Summary
אופטימיזציה של מודל ניסיוני אוגר leishmaniasis עורית על ידי הזרקה של intradermal
Abstract
באופן מסורתי, הם אוגרים מחוסן באופן ניסיוני באף או שודד דרכים. עם זאת באתרים אלה כיב לא תמיד מתרחשת, מדידה של גודל הנגע הוא הליך קשה בבעלי חיים מראים קושי לאכול, לנשום ולנוע בגלל הנגע. על מנת לייעל את המודל אוגר עבור leishmaniasis עורית, זכר בוגר צעיר אוגרים זהובים נקבות (Mesocricetus auratus) הוזרקו intradermally עם 1 עד 1.5 x L0 7 promastigotes של מינים לישמניה ההתקדמות של נגעים הבאים על עור הגב הוערכו עד 16 שבועות זיהום הודעה. האוגר הזהוב נבחרה משום שהיא נחשבת הולמת ביו מודל להערכת תרופות נגד שושנת יריחו כאשר הם חשופים לסכנת הדבקה על ידי זנים שונים. דלקת עורית של תוצאות אוגרים ב נגעים כרוניים אך מבוקרת, לבין התפתחות קלינית עם סימנים דומים לאלה שנצפו אצל בני אדם. לכן, הקמת oו היקף הזיהום על ידי מדידת גודל הנגע פי בתחום indurations וכיבים אינו ריאלי. גישה זו הוכיחה צדדיות שלה וניהול קל במהלך חיסון, מעקב ואפיון של נגעים אופיינית (אולקוס), יישום של טיפולים באמצעות דרכים שונות וקבלת דגימות קליניות לאחר טיפולים שונים. באמצעות שיטה זו את איכות החיים של בעלי חיים על תנועה, בחיפוש אחר מזון ומים, משחקים ופעילויות חברתיות isalso משומרים.
Protocol
1. זיהום של אוגרים
1. בעלי חיים
נישואי קרובים אוגרים זהובים נשים וגברים (Mesocricetus auratus), 6-8 שבועות, במשקל 140-160 גרם משמשים. הם שוכנו במתקן בעלי החיים, לינה טמפרטורה מבוקרת, נמאס עם מזון מכרסמים רגיל יבשים מסופק עם libitum המודעה מים. כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים מאושרים על ידי הוועדה האתית המוסדית לשימוש בבעלי חיים ניסויית. לפני הזיהום ניסיוני עם חיות שושנת יריחו הם טפילים dermotropic חרמנית, מסומנים משוקלל על פי נהלים אחידים. עבור זיהוי מין, בעלי חיים נבדקות על מאפיינים בולטים כגון הדמיה של קו החלב ואת המרחק הקצר Ano באיברי המין אצל נשים, או הדמיה של האשכים מרחק גדול יותר בין פי הטבעת לבין העורלה אצל גברים. לאחר מכן, חיות מסומנים על ידי פירסינג באוזן או מכתים על שטח של העור עם ספוגית רטובהבחומצה picric. על ניקוב האוזן, אחרי לנקות עם אלכוהול 70% אוזן מנוקב באמצעות אגרוף באוזן עבור מכרסמים. האזור עם כלי דם יש להימנע. תרופות הרגעה או הרדמה עם 09:01 תערובת של קטמין (50 מ"ג / ק"ג) ו Xilacine (20 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally בהיקף של מחט 25-G-260 300μl מומלץ. לבסוף, בעלי חיים שקל על ידי הצבתם במלכודת או תיבת מותנית איזון ודיוק.
2. טפילים
Promastigotes של מינים שושנת יריחו dermotropic, כגון ל ' amazonensis, מתורבתים במדיום biphasic (NNN) נובי, MacNeal-Nicolle התרבות ב 26 ° C. Metacyclic (נייח) שלב promastigotes (5 ימים) areused להדביק את האוגרים. בקצרה, טפילים נקצרים, שטפתי פעמיים באמצעות חיץ מלוחים פוספט (PBS), ספר תוך התאמה 1 x 10 -7 (לגברים) או 1.5 x 10 7 (לנשים) טפילים ב 0.1 מ"ל PBS על יחסנו זכר או נקבה, בהתאמה,עם זאת, גודל inoculums עשויים להשתנות על פי המין שושנת יריחו (הליך לא רואים בסרט).
3. ניסיוני זיהום
שטח העור מגולח לפני חיסון. בקיצור, בעלי החיים הרדים ממוקמים במיקום נוטה ושימוש מספריים, שיער מוסר סנטימטרים מבסיס הזנב. לאחר לנקות את האזור מגולח עם תמיסת מלח סטרילית הבידוד הטפיל מוזרק intradermally עד קשריר נוצר.
4. מעקב קליני
בעלי חיים מנוטרים כל 7 ימים עד 4 - 6 שבועות לאחר חיסון על המראה של הנגע. זמן קצר, בעלי חיים משותקת במלכודת ואזור עור מחוסן הוא מישש. לאחר מכן, באזור קשיון של כיב נוצר מותווה ואת רוחב ואורך כיב נמדדים עם קליפר דיגיטלי.
2. טיפול אוגרים
1. Administration המתחמים
לוח הזמנים של הטיפול מתחיל כאשר בעלי החיים פיתחו נגעים כיבים (4-6 שבועות לאחר חיסון). בעלי החיים מחולקים בקבוצות של 5-6 חיות על מתחם זה להיבדק. תרכובות יכול להיות מנוהל על ידי מקומיים, נתיבי דרך הפה תוך שרירית או intralesional. לפני יישום של תרופות, אוגרים מורדמים וחבל הנגע הוא ניקה באמצעות תמיסת מלח או PBS. כאשר מתחם מוחל דרך מקומית או intralesional, אוגרים הם משותקים במלכודות המאפשרים לחשוף את האזור לטיפול בזמן, כאשר המתחם מנוהל על ידי נתיבי דרך הפה או תוך שרירית של אוגרים הם מהודק ידי בבסיס הצוואר. תוכנות) מקומי: מורכב isapplied על הנגע וכעבור דקות חיה מוחזר cage.b) להזרקה תוך שרירית, התרופה מוזרקת (200 μl לכל היותר) באמצעות השרירים semitendinous או semimembranous של אחוריים. ג) מינהל הפההכל Total, התרופה ניתנת בעלי חיים (200 μl לכל היותר) עד כ Oro-קיבה 14 גר בדיקה הקשורים מזרק 1 מ"ל. ד) להזרקה intralesional התרופה (100 לכל היותר μl) מזריקים בהדרגה בבסיס הכיב באמצעות מחט מד 26G עם שפוע ממוקם מטה. כל השטח של הנגע מכוסה על ידי סיבוב המחט. הטיפולים ניתנים מדי יום במשך 10-20 ימים, על פי תוכנית טיפולית מוגדרת.
2. מעקב קליני
כי במודל ניסיוני היעילות של תרכובות antileishmanial החדשים נקבע על פי הריפוי של פצעים וצלקות לאחר טיפול, ניטור קליני של כל חיה נעשה מדי שבוע בסוף הבקשה של המתחם ועד 3 חודשים לאחר מכן. במהלך המעקב, סוג של הנגע המתואר לבין קשיון ואזור כיב נמדדים עם קליפר דיגיטלי. הנוכחות של נגעים באזורים שוניםהאתר חיסון, כמו גם את מראה חזרה של הנגע מתואר גם רשום. כל שבועיים, חיות משוקללים ונגעים הם בתמונה. בעלי חיים הם נצפו מדי יום כדי לעקוב אחר: המראה) התנהגות פיזית (שיער תיאום, חום, עיניים, מיקום האוזניים, הטיפוח, עשיית הצרכים, נוכחות של נוזל ascitic, חרדה ואף התייבשות) ו ב) (ער, ערני, סקרן, קשוב , נשאר עם הקבוצה, מצפה אוכל ושתייה, וקשה לתפוס). האתר של יישום של המתחם הוא ציין גם את קיומו של hyperemia, דלקות, הסרת שיער חריפה.
אוגרים גם בלד ביום 45 לאחר סיום הטיפול כדי לקבוע את ערכי המטולוגיים סרולוגית שניתן הקשורות רעילות של תרכובות (ראו להלן).
היעילות של כל טיפול מוערך השוואת גודל הנגע לפני ואחרי טיפולים, תוך שימוש syst ציון הבאהאותם: לרפא (הריפוי של האזור 100% היעלמות מוחלטת של הנגע); שיפור קליני (הקטנת גודל של נגע ב 50%> האזור); כישלון קליני (הגדלת גודל של הנגע); על נסיגה של הנגע לאחר ריפוי). בסוף המחקר, חיות מוקרבים על ידי שאיפה של הרדמה הקודם CO2. לאחר מותו, הדגימות הנדרשות לניתוח parasitological, היסטולוגית ו סרולוגית נלקחים.
3. Parasitological בחינות
נוכחות של שושנת יריחו בדגימות של העור (הנגע או צלקת), הכבד, הטחול והכליות נקבעת ישירות על ידי בחינת מריחות מוכתמים Giemsa 1 ובדיקה histopathological של רקמות אלה (ראה להלן).
נטל טפיל באתר הנגע מוערך על ידי assay דילול גבול לפי טיטוס ועמיתיו (1985) 2. בקיצור, חתיכה קטנה של רקמה יוסרמבעל חיים אחד, שקל, ומעורים בפתרון PBS קר באמצעות הבוכנה במזרק. ההשעיה היא להשיג centrifuged ב 600g 10 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, supernatants את מבוטלים ואת כדורי הם resuspended במדיום 1640 RPMI השלימו עם אנטיביוטיקה 1% ו 10% בסרום העגל העובר. אני 100 ההשעיה מועברים כל אחד 96 בארות לצלחת microtitre המכיל מעולף בינוני NNN עם המדיום 50 μl של שניידר שמרו על 26 ° C. מספר טפילים קיימא במדגם זה נקבע על פי הדילול הגבוהה ביותר שבה promastigotes ניתן היה לזהות בבדיקה תחת מיקרוסקופ הפוכה מדי שבוע למשך חודש ימים.
4. לבדיקות היסטופתולוגיות של נגע העור (או צלקת) ורקמות אחרות
קטע 3 של הדגימה נלקחה ביופסיה מהכבד עור, כליות קבוע ב 10% בפורמלין מוטבע parafin. דגימה מן הטחול והלב יכול גם להיות מעובד. Fאייב סעיפים מיקרון של הרקמות קבועים הוכתמו haemotoxilin-eosin ובחן תחת מיקרוסקופ אופטי באמצעות 200X, 400X או טבילה שמן 1000x ללמוד אדריכלות מיקרו, מאפיינים של חדירה סלולרית, ואת קיומו או אי קיומו של טפילים. Photomicrographs נלקחים בשבי דיגיטלית ותמונות.
5. הערכת רעילות הטיפול
הפעילות הרעילה של המתחם מבוסס על המצב הפיזי ועל התנהגותם של בעלי החיים על פי הפרמטרים להשגחה במהלך מעקב קליני (ראה לעיל). רעילות נקבע גם על פי פרמטרים המטולוגיים מטבולית בדגימות דם ושינויים histopathological שנצפתה סעיפים רקמות מוכתמים haemotoxilin-eosin כמתואר לעיל.
דגימות דם נלקחו הלב, רצוי החדר. במבחן המטולוגיות, הדם מועבר צינורות EDTA anticoagulated ומעובד על פילתקנן פרוטוקולים ספירת דם מלאה. בדיקות סרולוגיות, הדם מועבר 1.5 eppendorf צלוחיות centrifuged לקבל נסיוב לניתוח חילוף החומרים של רמות קריאטינין, ALT ו BUN נמדד באמצעות קודאק Ektachemdry כימיה 3.
6. ניתוח נתונים
נתוני חיות שטופלו ומטופלים כראוי מושווים באמצעות מבחן של ANOVA. משמעות מוגדרת p <0.05.
4. נציג תוצאות
תקציר
המודל של אוגר leishmaniasis עורית שופרה במטרה באמצעות מודל זה ההקרנה יעילות התרופה. התפתחות הנגע ופרמטרים parasitological נחקרו על הזיהום העיקרי בעור עורי של אוגרים. נישואי קרובים אוגרים זהובים נשים וגברים (Mesocricetus auratus), 6-8 שבועות, הוזרקו intradermally עם 1 x 10 7 (לגברים) או 1.5 x 10 7 (לנשים) metacyclIC (בשלב נייח) promastigotes של ל amazonensis. גושים הופיעו 20 - 35 יום לצרכן, עם כיבים להרכיב לאחר 4-6 שבועות לאחר ההדבקה פיי הוקמה, את היעילות של אנטימון pentavalent (SbV) בשני מינונים היה evalauted. אוגרים חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות של 5 חיות כל ומטופל עם antimoniate meglumine ב 80 או 120 מ"ג SbV / ק"ג מדי יום במהלך 10 ימים על ידי תוואי תוך שרירית. הקבוצה השלישית טופלה לשריר כמו פלצבו עם PBS. קבוצה של שלושה בעלי חיים היו מטופלים ושימש בקרת שלילית. התגובה לטיפול זה היה במעקב 3 חודשים לאחר תום תקופת הטיפול.
1. כמובן קליני לאחר ל זיהום amazonensis של האוגר הזהוב (Mesocricetus auratus)
אוגרים נגועים בעור הגב בעקביות לפתח כיב ניכר קלינית של האפידרמיס ב 4-6 שבועות לאחר ההדבקה. נגעים להתחיל עם גושים קטנים וכיבים שהסתיימו כילהגדיל את שטחו בהתאם לזמן שלאחר זיהום ולהגיע מה נחשב גודל אופטימלי להערכת ההשפעה של תרופות ניסיוניות של 4 עד 6 שבועות לאחר ההדבקה (18,99 ל 54,7 מ"מ 2 בשבוע 4 ו 35,55 ל 92,71 מ"מ 2 בשבוע 6) (Figures1, 2). הנגעים טען לאחר מכן כיב מאליו עד 20 WK לאחר זיהום, אז הניסויים הופסקו (Figure1).
זיהום על ידי ל ' amazonensis אינה משפיעה על משקל הגוף של אוגרים זה נע בין 104,9 ל גרם 124,69 ו 129,71 עד 134,02 גר ב אוגרים נגוע ולא נגוע, בהתאמה (p <0.05, אנובה). בעלי החיים השיגו ממוצע שנתי של 25,58 ± 5,98% ממשקל הגוף במהלך תקופת המחקר. הערכים seric של קריאטינין ו אלאנין פרמטרים transferase (ALT) ו hemogram אמינו היו דומים לערכים הפניות אוגרים נגועים נגוע ו שושנת יריחו. רק חנקן אוריאה לחמניה (BUN) היה ברמהugmented ב 60% של בעלי חיים נגועים.
ניתוח Histopathological של נגעים ב אוגרים נגועים ל amazonensis הראתה הבדלים הקשורים לאותם בעלי חיים נגוע. באופן כללי, ביופסיות עור של אוגרים נגוע לא הראו תגובה דלקתית, או כל שינוי היסטולוגי (איור 3 א), בעוד שאלו נגוע ל amazonensis לפתח דלקת עור granulomatous ונוכחות שפע של מקרופאגים שחדר הדרמיס (איור 3 ב). ניתוח Histopathological של רקמות מ אוגרים נגוע ל amazonensis ומטופל עם antimoniate meglumine במינונים של 80 ו 120 מ"ג SbV / ק"ג / יום במהלך 10 ימים הראו שינויים הקשורים לתהליך זיהום דומות לאלו שנצפו בקבוצת הביקורת (נגוע ולא טופלו). באופן כללי, דגימות עור של אוגרים הראו רמה קלה של plasmocytes (20%) ו PMN (80%) תאים מלווים חדירת מתונה של לימפוציטים (80%), ו קלה (20%) או חמורה (80%) infiltration של מקרופאגים (טבלה 2). תצפיות אלו מתאימות אבחון של דלקת עור granulomatous, אירוע דלקתי פוגע בדרמיס שרירים subjacent. זה הנגע העיקרי קשור לזיהום, אשר תואם ביטוי חמור של leishmaniasis עורית בכל בעלי החיים במחקר. קשר זה היה בקורלציה סטטיסטית כאשר צ'י מרובע של פירסון, אשר הניב p <0.05. דגימות של כליות% 60-100 של בעלי חיים הראו היפרפלזיה מתונה בקליפת הכליה glomerules בליווי ניוון קל של הכליות ב 75% של בעלי חיים. תצפיות אלו עולים בקנה אחד עם glomerulonefritis קרום שגשוג, אבחנה אשר נמצא קשור בעבר לזיהום כתוצאה מזיהום על ידי מינים אחרים שושנת יריחו. הקשר הסטטיסטי היה גדול עם צ'י מרובע של פירסון p <0.05. את הכבדים של 40-100% של בעלי חיים בכל הקבוצות הראו שינויים קלים vacuolar את hepatocytes, שעשוי להיות associatאד לתהליכים פיזיולוגיים כגון הצטברות hepatocytic של גליקוגן. אחרים רקמת הכבד ליקויים כגון ניוון סיסטיק שומן, ואת גודש מתאימות תהליך ההדבקה. תצפיות אחרות כגון שינויים vacuolar ב hepatocytes, cardiomegalies, הנוכחות של תכלילים של eosinophiles intracytoplasmic, כמו גם vacuolization של תאים צינורות כליות אינם קשורים מבחינה סטטיסטית (p <0.05) להשפעה רעילה של המתחם נבדק סביר בשל תהליך פיזיולוגי של אוגרים את.
2. היעילות הטיפולית של antimoniate meglumine במודל אוגר
הפנוטיפ הקליני של אוגרים נגועים בנקודות זמן שונות לאחר הטיפול מסוכמת בטבלה 1. טיפול antimoniate meglumine תוך שרירית במינון של 120 מ"ג SbV / ק"ג / יום במשקל במהלך 10 ימים היה יעיל מאוד וגורם רגרסיה מלאה של ל נגעים amazonensis בבעלי חיים כל (איור 4). אחוז הריפוי היה 100% בתוך 2 ו 8 שלאחר הטיפול לתקופה בשבוע. עם זאת, לאחר שלושה חודשים הישנות של הנגע נצפתה 20% אוגרים. כאשר meglumine antimoniate היה מנוהל במשקל 80 SbV / ק"ג גוף מ"ג, תרופה מוחלטת נצפתה רק 3 חיות. בשני בעלי חיים אחרים הנגע ירד ב 33,9 ו - 69,0%, בהתאמה (איור 5). לאחר שלושה חודשים, ל amazonensis נשאר נוכח העור של כל בעלי החיים שטופלו antimoniate meglumine במינון של 80 מ"ג SbV / ק"ג / יום אחד בלבד של חיות שטופלו 120 מ"ג SbV / ק"ג / יום של antimoniate meglumine. מינון מרפא של 120 מ"ג תוך שרירית SbV / ק"ג / יום במהלך 10 ימים נקבע.
שימוש assay דילול הגבלת מספר משוער של טפילים הראו ירידה משמעותית בקבוצה שטופלה עם antimoniate meglumine לעומת הביקורת (ללא טיפול) שלילי הרכב (פלצבו) קבוצת טיפול (p <0.001). טפילים קיימא (0.4-1 , 6 מ"ג לכל טפילים של רקמת העור) התגלו באתר הנגע של בעלי חיים שלא טופלו לבין אלה שטופלו PBS. טפילים היו מבודדים רק מאותם בעלי חיים שלא מגיבים לטיפול עם meglumine antimoniate 1: בעלי חיים שטופלו ב 120 מ"ג / ק"ג / יום (איור 5 ב ') ושני אוגרים שטופלו במינון 80 מ"ג / ק"ג / יום (איור 5 ג). ההבדל לא נצפו עומס הטפיל של אוגרים כי לא לרפא לאחר קבלת meglumine antimonite בהשוואה לאותם בעלי חיים שלא טופלו או מטופלים עם PBS.
ב אנליזה פתולוגית בכליה של ביופסיות העור מפני אוגרים שטופלו תוך שרירית meglumine antimoniate ב 120 מ"ג SbV / ק"ג / יום טפילים לא נצפות, מקרופאגים וכמה לימפוציטים שחדר הדרמיס נראים (איור 6 א, 6 ב). בניגוד לעבר, כאשר אוגרים טופלו meglumine antimoniate ב 80 מ"ג SbV / ק"ג / יום, דרמטיטיס granulomatous עם נוכחות שפע של מקרופאגים שחדר הדרמיס בהרחבה הוא ציין (איור 6 ג, 6 ד).
class = "jove_step"> 3. רעילות
באמצעות תוכנית טיפולית זהה למחקר יעילות, רעילות של meglumine antimoniate במשקל 80 ו - 120 SbV / ק"ג גוף מ"ג הוערך. מצב הבריאות הכללי ומשקל הגוף היו במעקב עד 3 חודשים לאחר המינון האחרון. הטיפול לא השפיע על משקל הגוף של אוגרים זה נע בין 104,9 ל גרם 124,69 ו 129,71 עד 134,02 גר ב אוגרים נגוע ולא נגוע, בהתאמה. בעלי החיים השיגו ממוצע שנתי של 27,59 ± 4,22% ממשקל הגוף במהלך הטיפול ו 28,74 ± 2,26% במהלך המעקב (p <0.05, אנובה). אובדן משקל לא נצפתה בכל קבוצת טיפול (מידע לא מוצג). הערכים seric של קריאטינין ו אלאנין פרמטרים transferase (ALT) ו hemogram אמינו היו דומים לערכים הפניות שלא טופלו ו meglumine אוגרים שטופלו antimoniate. רק חנקן אוריאה לחמניה (BUN) רמת נוספה ב 20% של בעלי חיים שטופלו.
Histopat ניתוח hological של רקמות מ אוגרים נגוע ל amazonensis ומטופל עם antimoniate meglumine במינונים של 80 ו 120 מ"ג SbV / ק"ג / יום במשך 10 ימים לא הראו שינויים הקשורים רעילות התרופה.
מאגר פוספט מלוחים, ימים ב לאחר הטיפול.
טבלה 1. פנוטיפ קליני ל amazonensis נגוע בניסוי אוגרים לאחר טיפול meglumine antimoniate
היעילות של כל טיפול הוערך השוואת גודל הנגע לפני ואחרי טיפולים, באמצעות מערכת הניקוד הבאה: קיור (הריפוי של האזור 100% היעלמות מוחלטת של הנגע); שיפור קליני (הקטנת גודל של נגע ב 50%> האזור); כישלון קליני (הגדלת גודל של הנגע); הישנות (הפעלה מחדש של הנגע אחרי תרופה).
= "Jove_content"> 
: סימן נעדר; NA: לא ישים; מ: קל, M: בינוני, S: קשה; PMN: נויטרופילים polymorphonuclear; NSL: לא נגע משמעותי, GDM: dermatomyositis granulomatous, PGD: אטופיק Pyogranulomatous. 1. Lymphangiectasia: 2. מינרלים כמו חומר.
טבלה 2. אנליזה פתולוגית בכליה של העור של אוגרים נגוע באופן ניסיוני עם ל ' amazonensis ומטופל עם meglumine antimoniate
באיור 1. קורס של פיתוח הנגע בעור לאחר ההדבקה ב אוגרים מחוסן intradermally עם 1-1.5 x 10 7 ל metacyclic amazonensis (שלב נייח) promastigotes במהלך 20 שבועות. ציר Y מייצג את אזור הכיב ב מ"מ.
איור 2. Photogההיסטוריה של התפתחות raphyic ulcerating הנגע בעור הגב של האוגר הזהוב לאחר חיסון intradermal של 10 x 10 7 ב 2 שבועות (א), 4 שבועות (ב) ו - 6 שבועות (ג).
איור 3 העור ביופסיה מ (א) אוגר נגוע ואינם מטופלים. אין תגובה דלקתית לא שינוי משמעותי היסטולוגית הוא ציין, (ב) אוגר נגוע מטופל: אטופיק granulomatous עם נוכחות של תאים ענק multinucleated (החץ בתוספת כוכבית) ועל טפילים בשפע (שחור החצים) ומקרופגים (חיצים לבנים) שחדר הדרמיס. Hematoxylin Eosin-400x הכתם.
איור 4. היסטוריה מצולמת של תגובה קלינית של אוגרים נגוע ל amazonensis ומטופל עם שרירית meglumine antimoniate ב 120 מ"ג SbV / ק"ג / יום דורין ג'10 ימים. תמונות להראות את המראה של הנגע לפני הטיפול (א), בסופו של הטיפול (יום 10) (ב), במהלך תקופת המעקב: יום 30 (ג), 60 (ד) ו 90 (ה) לאחר הטיפול.
איור 5. יעילות antimoniate meglumine בטיפול leishmaniasis עורית של אוגרים. אוגרים זהב נדבקו ל amazonensis בעור הגב. לאחר 6 שבועות של זיהום שהם לא מטופלים (א) או טיפול לשריר במשך עשרה ימים עם PBS לבד (ב), meglumine antimoniate 120 מ"ג SbV / ק"ג / יום (ג) או 80 מ"ג SbV / ק"ג / יום (ד). הגרפים מראים את אחוז ירידה בגודל הנגע בסוף הטיפול (יום 0), ועל ימים 15, 30, 60 ו 90 של המעקב לאחר תום הטיפול. p <0.001 עבור 120 או 80 מ"ג SbV / ק"ג / יום טיפול מול הרכב ולא.
"/>
איור 6. העור ביופסיה של אוגרים נגועים ומטופל עם antinmoniate megumine לשריר ב 120 מ"ג SbV / ק"ג / יום (א, ב) ו 80 מ"ג SbV / ק"ג / יום (ג, ד). נוכחות של מקרופאגים ו לימפוציטים נדירים שחדר הדרמיס. טפילים לא נשמרים. Hematoxylin-Eosine כתם 200x (א), 1000x (ג) דלקת עור granulomatous עם נוכחות שפע של מקרופאגים שחדר הדרמיס בהרחבה (ג). מקרופאגים המקציפות עם טפילים phagocyted. Hematoxylin-Eosine כתם 200x (ב), 1000x (ד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leishmaniasis עורית היא אנדמית באזורים הטרופיים neotropics. הוא המכונה לעתים קרובות קבוצה של מחלות בגלל קשת מגוונת של ביטויים קליניים, אשר נע בין גושים קטנים עורית להרס הרקמה הרירית ברוטו. סמים זמינים ביותר הם יקרים, דורשים משטרי הטיפול ארוכים נעשים יעילים יותר ויותר, דבר המחייב את הגילוי של תרופות חדשות.
מודל העכבר הוא בשימוש נרחב אבל יש כמה חסרונות. כך למשל, על בסיס פגיעה שהתפתחה לאחר ההזרקה intradermal של promastigotes של dermotropic מינים שושנת יריחו, העכברים ניתן לחלק לשלוש קבוצות: רגישים מאוד עם זיהום מתמשך המאופיין נגע כיבי הרחבת כפי שניתן לראות BALB / C ו DBA / 2, DBA / 3 עכברים, קבוצה עמידות יחסית שבו נגעים עשוי לפתור בתוך 8 שבועות כפי שניתן לראות CBA / H, C3H/He ו / J וקבוצה עמיד מאוד, שבו לא נגע typi אמיתיקאל של leishmaniasis עורית מתפתחת על הזריקה כפי שניתן לראות NZB ו C57Bl / 6 בעכברים 4. בניגוד למודל Murine של leishmaniasis עורית בה מהלך המחלה משתנה באופן ניכר בין זני נפוצות שונות עכבר טהורים ומינים שושנת יריחו, האוגר הזהוב, Mesocricetus auratus נחשבת הולמת ביו מודל להערכת תרופות נגד לישמניה המינים כפי שהם רגישים זיהום על ידי זנים שונים של שושנת יריחו. 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. חיסון של השלב (נייח) promastigotes metacyclic של כל המינים שושנת יריחו dermotropic הוא מסוגל לגרום פגיעות עוריות בין 1 ו 2 חודשים חיסון הודעה. נגעים מתחזקת 20 ימים פיי כמו papules אשר התפתח גושים ואחר כך, כדי כיבים. לפי האתר חיסון (PE חוטם, foodpad, האוזן או הזנב בסיס) אוגר מציג האבולוציה המחלה צפויה לאחר ההדבקה ניסיוני, רוב ההשעה דואר מאופיין בפיתוח של הנגע כרונית המקומי ulcerating דומים לאלה שנצפו בבני אדם עם leishmaniasis עורית. עם זאת, כמו בבני אדם, נגעים בגדלים מגוונים בהתאם למעמד החיסונית של כל אדם ועל כן, אוגרים כמה ניסיון לפתור את הנגע וכתוצאה מכך צמצום גודלו של הנגע ניתן לראות.
אמנם מאמר זה מתאר את זיהום ניסיוני בעור הגב של אוגרים באמצעות promastigotes של ל amazonesis, מודל זה הוא גם ריאלי עבור מינים אחרים שושנת יריחו dermotropic, משנה רק את הגודל של הבידוד. לסיכום, הגישה של הזרקה intradermal של promastigotes על עור הגב מוכיח כי למרפאה פתולוגי התכונות של leishmaniasis עורית הנגרמת בעור הגב של אוגרים דומים להפליא המחלה האנושית. בנוסף, מעקב קליני של כיבים לאחר טיפול עם תרכובות מסוימות או Dשטיחים הוא הקל במודל של CL הנגרמת בעור הגב. האבולוציה של נגעים נקבעת בקלות על ידי השוואת גודל הנגע שהושג לפני ואחרי הטיפול. תגובה קלינית במונחים של תרופה אחריו בקלות לפי epithelialization מחדש (כפי שניתן לראות באיור 4). אנו מסיקים כי זיהום ניסיוני בעור הגב של אוגרים עם מינים שושנת יריחו מהווה מודל שימושי כדי לאמת את הפוטנציאל של תרכובות הם מועמדים לתרופות antileishmanial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תרומות של הוועדה למחקר באוניברסיטת Antioquia (CODI), המכון הקולומביאני לפיתוח המדע והטכנולוגיה - COLCIENCIAS והמרכז פיתוח מוצרים נגד מחלות טרופיות - CIDEPRO.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Reagent | Holliday –Scott S.A | ||
| Xilacine | Reagent | Synthesis | ||
| PBS | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-136 | |
| Digital caliper | Equipment | Fisher Scientific | 15-077-958 | |
| Giemsa | Reagent | Sigma-Aldrich | GS1L-1L | |
| Formalin | Reagent | Nova lab | 11273 | |
| Paraffin | Reagent | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Haemotoxilin | Reagent | Nova lab | 10870103 | |
| Eosin | Nova lab | 10870203 | ||
| Kodak Ektachem dry chemistry | Equipment | Kodak Ektachem | DT-60 | |
| meglumine antimoniate | Reagent | Aventis | ||
| Microscopy | Equipment | Nikon Instruments | YS2-T |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis. Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis WHO. 949, (2010).
- Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol. 7, 545-555 (1985).
- Reynolds, K. M. The Kodak Ektachem dry layer technology for clinical chemistry. Upsala. J. Med. Sci. 91, 143-146 (1986).
- Handman, E., Ceredig, R., Mitchell, G. F. Murine cutaneous leishmaniasis: disease patterns in intact and nude mice of various genotypes and examination of some differences between normal and infected macrophages. Australian J. Exp. Biol. Med. Sci. 57, 9-29 (1979).
- Hanson, W., Chapman, W., Waits, V., Lovelace, J. Development of Leishmania (Viannia) panamensis lesions and relationship of numbers of amastigotes to lesion area antimony-treated and untreated hamsters. J. Parasitol. 77, 780-783 (1991).
- Henao, H. H., Osorio, Y., Saravia, N. G., Gómez, A., Travi, B. Efficacy and toxicity of pentavalentantimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomédica. 24, 393-402 (2004).
- Travi, B. L., Martinez, J. E., Zea, A. Antimonial treatment of hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis: assessment of parasitological cure with different therapeutic schedules. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87, 567-569 (1993).
- Hommel, M., jaffe, C. L., Travi, B., Milon, G. Experimental models for leishmaniasis and for testing anti-leishmanial vaccines. Ann. Trop. Med. Parasitol. 89, 55-73 (1995).
- Travi, B. L., Osorio, Y., Saravia, N. G. The inflammatory response promotes cutaneous metastasis in hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis. J. Parasitol. 82, 454-457 (1996).
- Travi, B. L., Osorio, Y. Failure of Albendazole as an alternative treatment of cutaneous Leishmaniasis in the hamster model. Memorias Instituto Oswaldo. 93, 515 (1998).
- Travi, B. L., Osorio, Y., Melby, P. C., Chandrasekar, B., Arteaga, L., Saravia, N. G. Gender is a major determinant of the clinical evolution and immune response in hamsters infected with Leishmania spp. Infect Immun. 70, 2288-2296 (2002).
- Osorio, Y., Melby, P. C., Pirmez, C., Chandrasekar, B., Guarín, N., Travi, B. L. The site of cutaneous infection influences the immunological response and clinical outcome of hamsters infected with Leishmania panamensis. Parasite Immunol. 25, 139-148 (2003).
- Osorio, Y., Bonilla, D. L., Peniche, A. G., Melby, P. C., Travi, B. L. Pregnancy enhances the innate immune response in experimental cutaneous leishmaniasis through hormone-modulated nitric oxide production. J. Leukoc. Biol. 83, 1413-1422 (2008).
- Espitia, C. M., Zhao, W., Saldarriaga, O., Osorio, Y., Harrison, L. M., Cappello, M., Travi, B. L., Melby, P. C. Duplex real-time reverse transcriptase PCR to determine cytokine mRNA expression in a hamster model of New World cutaneous leishmaniasis. BMC Immunol. 22, 11-31 (2010).
