kilo kaybı için gösterilen gözlemledi.Böyle düşük bir ameliyat sonrası kilo kaybı, hayvan küçük bir cerrahi işlem yükü ve dolayısıyla, ameliyatın hemen ardından daha aktif bir hayvan sonucu yansıtıyor olabilir. Aynı zamanda uzun vadeli sağlığı üzerinde yararlı etkileri vardır açık olup olmadığını. Ancak, kayda değer bir gözlem, oksijen kaynağı çıkarmadan geçici olarak% 50 altına bile düşebilir (video sunumu için bir gösteri için geçerlidir), kandaki oksijen doygunluk düzeyleri ve güvenilir belirgin bir azalma, yol açtığını oldu. Bu ameliyat sırasında herhangi bir oksijen takviyesi ile sağlanan hayvanlarda meydana gelen, uzun süreli oksijen yetersiz kan düzeyleri, muhtemelen uzun vadeli davranış sonuçları ile hipoksi neden olabilir ve aynı zamanda davranışsal deneyler sonucu ve / veya kalite olumsuz etkisi düşünülebilir. Biz ameliyat sırasında oksijen kan dolaşımı gibi bir depresyon laboratuvarda kullanılan anestezi protokolü (yani, ketami bir karışımı özgü olup olmadığını bilmiyorumne ve deksmedetomidin) ya da olmadığını, enjektabl anestezikler ile ilgili daha genel bir olgudur. Inhalasyon anestezi kullanımı, ortam hava ve oksijen karışımı ile, kan oksijen düzeyleri, depresyonun üstesinden gelmek için alternatif bir yöntem olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Yazarlar video kullanılan çizimler Dr Peter Gerrits teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70% | VWR international | ||
| Antisedan (atipamezole) | Orion | ||
| Atropine sulfate 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| Bulldog haemostatic clamp | Aesculap | ||
| Cannulas | Component Supply Co. | ||
| Chlorhexidine 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| Cleaning powder | Alconox, Inc. | ||
| Cotton sticks | Hartmann BV | ||
| Dexdomitor (dexmedetomidine) | Orion | ||
| Drill | Dremel | ||
| Duratears Z | Alcon | ||
| Durogrip Naaldv–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip Fijne schaar ret.sp/st 110 mm | Aesculap | ||
| Gauze | Medicomp (5x5) | ||
| Heating pad | Harvard Apparatus | ||
| Insect pins (stylets) | Entosphinx (Czech Republik) | ||
| Ketamine 10% (ketamine) | Alfasan | ||
| Micro-halsted straight tip | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| NaCl 0,9% | Baxter Internationl Inc. | ||
| Needles (25G) | Terumo Medical Corp. | ||
| Oximeter | Edan Instruments, Inc. | ||
| Pentobarbital | Pharmacy of the UMCG | ||
| Rimadyl | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Scalpel blade No. 23 | Swann-Morton | ||
| Scalpelholder NR. 4 133 mm | Aesculap | ||
| Screw driver | Any Supplier | ||
| Simplex Rapid (dental cement) | Kemdent | ||
| Skull screws | Component Supply Co. | ||
| Spatula | VWR international | ||
| Spongestan special | Johnson & Johnson | ||
| Stereotacts | Kopf Instruments | ||
| Surgical forceps 100mm | Aesculap | ||
| Suture material Safil 5/0 | Aesculap | ||
| Syringe 10 ml | Omnifix | ||
| Syringe 1ml | Terumo Medical Corp. | ||
| Syringe 5ml | Omnifix | ||
| Xylocaine (lidocaine/adrenaline) | AstraZeneca |
References
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
