Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cutane leishmaniasis in het dorsale huid van Hamsters: een bruikbaar model voor de screening van antileishmaniale Drugs

doi: 10.3791/3533 Published: April 21, 2012

Summary

Optimalisatie van de experimentele hamster model voor cutane leishmaniasis door intradermale injectie van

Abstract

Traditioneel worden hamsters experimenteel geïnfecteerd in de snuit of de voetzool. Maar in deze sites niet een zweer altijd optreedt, meting van de laesie grootte is een harde procedure en dieren tonen moeite om te eten, ademen en bewegen vanwege de laesie. Om de hamster model cutane leishmaniasis, jonge volwassen mannelijke en vrouwelijke goudhamsters optimaliseren (Mesocricetus auratus) werden geïnjecteerd aan de dorsale huid met 1 tot 1,5 x l0 7 promastigoten van Leishmania soorten en progressie latere lesies werden geëvalueerd tot 16 weken na infectie. De gouden hamster is gekozen omdat het wordt beschouwd als een adequate bio-model om geneesmiddelen te evalueren tegen Leishmania zoals ze zijn gevoelig voor infectie door verschillende soorten. Cutane infectie van hamsters resulteert in een chronische, maar gecontroleerde laesies, en een klinische evolutie met borden vergelijkbaar met die waargenomen bij de mens. Daarom is de oprichting of de mate van infectie door het meten van de laesie volgens het gebied van verharding en zweren mogelijk is. Deze aanpak heeft zijn veelzijdigheid en eenvoudig beheer bewezen tijdens de inoculatie, follow-up en karakterisering van typische laesies (ulcera), toepassing van behandelingen door middel van verschillende manieren en het verkrijgen van klinische monsters na verschillende behandelingen. Door het gebruik van deze methode de kwaliteit van het dierlijk leven ten aanzien van bewegen, op zoek naar voedsel en water, spel en sociale activiteiten isalso behouden.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Infectie van hamsters

1. Dieren

Inbred vrouwelijke en mannelijke gouden hamsters (Mesocricetus auratus), 6-8 weken, met een gewicht van 140-160 g worden gebruikt. Ze bevinden zich op Dierenverblijf, in geconditioneerd accommodatie toegevoerd standaard knaagdier brokjes en voorzien van water ad libitum. Alle procedures waarbij dieren worden goedgekeurd door de institutionele Ethische Commissie voor experimentele dierproeven. Voor experimentele infectie met dermotropic Leishmania parasieten dieren zijn gesekst, gemerkt en gewogen op basis van gestandaardiseerde procedures. Voor geslachtsbepaling, worden de dieren gecontroleerd op onderscheidende kenmerken zoals de visualisatie van de borstklier lijn en de korte anaal-genitale afstand bij vrouwen, of het visualiseren van testikels en een grotere afstand tussen de anus en de voorhuid bij mannen. Vervolgens worden de dieren gekenmerkt door oor piercing of door kleuring een gebied van de huid met een wattenstaafje gedrenktin picrinezuur. Voor het oor perforatie, na het reinigen met alcohol 70% het oor wordt doorboord met behulp van een oor punch voor knaagdieren. Een regio met bloedvaten moet worden vermeden. Sedatie of anesthesie met een mengsel 9:1 van ketamine (50 mg / kg) en Xilacine (20 mg / kg) intraperitoneaal in een volume van 260 300μl 25 G naald wordt aanbevolen. Tenslotte worden de dieren gewogen door ze in een val of een doos die is onder de voorwaarde dat een precisie balans.

2. Parasieten

Promastigoten van dermotropic Leishmania soorten, zoals L. amazonensis, worden gekweekt in bifasische Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) cultuur medium bij 26 ° C. Metacyclische (stationaire) fase promastigoten (5 dagen) areused om de hamsters te infecteren. Kort parasieten geoogst, tweemaal gewassen met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS), geteld en aangepast aan 1 x 10 7 (bij mannen) of 1,5 x 10 7 (bij vrouwen) parasieten in 0,1 ml PBS enten mannelijke of vrouwelijke, respectievelijkNiettemin kan de inoculums grootte afhankelijk van de soort Leishmania (procedure niet in de video).

3. Experimentele infectie

Een huid wordt geschoren voor enting. Kortom, de verdoofde dieren worden in horizontale positie en schaar, wordt het haar verwijderd twee centimeter van de basis van de staart. Na het schoonmaken van het geschoren gebied met steriele zoutoplossing de parasiet inoculum wordt geïnjecteerd tot een papel is gevormd.

4. Klinische volgen

De dieren worden gecontroleerd om de 7 dagen tot 4-6 weken na inoculatie op het optreden van de laesie. Binnenkort worden de dieren geïmmobiliseerd in een val en de geïnoculeerde huid wordt gepalpeerd. Vervolgens wordt de verharding van het gevormde gedeelte ulcus afgebakend en de breedte en de lengte van de zweer worden gemeten met een digitale schuifmaat.

2. Behandeling van hamsters

1. AdminREGISTRATION van de verbindingen

Het behandelingsschema begint wanneer de dieren hebben ontwikkeld zwerende wonden (4-6 weken na de inoculatie). De dieren worden verdeeld in groepen van 5-6 dieren elke te testen verbinding. Verbindingen kunnen worden toegediend door plaatselijke, orale, intramusculaire of intralesionale routes. Voor het aanbrengen van drugs, hamsters zijn verdoofd en het letsel gebied wordt gereinigd met zoutoplossing of PBS. Wanneer de verbinding wordt via lokale of intralesionale worden de hamsters geïmmobiliseerd in vallen waarmee bloot gebied behandelt, terwijl, wanneer de verbinding wordt toegediend via orale of intramusculaire weg hamsters worden vastgemaakt door de basis van de hals. a) lokale toediening: de verbinding isapplied op het letsel en na enkele minuten het dier wordt teruggegeven aan de cage.b) Voor de intramusculaire injectie, het geneesmiddel wordt geïnjecteerd (200 ul maximum) door de halfpezige of semimembranous spieren van de achterhand. c) Voor orale administratieveconcentratie wordt het geneesmiddel die aan het dier (200 pi maximum) via een oraal maag probe 14G aangesloten op een 1 ml spuit. d) voor injectie intralesionale het geneesmiddel (100 pi maximum) geleidelijk geïnjecteerd aan de bodem van de zweer met een 26G naald met de schuine neergezet. Het gehele oppervlak van de laesie onder rotatie van de naald. Behandelingen worden dagelijks toegediend tijdens de 10-20 dagen, afhankelijk van de omschreven therapeutische regeling.

2. Klinische volgen

Omdat in deze experimentele model van de effectiviteit van nieuwe verbindingen antileishmaniale bepaald volgens de genezing of littekenvorming van laesies na behandeling wordt een klinische controle van elk dier wekelijks uitgevoerd aan het einde van de toediening van de verbinding en tot drie maanden na. Tijdens de controle, is de aard van de laesie beschreven en de verharding en de zweer gebied worden gemeten met een digitale schuifmaat. De aanwezigheid van laesies in verschillende gebieden van debeëntingsplaats en het uiterlijk van terugval van de laesie ook beschreven en geregistreerd. Elke twee weken worden de dieren gewogen en laesies worden afgebeeld. Dieren worden dagelijks geobserveerd om te controleren: a) uiterlijk (haar, de coördinatie, de temperatuur, de ogen, de positie van de oren, het verzorgen, ontlasting, de aanwezigheid van ascites-vloeistof, agitatie en uitdroging) en b) gedrag (wakker, alert, nieuwsgierig, attent , blijft bij de groep, kijkt uit naar eten en drinken, en moeilijk te vangen op). De site van de toepassing van de verbinding wordt ook waargenomen op de aanwezigheid van hyperemie, ontsteking, en bijten en ontharing.

Hamsters worden ook ontlucht op dag 45 na afloop van de behandeling de hematologische en serologische waarden die geassocieerd kan worden met toxiciteit van de verbindingen (zie hieronder) te bepalen.

De effectiviteit van elke behandeling wordt beoordeeld vergelijking van de laesie maten voor en na de behandelingen, het gebruik van de volgende score system: uitgehard (genezing van 100% gebied en het volledig verdwijnen van de laesie) klinische verbetering (verkleinen van de laesie in> 50% van de oppervlakte) klinisch falen (vergroten van de omvang van de laesie) terugval van laesie na uitharding). Aan het eind van de studie, worden de dieren gedood door het inademen van CO2 vorige anesthesie. Na de dood, worden de benodigde monsters voor parasitologisch, histologische en serologische analyse wordt afgenomen.

3. Parasitologisch examens

De aanwezigheid van Leishmania in monsters van de huid (laesie of litteken), wordt de lever, milt en nieren direct bepaald door het onderzoeken van uitstrijkjes gekleurd met Giemsa 1 en histopathologisch onderzoek van deze weefsels (zie hieronder).

De parasiet lasten in de laesie site wordt geschat door de grens verdunning test volgens Titus en collega's (1985) 2. In het kort wordt een klein stukje van het weefsel verwijderdvan elk dier, gewogen en gehomogeniseerd in koude PBS oplossing met een zuiger. De verkregen suspensie wordt gecentrifugeerd bij 600 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Daarna worden de supernatanten verwijderd en de pellets worden geresuspendeerd in RPMI 1640 medium aangevuld met 1% antibiotica en 10% foetaal kalfsserum. Honderd l van de suspensie worden overgedragen naar elk van de 96 putjes aan de microtiter plaat met NNN medium bedekt met 50 pi medium Schneider en bewaard bij 26 ° C. Het aantal levensvatbare parasieten in elk monster wordt bepaald door de hoogste verdunning waarbij promastigoten kan door onderzoek worden gedetecteerd onder een omgekeerde microscoop elke week een maand.

4. Histopathologisch onderzoek van de huid letsel (of litteken) en andere weefsels

Een derde stuk van de biopt genomen van de huid, lever en nieren is vastgesteld in 10% formaline en ingebed in petroleum. Preparaat van milt en hart kunnen worden verwerkt. Five micron delen van de vaste weefsels werden gekleurd met eosine haemotoxilin-en onderzocht onder een optische microscoop met 200X 400X of 1000X olie onderdompeling de microarchitectuur de kenmerken van de cellulaire infiltratie en de aanwezigheid of afwezigheid van parasieten. Microfoto's worden genomen en digitale beelden die zijn vastgelegd.

5. Evaluatie van de behandeling toxiciteit

Toxische activiteit van de verbinding is gebaseerd op de fysische en gedrag van de dieren volgens de parameters die in de klinische follow-up (zie hierboven). Toxiciteit wordt ook bepaald door hematologische en metabolische parameters in bloedmonsters en histopathologische veranderingen in weefselcoupes gekleurd met haemotoxilin-eosine zoals hierboven beschreven.

Bloedmonsters worden genomen van het hart, bij voorkeur het ventrikel. Om hematologische test, wordt het bloed overgebracht naar EDTA ontstold buizen en behandeld volgensom protocollen voor complete bloedbeeld te standaardiseren. Om serologische tests, wordt het bloed overgebracht naar 1,5 Eppendorfbuisjes en gecentrifugeerd om het serum te verkrijgen voor metabole analyse van creatinine, ALT en BUN niveaus gemeten met behulp van Kodak Ektachemdry chemie 3.

6. Data analyse

De gegevens van behandelde en onbehandelde dieren worden vergeleken met behulp van ANOVA's test. Betekenis is vastgesteld op p <0,05.

4. Representatieve resultaten

Overzicht

De hamster model van cutane leishmaniasis werd verbeterd met als doel het gebruik van dit model in werkzaamheid van het geneesmiddel screening. Laesie ontwikkeling en parasitologische parameters werden bestudeerd bij de primaire infectie in de huid huid van hamsters. Inbred vrouwelijke en mannelijke gouden hamsters (Mesocricetus auratus), 6-8 weken, werden geïnjecteerd met 1 x 10 7 (voor mannen) of 1,5 x 10 7 (voor vrouwen) metacyclic (stationaire fase) promastigoten van L. amazonensis. Knobbeltjes bleek 20 tot 35 dagen pi, met zweren vormen na 4-6 weken pi Na infectie werd vastgesteld, de werkzaamheid van vijfwaardig antimoon (SBV) op twee doses werd evalauted. Hamsters werden gerandomiseerd in drie groepen van 5 dieren per stuk en worden behandeld met meglumine antimoniate op 80 of 120 mg SbV / kg per dag gedurende 10 dagen via intramusculaire weg. De derde groep werd behandeld met intramusculair PBS placebo. Een groep van drie dieren behandeld en gebruikt als een negatieve controle. De respons op elke behandeling werd gevolgd 3 maanden na het einde van de behandelingsperiode.

1. Klinisch verloop na de L. amazonensis infectie van de goudhamster (Mesocricetus auratus)

Hamsters besmet in de dorsale huid consequent te ontwikkelen klinisch evidente ulceratie van de opperhuid op 4-6 weken na infectie. Laesies beginnen met kleine knobbeltjes en eindigend zweren datin omvang toenemen volgens de tijd na infectie en bereik wat als een optimale grootte voor de beoordeling van het effect van experimentele geneesmiddelen door de vierde tot zesde weken na infectie (18,99 tot 54,7 mm2 van 4 weken en 35,55 tot 92,71 mm 2 bij 6 week) (cijfers1, 2). De laesies vervolgens onderhouden een duidelijk zweer voor maximaal 20 weken na infectie, op welk moment de experimenten werden beëindigd (figuur 1).

Infectie door L. amazonensis heeft geen invloed op het lichaamsgewicht van hamsters die varieerde van 104,9 tot 124,69 gr en 129,71 tot 134,02 gr in niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde hamsters, respectievelijk (p> 0,05, ANOVA). De dieren behaalde een gemiddelde van 25,58 ± 5,98% van het lichaamsgewicht tijdens de studie. De seric waarden van creatinine en alanine aminotransferase (ALT) en hematologie parameters waren vergelijkbaar met de referentiewaarden bij niet-geïnfecteerde en Leishmania besmette hamsters. Alleen het broodje ureum-stikstof (BUN) niveau was eenugmented in 60% van de geïnfecteerde dieren.

Histopathologische analyse van de laesies in hamsters die besmet zijn met L. amazonensis toonde verschillen met betrekking tot deze niet-geïnfecteerde dieren. In het algemeen, huid biopten van niet-geïnfecteerde hamsters tonen geen ontstekingsreactie of een histologische veranderingen (figuur 3a), terwijl die besmet zijn met L. amazonensis het ontwikkelen van een granulomateuze dermatitis en overvloedige aanwezigheid van macrofagen te infiltreren in de dermis (zie figuur 3b). Histopathologische analyse van weefsels van hamsters geïnfecteerd met L. amazonensis en behandeld met meglumine antimoniate in doses van 80 en 120 mg SbV / kg / dag gedurende 10 dagen werd veranderingen die gepaard gaan met de infectie proces vergelijkbaar met die waargenomen in de controlegroep (geïnfecteerde en onbehandelde). In het algemeen huidmonsters van hamsters een lichte mate van plasmocyten (20%) en PMN (80%) cellen samen met matige infiltratie van lymfocyten (80%) en een lichte (20%) of ernstige (80%) infiltratie van macrofagen (tabel 2). Deze waarnemingen komen overeen met een diagnose van granulomateuze dermatitis, een inflammatoire gebeurtenis die de lederhuid en de onderliggende spieren in gevaar brengt. Dit is de laesie geassocieerd met de infectie, die compatibel is met de zware manifestatie van cutane leishmaniasis in alle dieren in deze studie. Deze vereniging werd statistisch gecorreleerd wanneer de chi-kwadraat van Pearson, die leverde p <0,05. Kidney monsters van 60-100% van de dieren toonde een matige hyperplasie in de renale cortex en kluwens gepaard met lichte atrofie van de nieren in 75% van de dieren. Deze waarnemingen zijn geschikt membraan proliferatieve glomerulonefritis, een diagnose die reeds infectie verbonden door infectie met andere Leishmania soorten. Statistische vereniging was groot met een chi-kwadraat van Pearson p <0,05. De levers van 40-100% van de dieren in groepen vertoonden kleine veranderingen in de vacuole hepatocyten, eventueel geassoed van fysiologische processen, zoals hepatocytic ophoping van glycogeen. Andere leverweefsel afwijkingen zoals vervetting, fibrose, en congestie komen overeen met het infectieproces. Andere waarnemingen zoals vacuolaire veranderingen in hepatocyten, cardiomegalies de aanwezigheid van insluitsels van intracytoplasmic eosinofielen, evenals de vacuolisatie van cellen in de renale buizen niet statistisch geassocieerd (p> 0.05) een toxisch effect van de geteste verbinding en waarschijnlijk een fysiologische proces in de hamsters.

2. De therapeutische werking van meglumine antimoniate in de hamster model

De klinische fenotype van geïnfecteerde hamsters op verschillende tijdstippen na behandeling samengevat in tabel 1. De behandeling met intramusculaire meglumine antimoniate een dosis van 120 mg SbV / kg / dag gedurende 10 dagen gewicht zeer effectief inducerende volledige regressie van de L. amazonensis laesies in alle dieren (figuur 4). Het percentage van genezing was 100% binnen de 2 en 8 weken na de behandelingsperiode. Echter, na drie maanden de terugval van het letsel werd waargenomen bij 20% van de hamsters. Bij meglumine antimoniate werd toegediend aan 80 mg SbV / kg lichaamsgewicht, werd volledig genezen alleen waargenomen bij 3 dieren. In de andere twee dieren de laesie daalde 33,9 en 69,0% respectievelijk (figuur 5). Na drie maanden, L. amazonensis bleef in de huid van dieren behandeld met meglumine antimoniate een dosis van 80 mg SbV / kg / dag en slechts een van de dieren behandeld met 120 mg SbV / kg / dag meglumine antimoniate. Een curatieve dosis van 120 mg intramusculaire SbV / kg / dag gedurende 10 dagen werd bepaald.

De beperkende verdunning assay, het geschatte aantal parasieten toonden een significante verlaging van de behandelde groep meglumine antimoniate in vergelijking met negatieve (onbehandeld) en-voertuig (placebo) behandelde groep (p <0,001). Levensvatbare parasieten (0,4 tot 1Werden 6 parasieten per mg van huidweefsel) waargenomen in de laesies van onbehandelde dieren die behandeld met PBS. Parasieten werden geïsoleerd uit alleen de dieren die niet reageren op een behandeling met meglumine antimoniate: een dier behandeld met 120 mg / kg / dag (figuur 5b) en twee hamsters behandeld met 80 mg / kg / dag (Figuur 5c). Geen verschil waargenomen in de parasitaire belasting van hamsters die niet genezen na meglumine antimonite in vergelijking met de onbehandelde of dieren behandeld met PBS.

In de histopathologie van huidbiopten van hamsters behandeld met intramusculaire meglumine antimoniate bij 120 mg SbV / kg / dag geen parasieten zijn waargenomen, enkele macrofagen en lymfocyten infiltreren in de dermis worden gezien (figuur 6a, 6b). Bij Integendeel, wanneer hamsters werden behandeld met meglumine antimoniate uitvoerig 80 mg SbV / kg / dag, granulomateuze dermatitis overvloedig aanwezig macrofagen infiltratie de dermis waargenomen (figuur 6c, 6d).

Met behulp van dezelfde therapeutische regeling voor doelmatigheidsonderzoek, de toxiciteit van meglumine antimoniate bij 80 en 120 mg SbV / kg lichaamsgewicht werd geëvalueerd. Algemene gezondheid en lichaamsgewicht werden gevolgd tot 3 maanden na de laatste dosering. Behandeling met had geen invloed op het lichaamsgewicht van hamsters die varieerde van 104,9 tot 124,69 gr en 129,71 tot 134,02 gr in niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde hamsters, respectievelijk. De dieren behaalde een gemiddelde van 27,59 ± 4,22% van het lichaamsgewicht tijdens de behandeling en 28,74 ± 2,26% tijdens de follow-up (p> 0,05, ANOVA). Gewichtsverlies werd niet waargenomen in elke groep van behandeling (gegevens niet getoond). De seric waarden van creatinine en alanine aminotransferase (ALT) en hematologie parameters waren vergelijkbaar met de referentiewaarden in onbehandelde en meglumine antimoniate behandeld hamsters. Alleen het broodje ureum-stikstof (BUN) niveau werd verhoogd in 20% van de behandelde dieren.

Histopathological analyse van weefsels van hamsters geïnfecteerd met L. amazonensis en behandeld met meglumine antimoniate in doses van 80 en 120 mg SbV / kg / dag gedurende 10 dagen werd geen veranderingen geassocieerd geneesmiddelentoxiciteit.

Tabel 1
fosfaatbuffer zoutoplossing, b dagen na behandeling.
Tabel 1. Klinische fenotype van L. amazonensis experimenteel geïnfecteerde hamsters na de behandeling met meglumine antimoniate

De effectiviteit van elke behandeling werd beoordeeld vergelijken laesie grootten vóór en na behandeling met de volgende score-systeem: behandeling (genezing van 100% gebied en het volledig verdwijnen van de laesie) klinische verbetering (verkleinen van de laesie in> 50% van het gebied) klinisch falen (vergroten van de omvang van de laesie) terugval (reactivering van letsel na uitharding).


A: afwezig teken; NB: niet van toepassing; m: zacht; M: matig; S: ernstig; PMN: polymorfonucleaire neutrofielen; NSL: geen significante laesie; GDM: Granulomateuze dermatomyositis; PGD: Pyogranulomatous dermatitis. 1. Lymphangiectasia 2. Minerale-achtig materiaal.
Tabel 2. Histopathologie van de huid van hamsters experimenteel geïnfecteerd met L. amazonensis en behandeld met meglumine antimoniate

Figuur 1
Figuur 1. Verloop van huidlaesie ontwikkeling na de infectie bij hamsters intradermaal ingeënt met 1-1,5 x 10 7 L. amazonensis metacyclische (stationaire fase) promastigoten gedurende 20 weken. As y de zweer in mm.

Figuur 2
Figuur 2. Photographyic ontstaansgeschiedenis van zweren afwijking in de dorsale huid van een goudhamster na intradermale inoculatie van 10 x 10 7 na 2 weken (a), 4 weken (b) en 6 weken (c).

Figuur 3
Figuur 3 huidbiopsie van (a) hamster niet-geïnfecteerde en onbehandelde:. Geen ontstekingsreactie geen significante histologische veranderingen waargenomen, (b) hamster geïnfecteerde en onbehandelde: granulomateuze dermatitis met aanwezigheid van meerkernige reuscellen (pijl plus asterisk) en een overvloed aan parasieten (zwarte pijlen) en macrofagen (witte pijlen) te infiltreren in de dermis. Hematoxyline-Eosine vlek 400x.

Figuur 4
Figuur 4. Fotografische geschiedenis van de klinische respons van hamsters die besmet zijn met L. amazonensis en behandeld met intramusculaire meglumine antimoniate bij 120 mg SbV / kg / dag Durin g 10 dagen. Beelden tonen het uiterlijk van de laesie voor behandeling (a) aan het eind van de behandeling (dag 10) (b) en tijdens de follow-up: dag 30 (c), 60 (d) en 90 (e) na behandeling.

Figuur 5
Figuur 5. Effectiviteit van meglumine antimoniate bij de behandeling van cutane leishmaniasis in hamsters. Golden hamsters werden besmet met L. amazonensis in de dorsale huid. Na 6 weken infectie waren behandeld (a) of intramusculair behandeld gedurende tien dagen alleen PBS (b), meglumine antimoniate 120 mg SbV / kg / dag (c) of 80 mg SbV / kg / dag (d). Grafieken het percentage vermindering in de laesies eind van de behandeling (dag 0), en op dag 15, 30, 60 en 90 van follow-up na afloop van de behandeling. p <0,001 voor 120 of 80 mg SbV / kg / dag tegen voertuig of behandeling.

"/>
Figuur 6. Huidbiopsie van hamsters besmet en behandeld met intramusculaire megumine antinmoniate bij 120 mg SbV / kg / dag (a, b) en 80 mg SbV / kg / dag (c, d). Aanwezigheid van schaarse macrofagen en lymfocyten infiltreren in de dermis. Geen parasieten in acht worden genomen. Hematoxylin-Eosine vlek 200x (a), 1000x (c) Granulomateuze dermatitis met overvloedige aanwezigheid van macrofagen te infiltreren in de dermis uitgebreid (c);. Schuimige macrofagen met phagocyted parasieten. Hematoxyline-eosine vlek 200x (b), 1000x (d).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cutane leishmaniasis is endemisch in de tropen en Neotropen. Het wordt vaak genoemd als een groep van ziekten als gevolg van de gevarieerde spectrum van klinische verschijnselen, die variëren van kleine cutane noduli en het bruto slijmvliesweefsel vernietiging. De meeste beschikbare geneesmiddelen duur zijn, vereisen lange behandelingen en worden steeds effectief is, noopt de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen.

De muismodel wordt algemeen gebruikt, maar heeft enkele nadelen. Zo bijvoorbeeld op basis van de laesie die ontwikkeld na injectie van intradermale promastigoten van dermotropic Leishmania soorten konden de muizen worden verdeeld in drie groepen zeer gevoelig met chronische infectie gekenmerkt door een expanderende ulcerosa laesie gezien in BALB / c en DBA / 2, DBA / 3 muizen, een relatief resistent groep waar letsels kan besluiten binnen 8 weken zoals te zien in KBA / H, C3H/He en A / J en een zeer goed bestand groep waarin geen echte laesie typical van cutane leishmaniasis ontwikkelt op de injectieplaats zoals te zien in NZB en C57Bl / 6 muizen 4. In tegenstelling tot het muizenmodel van cutane leishmaniasis, waar duidelijk het verloop van de ziekte varieerde tussen de verschillende gemeenschappelijke inteelt muizenstammen en Leishmania soorten, de gouden hamster, wordt Mesocricetus auratus beschouwd als een adequate bio-model om geneesmiddelen tegen Leishmania soorten te evalueren zoals ze zijn gevoelig infectie met verschillende soorten Leishmania. 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Inoculatie van metacyclische (stationaire fase) promastigoten van de soort Leishmania dermotropic kan cutane lesies veroorzaken tussen een en twee maanden na inoculatie. Laesies duidelijk worden 20 dagen pi als papels, die zich ontwikkeld tot knobbeltjes en later, tot zweren. Afhankelijk van de plaats van de injectie (ie snuit, foodpad, oor of basis staart) de hamster toont een voorspelbaar verloop van de ziekte na experimentele infectie, het grootste deel van ee tijd gekenmerkt door de ontwikkeling van een chronische zweren lokale laesie vergelijkbaar met die waargenomen in menselijke wezens met cutane leishmaniasis. Zoals bij de mens, laesies gevarieerd grootte afhankelijk van de immuunstatus van elk individu en dus in sommige hamsters een poging om het oplossen van de laesie en bijgevolg reductie van de grootte van de laesie te zien.

Hoewel dit artikel beschrijft de experimentele infectie in de dorsale huid van hamsters met promastigoten van L. amazonesis dit model is ook mogelijk voor andere dermotropic Leishmania soorten, dat alleen de grootte van het inoculum. Kortom, de aanpak van intradermale injectie van promastigoten op de dorsale huid laat zien dat de kliniek en pathologische kenmerken van cutane leishmaniasis geïnduceerd in de dorsale huid van hamsters zijn opvallend vergelijkbaar met de menselijke ziekte. Daarnaast is de klinische opvolging van zweren na behandeling met specifieke verbindingen of dtapijten wordt vergemakkelijkt dit model van geïnduceerde CL dorsale huid. De evolutie van laesies wordt gemakkelijk bepaald door de grootte van de laesie die vóór en na de behandeling. De klinische respons van uitharding wordt gemakkelijk gevolgd volgens de re-epithelisatie (zoals in figuur 4). We concluderen dat de experimentele infectie in de dorsale huid van hamsters met Leishmania soorten nuttig model de mogelijke verbindingen die valideren vertegenwoordigt zijn kandidaten voor antileishmaniale drugs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Comite voor Onderzoek van de Universiteit van Antioquia (Codi), De Colombiaanse Instituut voor de Ontwikkeling van Wetenschap en Technologie - COLCIENCIAS en het Centrum voor de Ontwikkeling van producten tegen tropische ziekten - CIDEPRO.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ketamine Reagent Holliday –Scott S.A
Xilacine Reagent Synthesis
PBS Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190-136
Digital caliper Equipment Fisher Scientific 15-077-958
Giemsa Reagent Sigma-Aldrich GS1L-1L
Formalin Reagent Nova lab 11273
Paraffin Reagent Pechiney Plastic Packaging PM-996
Haemotoxilin Reagent Nova lab 10870103
Eosin Nova lab 10870203
Kodak Ektachem dry chemistry Equipment Kodak Ektachem DT-60
meglumine antimoniate Reagent Aventis
Microscopy Equipment Nikon Instruments YS2-T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Control of the leishmaniasis. Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis WHO. 949, (2010).
  2. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol. 7, 545-555 (1985).
  3. Reynolds, K. M. The Kodak Ektachem dry layer technology for clinical chemistry. Upsala. J. Med. Sci. 91, 143-146 (1986).
  4. Handman, E., Ceredig, R., Mitchell, G. F. Murine cutaneous leishmaniasis: disease patterns in intact and nude mice of various genotypes and examination of some differences between normal and infected macrophages. Australian J. Exp. Biol. Med. Sci. 57, 9-29 (1979).
  5. Hanson, W., Chapman, W., Waits, V., Lovelace, J. Development of Leishmania (Viannia) panamensis lesions and relationship of numbers of amastigotes to lesion area antimony-treated and untreated hamsters. J. Parasitol. 77, 780-783 (1991).
  6. Henao, H. H., Osorio, Y., Saravia, N. G., Gómez, A., Travi, B. Efficacy and toxicity of pentavalentantimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomédica. 24, 393-402 (2004).
  7. Travi, B. L., Martinez, J. E., Zea, A. Antimonial treatment of hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis: assessment of parasitological cure with different therapeutic schedules. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87, 567-569 (1993).
  8. Hommel, M., jaffe, C. L., Travi, B., Milon, G. Experimental models for leishmaniasis and for testing anti-leishmanial vaccines. Ann. Trop. Med. Parasitol. 89, 55-73 (1995).
  9. Travi, B. L., Osorio, Y., Saravia, N. G. The inflammatory response promotes cutaneous metastasis in hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis. J. Parasitol. 82, 454-457 (1996).
  10. Travi, B. L., Osorio, Y. Failure of Albendazole as an alternative treatment of cutaneous Leishmaniasis in the hamster model. Memorias Instituto Oswaldo. 93, 515 (1998).
  11. Travi, B. L., Osorio, Y., Melby, P. C., Chandrasekar, B., Arteaga, L., Saravia, N. G. Gender is a major determinant of the clinical evolution and immune response in hamsters infected with Leishmania spp. Infect Immun. 70, 2288-2296 (2002).
  12. Osorio, Y., Melby, P. C., Pirmez, C., Chandrasekar, B., Guarín, N., Travi, B. L. The site of cutaneous infection influences the immunological response and clinical outcome of hamsters infected with Leishmania panamensis. Parasite Immunol. 25, 139-148 (2003).
  13. Osorio, Y., Bonilla, D. L., Peniche, A. G., Melby, P. C., Travi, B. L. Pregnancy enhances the innate immune response in experimental cutaneous leishmaniasis through hormone-modulated nitric oxide production. J. Leukoc. Biol. 83, 1413-1422 (2008).
  14. Espitia, C. M., Zhao, W., Saldarriaga, O., Osorio, Y., Harrison, L. M., Cappello, M., Travi, B. L., Melby, P. C. Duplex real-time reverse transcriptase PCR to determine cytokine mRNA expression in a hamster model of New World cutaneous leishmaniasis. BMC Immunol. 22, 11-31 (2010).
Cutane leishmaniasis in het dorsale huid van Hamsters: een bruikbaar model voor de screening van antileishmaniale Drugs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).More

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter