Summary
Cutaneous लीशमनियासिस के लिए प्रयोगात्मक हम्सटर मॉडल की त्वचा के अंदर इंजेक्शन द्वारा अनुकूलन
Abstract
परंपरागत रूप से, hamsters, प्रयोगात्मक थूथन या लुटेरा में inoculated हैं. लेकिन इन साइटों में एक अल्सर हमेशा नहीं होता है, घाव आकार का माप एक कठिन प्रक्रिया है और जानवरों के लिए खाना, सांस लेना और घाव की वजह से कदम कठिनाई. आदेश में cutaneous लीशमनियासिस, युवा वयस्क पुरुष और महिला स्वर्ण hamsters के लिए हम्सटर मॉडल का अनुकूलन करने के लिए (Mesocricetus औराटस) intradermally पृष्ठीय त्वचा पर 1 के लिए 1.5 x l0 लीशमैनिया प्रजातियों के 7 promastigotes और बाद में घावों की प्रगति के साथ अंतःक्षिप्त थे अप करने के लिए मूल्यांकन किया गया 16 सप्ताह के बाद संक्रमण. सुनहरा हम्सटर चुना गया था क्योंकि यह जैव मॉडल लीशमैनिया के खिलाफ दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त माना जाता है के रूप में वे विभिन्न प्रजातियों से संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. पुरानी लेकिन नियंत्रित घावों, और इसी तरह के संकेत के साथ मनुष्य में मनाया उन लोगों के लिए एक नैदानिक विकास में hamsters के परिणाम की त्वचा संबंधी संक्रमण. इसलिए, स्थापना ओच indurations और अल्सर के क्षेत्र के अनुसार घाव के आकार को मापने के द्वारा संक्रमण की हद तक संभव है. इस दृष्टिकोण टीका के दौरान अपनी बहुमुखी प्रतिभा और प्रबंधन आसान साबित हो गया है, ऊपर का पालन करें और लक्षण वर्णन ठेठ घावों (अल्सर), उपचार के आवेदन के विभिन्न नैदानिक नमूनों के और तरीके प्राप्त करने के माध्यम से विभिन्न उपचार के बाद. पशु जीवन की हरकत के बारे में गुणवत्ता, भोजन और पानी, खेल और सामाजिक गतिविधियों isalso संरक्षित के लिए खोज इस विधि का उपयोग करके.
Protocol
1. हैम्स्टर का संक्रमण
1. पशु
जन्मजात महिला और पुरुष सुनहरा (Mesocricetus औराटस) हैम्स्टर, 6-8 सप्ताह, 140-160 ग्राम वजन का उपयोग किया जाता है. वे जानवरों की सुविधा में रखे जाते हैं, तापमान नियंत्रित आवास में, मानक कृंतक सूखे भोजन के साथ खिलाया और पानी यथेच्छ के साथ प्रदान की. सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं प्रयोगात्मक पशु उपयोग के लिए संस्थागत नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं. इससे पहले कि विशिषकर त्वचा पर कार्य करने वाला लीशमैनिया परजीवी पशुओं के साथ प्रयोगात्मक संक्रमण sexed कर रहे हैं चिह्नित है, और मानकीकृत प्रक्रिया के अनुसार भारित. Sexing के लिए, जानवरों स्तन लाइन और ano - जननांग महिलाओं में कम दूरी के दृश्य, या अंडकोष और पुरुषों में गुदा और चमड़ी के बीच अधिक से अधिक दूरी के दृश्य के रूप में विशिष्ट सुविधाओं के लिए निरीक्षण कर रहे हैं. फिर, जानवरों कान छेदने या लथपथ झाड़ू के साथ त्वचा के एक क्षेत्र को धुंधला करके चिह्नित कर रहे हैंरंगाई एसिड में. कान वेध के लिए, 70% शराब के साथ स्वच्छ कृन्तकों के लिए एक कान पंच का उपयोग करने के बाद कान में छेद किया है. रक्त वाहिकाओं के साथ एक क्षेत्र से परहेज किया जाना चाहिए. बेहोश करने की क्रिया या Ketamine (50 मिलीग्राम / किग्रा) और Xilacine (20 मिलीग्राम / किग्रा) 260 300μl सुई 25 जी के एक मात्रा में intraperitoneally के एक मिश्रण 09:01 साथ संज्ञाहरण की सिफारिश की है. अंत में, पशुओं के लिए उन्हें एक जाल या कि एक सटीक संतुलन पर वातानुकूलित बॉक्स में रखकर तौल रहे हैं.
2. परजीवियों
विशिषकर त्वचा पर कार्य करने वाला लीशमैनिया प्रजातियों जैसे एल promastigotes amazonensis, Biphasic Novy के MacNeal है Nicolle (NNN) संस्कृति माध्यम में 26 में संवर्धित कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस Metacyclic (स्थिर) चरण promastigotes (5 दिनों पूर्व) hamsters के संक्रमित areused. संक्षेप में, परजीवी काटा जाता है, दो बार फॉस्फेट बफर (पीबीएस) खारा, गिना और क्रमश: पुरुष या महिला, inoculating के लिए 1 परजीवी x 10 (पुरुषों के लिए) 7 या 1.5 x 10 7 (महिलाओं के लिए) 0.1 मिलीग्राम पीबीएस में समायोजित का उपयोग धोया,लेकिन, inoculums आकार लीशमैनिया प्रजातियों (प्रक्रिया वीडियो में दिखाया नहीं) के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.
3. प्रयोगात्मक संक्रमण
एक त्वचा क्षेत्र टीका से पहले के बाल काटे है. संक्षेप में, anesthetized जानवरों प्रवण स्थिति में रखा जाता है और कैंची का उपयोग कर, बाल पूंछ के आधार से दो इंच निकाल दिया जाता है. बाँझ नमकीन घोल के साथ मुंडा क्षेत्र को साफ करने के बाद परजीवी inoculum intradermally इंजेक्शन है जब तक एक पौधों पर छोटा दाना बनाई है.
4. नैदानिक ऊपर का पालन करें
पशु हर 7 दिनों की निगरानी कर रहे हैं 4 से 6 सप्ताह के बाद घाव की उपस्थिति के लिए टीका. शीघ्र ही, पशुओं के एक जाल में स्थिर कर रहे हैं और टीका त्वचा क्षेत्र palpated है. तो, अल्सर के गठन कठोरता क्षेत्र चित्रित और अल्सर की चौड़ाई और लंबाई एक डिजिटल नली का व्यास के साथ मापा जाता है.
2. हैम्स्टर का उपचार
1. व्यवस्थापकयौगिकों की istration
उपचार अनुसूची शुरू होता है जब जानवरों ulcerated घावों (4-6 सप्ताह बाद टीका) विकसित किया है. पशु 5-6 पशुओं के समूह में प्रत्येक परिसर का परीक्षण किया जा करने के लिए वितरित कर रहे हैं. कम्पाउँड सामयिक, मौखिक, इंट्रामस्क्युलर या intralesional मार्गों द्वारा प्रशासित किया जा सकता है. दवाओं के आवेदन से पहले, hamsters के संवेदनाहृत हैं और घाव क्षेत्र खारा समाधान या पीबीएस का उपयोग करते हुए साफ किया जाता है. जब यौगिक सामयिक या intralesional के माध्यम से लागू किया जाता है, hamsters के जाल कि बेनकाब क्षेत्र का इलाज, जबकि जब यौगिक मौखिक या अंतर्पेशीय मार्गों के द्वारा प्रशासित किया जाता है हैम्स्टर्स सुरक्षित रूप से गर्दन के आधार से बांधा जाता है में स्थिर कर रहे हैं. ) सामयिक आवेदन: यौगिक घाव पर isapplied और कुछ ही मिनटों के बाद पशु cage.b के लिए वापस आ रहा है intramuscular इंजेक्शन के लिए), दवा (200 μl अधिकतम) hindquarters के semitendinous या semimembranous में मांसपेशियों के माध्यम से इंजेक्शन है. ग) मौखिक प्रशासन के लिएtration, दवा ऑरो - गैस्ट्रिक जांच 14G 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा के माध्यम से पशु (200 μl अधिकतम) प्रदान की जाती है. घ) intralesional इंजेक्शन दवा (100 μl अधिकतम) धीरे - धीरे नीचे रखा उठाव के साथ एक 26G गेज सुई का उपयोग अल्सर के आधार पर इंजेक्शन है. घाव के पूरे क्षेत्र में सुई की रोटेशन के द्वारा कवर किया जाता है. उपचार 10-20 दिनों के दौरान दैनिक प्रशासित रहे हैं परिभाषित चिकित्सकीय योजना के अनुसार,.
2. नैदानिक ऊपर का पालन करें
क्योंकि इस प्रयोगात्मक मॉडल में नए antileishmanial यौगिकों के प्रभाव को भरने और घावों के उपचार के बाद scarring के अनुसार निर्धारित किया जाता है, प्रत्येक जानवर के एक नैदानिक निगरानी साप्ताहिक परिसर और उसके बाद तीन महीने के आवेदन के अंत में किया जाता है. निगरानी के दौरान, घाव के प्रकार वर्णित है और एक डिजिटल नली का व्यास के साथ कठोरता और अल्सर क्षेत्र मापा जाता है. करने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में घावों की उपस्थितिटीका के रूप में के रूप में अच्छी तरह से घाव के relapses की उपस्थिति साइट भी वर्णित है और दर्ज की गई. हर दो हफ्ते, जानवरों भारित कर रहे हैं और घावों कल्पना कर रहे हैं. पशु दैनिक मनाया जाता है पर नजर रखने के) शारीरिक उपस्थिति (बाल, समन्वय, तापमान कान, आँखें स्थिति, सौंदर्य, शौच, जलोदरग्रस्त तरल पदार्थ की उपस्थिति के आंदोलन, और निर्जलीकरण) और ख) व्यवहार (जाग, चेतावनी, उत्सुक चौकस, समूह के साथ रहता है, भोजन और पीने, और कड़ी करने के लिए आगे लग रहा है को पकड़ने के लिए). परिसर के आवेदन की साइट भी hyperemia, सूजन, और काटने और बालों को हटाने की उपस्थिति के लिए मनाया जाता है.
Hamsters भी हिमेटोलोजिकल और सीरम वैज्ञानिक मूल्यों है कि यौगिकों की विषाक्तता (देखें नीचे) के साथ जुड़ा हो सकता है निर्धारित करने के लिए उपचार के अंत के बाद 45 दिन में लहूलुहान कर रहे हैं.
प्रत्येक उपचार की प्रभावशीलता घाव आकार के पहले और उपचार के बाद की तुलना, निम्न स्कोर syst का उपयोग मूल्यांकन किया हैउन्हें: (100% क्षेत्र और घाव की पूरी गायब की चिकित्सा) ठीक हो, नैदानिक सुधार (> क्षेत्र के 50% में घाव के आकार को कम करने), नैदानिक विफलता (घाव के आकार में वृद्धि), पतन का घाव पर इलाज के बाद). अध्ययन के अंत में, जानवरों सीओ 2 पिछले संज्ञाहरण की साँस लेना द्वारा बलिदान कर रहे हैं. मृत्यु के बाद, parasitological, histological और सीरम वैज्ञानिक विश्लेषण के लिए आवश्यक नमूने ले रहे हैं.
3. Parasitological परीक्षा
त्वचा (घाव या निशान) से नमूनों में लीशमैनिया की उपस्थिति, तिल्ली, जिगर और गुर्दे सीधे 1 Giemsa और इन ऊतकों की histopathological परीक्षा (देखें नीचे) के साथ दाग स्मीयरों की जांच करके निर्धारित किया जाता है.
घाव साइट में परजीवी बोझ सीमा कमजोर पड़ने परख द्वारा टाइटस और उनके सहयोगियों (1985) 2 के अनुसार अनुमान है. संक्षेप में, ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा निकाल दिया जाता हैप्रत्येक जानवर से तौला, और ठंड पीबीएस एक सिरिंज सवार का उपयोग समाधान में homogenized. प्राप्त निलंबन 600g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर Centrifuged इसके बाद, supernatants त्याग और छर्रों RPMI 1640 एंटीबायोटिक दवाओं के 1% और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक मध्यम में resuspended हैं. निलंबन के एक सौ मैं microtitre 50 μl श्नाइडर के माध्यम साथ NNN मध्यम मढ़ा युक्त थाली करने के लिए 96 कुओं के प्रत्येक के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और 26 पर रखा डिग्री सेल्सियस प्रत्येक नमूने में व्यवहार्य परजीवी की संख्या जिस पर promastigotes एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत परीक्षा द्वारा किया जा सकता है हर हफ्ते एक महीने के लिए पता लगाया उच्चतम कमजोर पड़ने से निर्धारित किया जाता है.
4. त्वचा के घाव के histopathologic परीक्षा (या निशान) और अन्य ऊतकों
बायोप्सी नमूना त्वचा, जिगर और गुर्दे से लिया की एक तिहाई टुकड़ा 10 formalin% में तय हो गई है और Parafin में एम्बेडेड. तिल्ली और दिल से नमूना भी संसाधित किया जा सकता है. एफive अचल ऊतकों के माइक्रोन वर्गों haemotoxilin - लाल भामसान रंग के साथ दाग रहे थे और एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप 200X, 400x या 1000x तेल विसर्जन का उपयोग करने के लिए माइक्रो वास्तुकला, घुसपैठ सेलुलर की विशेषताओं, और या परजीवी की उपस्थिति और अनुपस्थिति अध्ययन के तहत जांच की. Photomicrographs लिया और डिजिटल छवियों पर कब्जा कर लिया.
5. उपचार विषाक्तता का मूल्यांकन
परिसर के विषाक्त गतिविधि के दौरान निगरानी ऊपर का पालन करें (ऊपर देखें) नैदानिक मानकों के अनुसार जानवरों के शारीरिक और व्यवहार शर्त पर आधारित है. विषाक्तता भी रक्त के नमूने histopathological haemotoxilin - लाल भामसान रंग के साथ दाग ऊतक वर्गों में मनाया परिवर्तन ऊपर वर्णित के रूप में हिमेटोलोजिकल और चयापचय मापदंडों के अनुसार निर्धारित किया जाता है.
दिल, अधिमानतः निलय से रक्त के नमूने ले रहे हैं. हिमेटोलोजिकल परीक्षण करने के लिए, रक्त EDTA के anticoagulated ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर रहा है और अनुसार संसाधितपूर्ण रक्त गणना के लिए प्रोटोकॉल का मानकीकरण. सीरम वैज्ञानिक परीक्षण करने के लिए, रक्त 1.5 Eppendorf शीशियों के लिए स्थानांतरित कर रहा है और क्रिएटिनिन, ALT, और बन स्तर कोडक Ektachemdry रसायन शास्त्र 3 का उपयोग करके मापा की चयापचय विश्लेषण के लिए सीरम प्राप्त Centrifuged.
6. डेटा विश्लेषण
और इलाज जानवरों से डेटा की तुलना में एनोवा परीक्षण का उपयोग कर रहे हैं. महत्व पी <0.05 पर सेट कर दिया जाता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
सारांश
cutaneous लीशमनियासिस की हम्सटर मॉडल दवाओं की प्रभावकारिता की जांच में इस मॉडल का उपयोग करने के उद्देश्य से सुधार किया गया था. घाव विकास और parasitological मापदंडों के हैम्स्टर्स की त्वचीय त्वचा में प्राथमिक संक्रमण पर अध्ययन किया गया. सहज महिला और पुरुष सुनहरा (Mesocricetus औराटस) हैम्स्टर, 6-8 सप्ताह, 1 एक्स 10 (पुरुषों के लिए) 7 या 1.5 x 10 7 (महिलाओं के लिए) metacycl के साथ अंतःक्षिप्त थे intradermallyआईसी एल promastigotes (स्थिर चरण) amazonensis. पिंड दिखाई 20 - 35 दिनों अनुकरणीय से 4-6 अनुकरणीय सप्ताह के बाद संक्रमण के बाद स्थापित किया गया था, दो खुराकों में पंचयुक्त सुरमा (SBV) की प्रभावकारिता evalauted बनाने अल्सर के साथ,. हैम्स्टर्स 5 प्रत्येक जानवरों के तीन समूहों में randomized थे और 80 या 120 मिलीग्राम प्रतिदिन / SBV किलो है पर meglumine antimoniate के साथ के इंट्रामस्क्युलर मार्ग द्वारा 10 दिनों के दौरान इलाज. तीसरे समूह intramuscularly पीबीएस के साथ placebo के रूप में इलाज किया गया था. तीन जानवरों के समूह अनुपचारित थे और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया है. प्रत्येक उपचार के लिए प्रतिक्रिया उपचार की अवधि के अंत के बाद 3 महीने के बाद किया गया था.
1. एल के बाद नैदानिक पाठ्यक्रम सुनहरा हम्सटर (Mesocricetus auratus) के amazonensis संक्रमण
पृष्ठीय त्वचा में संक्रमित हैम्स्टर्स लगातार 4-6 सप्ताह में संक्रमण के बाद epidermis के नैदानिक स्पष्ट व्रणोत्पत्ति विकसित. घावों छोटे पिंड और अल्सर समाप्त होने के साथ शुरू करते हैं किसमय के बाद संक्रमण के अनुसार आकार में वृद्धि और पहुँच प्रयोगात्मक दवाओं के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए एक इष्टतम आकार के चौथे माना जाता था छठे सप्ताह के बाद संक्रमण (18,99 54,7 मिमी 2 और 4 सप्ताह में 6 सप्ताह में 35,55 से 92,71 मिमी 2) (Figures1, 2). घावों बाद में 20 के बाद संक्रमण विकेटकीपर के लिए एक स्पष्ट अल्सर, (Figure1) जो समय पर प्रयोगों समाप्त बनाए रखा.
एल द्वारा संक्रमण amazonensis हैम्स्टर का शरीर के वजन कि 104,9 से 124,69 जीआर और असंक्रमित और संक्रमित hamsters में 129,71 के लिए 134,02 जीआर, क्रमशः (0.05 पी>, Anova) के लिए विविध प्रभावित नहीं करता है. जानवरों के अध्ययन के दौरान 25,58 की एक औसत ± शरीर के वजन के 5,98% प्राप्त की. चीन का creatinine और alanine अमीनो (ALT) ट्रांसफेरेज़ और hemogram के मापदंडों के मूल्यों को असंक्रमित और लीशमैनिया संक्रमित hamsters में संदर्भ मूल्यों के समान थे. केवल रोटी यूरिया नाइट्रोजन (BUN) स्तर थासंक्रमित पशुओं के 60% में ugmented.
एल के साथ संक्रमित hamsters में घावों की histopathological विश्लेषण amazonensis उन असंक्रमित जानवरों से संबंधित मतभेदों का पता चला. सामान्य में, असंक्रमित हैम्स्टर्स से त्वचा बायोप्सी कोई भड़काऊ प्रतिक्रिया या किसी भी histological परिवर्तन (चित्र 3a) दिखाने के लिए, जबकि उन एल के साथ संक्रमित amazonensis granulomatous जिल्द की सूजन और dermis (चित्रा 3b) घुसपैठ मैक्रोफेज की प्रचुर उपस्थिति विकसित. Histopathological के हैम्स्टर्स से ऊतकों के विश्लेषण एल के साथ संक्रमित amazonensis और meglumine antimoniate पर 80 और 120 मिलीग्राम / SBV 10 दिनों के दौरान किग्रा / दिन की खुराक के साथ इलाज के संक्रमण नियंत्रण समूह (संक्रमित और अनुपचारित) में उन मनाया करने के लिए इसी तरह की प्रक्रिया से जुड़े बदलावों को दिखाया. सामान्य में, हैम्स्टर्स की त्वचा के नमूने plasmocytes के एक मामूली स्तर (20%) और PMN (80%) लिम्फोसाइटों के उदारवादी घुसपैठ (80%) के साथ कोशिकाओं, और एक (20%) हल्के या गंभीर infiltr (80%) दिखायामैक्रोफेज की व्यावहारिक (तालिका 2). इन टिप्पणियों एक granulomatous जिल्द की सूजन, एक सूजन घटना कि dermis और आधारस्थित मांसपेशी को समझौता के एक नैदानिक के अनुरूप हैं. यह मुख्य घाव संक्रमण है, जो अध्ययन में सभी जानवरों में cutaneous लीशमनियासिस की गंभीर अभिव्यक्ति के साथ संगत है के लिए जुड़ा हुआ है. इस संस्था सांख्यिकीय सहसंबद्ध था जब ची - वर्ग पीयरसन, जो पी <0.05 झुकेंगे. पशुओं के 60-100% के गुर्दे के नमूने वृक्क प्रांतस्था और पशुओं के 75% में गुर्दे की मामूली शोष के साथ glomerules में मध्यम hyperplasia के दिखाया. इन टिप्पणियों झिल्ली proliferative glomerulonefritis, जो पहले किया गया है संक्रमण द्वारा संक्रमण के लिए अन्य लीशमैनिया प्रजातियों के द्वारा जुड़े निदान के साथ संगत कर रहे हैं. सांख्यिकीय संघ Pearson के <0.05 पी ची - वर्ग के साथ बड़ी थी. 40-100% के सभी समूहों में पशुओं के यकृत hepatocytes में मामूली vacuolar परिवर्तन, जो associat हो सकता है दिखायाglycogen के hepatocytic संचय के रूप में शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए एड. फैटी अध: पतन, तंतुमयता, और भीड़ के रूप में अन्य जिगर ऊतक असामान्यताएं संक्रमण की प्रक्रिया के अनुरूप. Hepatocytes में vacuolar परिवर्तन, cardiomegalies, intracytoplasmic eosinophiles के inclusions की उपस्थिति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गुर्दे ट्यूबों में कोशिकाओं की vacuolization के रूप में अन्य टिप्पणियों सांख्यिकीय परीक्षण परिसर के विषाक्त प्रभाव (0.05 पी) नहीं जुड़े रहे हैं और संभावना हैं hamsters में एक शारीरिक प्रक्रिया के कारण.
2. हम्सटर मॉडल meglumine antimoniate को की चिकित्सीय प्रभावकारिता
उपचार के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर संक्रमित हैम्स्टर्स के नैदानिक phenotype 1 तालिका में सारांशित है. 10 दिनों के वजन के दौरान 120 मिलीग्राम SBV / किग्रा / दिन की एक खुराक में इंट्रामस्क्युलर meglumine antimoniate साथ उपचार अत्यधिक प्रभावी उत्प्रेरण एल की पूरी प्रतिगमन सभी जानवरों में amazonensis घावों (चित्रा 4). इलाज का प्रतिशत 2 और 8 सप्ताह की अवधि के बाद इलाज के भीतर 100% थी. हालांकि, तीन महीने के बाद घाव के पतन हैम्स्टर्स के 20% में मनाया गया. जब meglumine antimoniate 80 मिलीग्राम / SBV किलो वजन शरीर पर प्रशासित किया गया था, पूरी तरह से इलाज केवल 3 पशुओं में मनाया गया. दो अन्य जानवरों में घाव 33,9 और 69,0%, क्रमशः (चित्रा 5) की कमी हुई. तीन महीने बाद, एल amazonensis सभी 80 मिलीग्राम SBV / किग्रा / दिन की एक खुराक के के में meglumine antimoniate साथ इलाज किया पशुओं की त्वचा में मौजूद है और केवल 120 मिलीग्राम SBV / किलो / meglumine antimoniate के दिन के साथ पशुओं का इलाज में से एक बने रहे. 120 इंट्रामस्क्युलर की एक रोगहर मिलीग्राम खुराक SBV / किग्रा / 10 दिनों के दौरान दिन निर्धारित किया गया था.
सीमित कमजोर पड़ने परख का प्रयोग, परजीवी की अनुमानित संख्या के नकारात्मक नियंत्रण (इलाज) और वाहन (placebo) इलाज समूह की तुलना में एक समूह meglumine antimoniate के साथ इलाज के लिए महत्वपूर्ण कमी (पी <0.001) से पता चला है. व्यवहार्य परजीवी (0.4 करने के लिए 1, त्वचा ऊतक का मिलीग्राम प्रति 6 परजीवी) अनुपचारित पशुओं के घाव साइट में पाया गया और उन पीबीएस के साथ इलाज किया. 120 मिलीग्राम / किग्रा / दिन (चित्रा 5b) और दो 80 मिलीग्राम / किग्रा / दिन (चित्रा 5c) के साथ इलाज किया hamsters के साथ इलाज पशु: परजीवी केवल उन जानवरों कि meglumine antimoniate साथ इलाज के लिए जवाब नहीं था से अलग थे. कोई फर्क नहीं हैम्स्टर है कि तुलना में meglumine antimonite उन अनुपचारित या पीबीएस के साथ इलाज जानवरों के लिए प्राप्त करने के बाद इलाज नहीं किया परजीवी लोड में मनाया गया.
Hamsters के 120 मिलीग्राम SBV / किग्रा / दिन में इंट्रामस्क्युलर meglumine antimoniate के साथ इलाज से त्वचा बायोप्सी के ऊतकविकृतिविज्ञानी में कोई परजीवी मनाया हैं, कुछ मैक्रोफेज और dermis में घुसपैठ लिम्फोसाइटों (6a चित्रा, 6b) के देखा जाता है. पर इसके विपरीत, जब hamsters के meglumine antimoniate के साथ 80 मिलीग्राम SBV / किग्रा / दिन, dermis में घुसपैठ मैक्रोफेज की प्रचुर मात्रा में उपस्थिति के साथ granulomatous जिल्द की सूजन में इलाज किया गया है बड़े पैमाने पर मनाया जाता है (चित्र 6c, 6d).
प्रभावकारिता का अध्ययन, 80 और 120 मिलीग्राम शरीर / SBV किलो वजन में meglumine antimoniate की विषाक्तता के लिए एक ही चिकित्सकीय योजना का उपयोग मूल्यांकन किया गया था. सामान्य स्वास्थ्य की स्थिति और शरीर के वजन पिछले खुराक के बाद 3 महीने के लिए निगरानी की गई. साथ इलाज हैम्स्टर का शरीर के वजन को प्रभावित नहीं कि 104,9 से 124,69 जीआर और असंक्रमित और संक्रमित hamsters में 129,71 134,02 जीआर करने के लिए विविध, क्रमशः था. पशुओं के दौरान इलाज और 28,74 27,59 के एक औसत शरीर के वजन के 4,22% प्राप्त ± ± दौरान अनुवर्ती (0.05 पी>, Anova) के 2,26%. वजन की हानि उपचार (नहीं दिखाया डेटा) के किसी भी समूह में नहीं मनाया गया. creatinine और alanine अमीनो (ALT) ट्रांसफेरेज़ और hemogram के मापदंडों के मूल्यों को चीन का संदर्भ अनुपचारित और meglumine antimoniate के इलाज hamsters में मूल्यों के लिए समान थे. केवल रोटी यूरिया नाइट्रोजन स्तर (बन) इलाज पशुओं के 20% में संवर्धित किया गया था.
Histopatहैम्स्टर्स से ऊतकों की hological विश्लेषण एल से संक्रमित amazonensis और 80 और 120 की खुराक पर meglumine antimoniate साथ इलाज SBV मिलीग्राम / किग्रा / 10 दिनों के दौरान दिन कोई दवा विषाक्तता से जुड़े परिवर्तन से पता चला है.
उपचार के बाद एक फॉस्फेट बफर खारा, ख दिन.
तालिका 1 एल के नैदानिक phenotype. amazonensis प्रयोगात्मक meglumine antimoniate साथ उपचार के बाद hamsters के संक्रमित
, नैदानिक (> 50% में सुधार घाव के आकार को कम करने के इलाज के (100% क्षेत्र और घाव की पूरी गायब उपचार): प्रत्येक उपचार की प्रभावशीलता पूर्व घाव और उपचार के बाद आकार, निम्न की समीक्षा प्रणाली का उपयोग कर की तुलना में मूल्यांकन किया गया था क्षेत्र के), नैदानिक विफलता (घाव के आकार में वृद्धि), (इलाज के बाद घाव के पुनर्सक्रियन) पतन.
एक: अनुपस्थित हस्ताक्षर, एनए: लागू नहीं कर रहा हूँ: हल्के, एम: मध्यम; एस: गंभीर, PMN: polymorphonuclear neutrophils, NSL: कोई महत्वपूर्ण घाव, जीडीएम: Granulomatous त्वग्पेशी - प्रदाह, पीजीडी: Pyogranulomatous जिल्द की सूजन. 1. Lymphangiectasia, 2. खनिज सामग्री की तरह.
टेबल 2 हैम्स्टर्स की त्वचा की हिस्तोपैथोलोजी प्रयोगात्मक एल से संक्रमित amazonensis और meglumine antimoniate के साथ इलाज
त्वचा घाव विकास की 1-1.5 x 10 7 एल के साथ टीका intradermally hamsters में संक्रमण के बाद चित्रा 1 कोर्स amazonensis metacyclic (स्थिर चरण) 20 सप्ताह के दौरान promastigotes. अक्ष y मिमी में अल्सर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 2 photog.2 (एक) सप्ताह, 4 सप्ताह में 10 10 X 7 अंतर्त्वचीय टीका सुनहरा हम्सटर धर्तलीय त्वचा में बाद घाव ulcerating के के विकास के raphyic इतिहास (ख) और (ग) 6 सप्ताह.
चित्रा 3 से (क) हम्सटर असंक्रमित और अनुपचारित त्वचा बायोप्सी: कोई भड़काऊ प्रतिक्रिया न महत्वपूर्ण ऊतकीय परिवर्तन मनाया जाता है, (ख) संक्रमित और अनुपचारित हम्सटर: multinucleated विशाल कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ granulomatous जिल्द की सूजन (तीर से अधिक तारांकन) और प्रचुर मात्रा में परजीवी (काला ) तीर और मैक्रोफेज (सफेद तीर) dermis में घुसपैठ. Hematoxylin - लाल भामसान रंग दाग 400x.
चित्रा 4 हैम्स्टर्स के नैदानिक प्रतिक्रिया की फोटोग्राफिक इतिहास एल से संक्रमित amazonensis और 120 मिलीग्राम SBV / किग्रा / दिन ड्यूरिन में इंट्रामस्क्युलर meglumine antimoniate के साथ इलाज किया जी 10 दिन. चित्र दिखाने के लिए, पहले उपचार के घाव की उपस्थिति (एक) उपचार (10 दिन) (ख) के अंत में, और के दौरान अप का पालन करें: 30 दिन (ग), 60 (घ) और 90 (ए) के बाद उपचार.
5 चित्रा meglumine antimoniate hamsters में cutaneous लीशमनियासिस के उपचार में प्रभावशीलता. गोल्डन हैम्स्टर एल से संक्रमित थे पृष्ठीय त्वचा में amazonensis. संक्रमण के 6 सप्ताह के बाद वे (क) अनुपचारित या पीबीएस अकेले (ख), meglumine 120 मिलीग्राम SBV / किलो antimoniate है / दिन (ग) या 80 मिलीग्राम SBV / किग्रा / दिन (घ) के साथ दस दिनों के दौरान इलाज intramuscularly थे. रेखांकन (0 दिन) उपचार के अंत में घाव आकार में कमी का प्रतिशत दिखाने के लिए, और उपचार के अंत के बाद 15, 30, 60, और के 90 दिनों में ऊपर का पालन करें. <120 या 80 के लिए 0.001 मिलीग्राम SBV / किग्रा / दिन बनाम वाहन नहीं है और उपचार.
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आंकड़ा 6 त्वचा संक्रमित और 120 मिलीग्राम SBV / किग्रा / दिन (क, ख) और 80 मिलीग्राम SBV / किग्रा / दिन (ग, घ) में इलाज के - इंट्रामस्क्युलर megumine antinmoniate साथ हैम्स्टर्स से बायोप्सी. उपस्थिति दुर्लभ मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों dermis में घुसपैठ की. नहीं परजीवी मनाया जाता है. Hematoxylin - Eosine 200x दाग (क), (ग) 1000x dermis के बड़े पैमाने पर घुसपैठ मैक्रोफेज की प्रचुर उपस्थिति (ग) के साथ Granulomatous जिल्द की सूजन, phagocyted परजीवी के साथ फेनयुक्त मैक्रोफेज. Hematoxylin - Eosine 200x दाग (ख), (घ) 1000x.
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Discussion
Cutaneous लीशमनियासिस उष्णकटिबंधीय और neotropics में स्थानिकमारी वाले है. यह अक्सर नैदानिक अभिव्यक्तियाँ, जो छोटे त्वचीय पिंड से सकल mucosal ऊतक विनाश लेकर विभिन्न स्पेक्ट्रम की वजह से बीमारियों का एक समूह के रूप में संदर्भित किया जाता है. हाल में उपलब्ध दवाओं महंगा है, लंबे समय तक इलाज regimens की आवश्यकता होती है और तेजी से अप्रभावी हो, नई दवाओं की खोज की जरूरत महसूस.
माउस मॉडल व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है, लेकिन कुछ नुकसान है. एक उच्च लगातार संक्रमण के साथ एक विस्तार नासूरदार घाव से अतिसंवेदनशील विशेषता के रूप में / BALB ग में देखा और इस प्रकार के उदाहरण के लिए, घाव है जो विशिषकर त्वचा पर कार्य करने वाला लीशमैनिया प्रजातियों के promastigotes की त्वचा के अंदर इंजेक्शन के बाद विकसित के आधार पर, चूहों को तीन समूहों में विभाजित किया जा सकता है / 2 डी बी ए डी बी ए, 3 / चूहों एक अपेक्षाकृत प्रतिरोधी समूह जहां घावों के रूप में 8 सप्ताह के भीतर हल CBA / एच, C3H/He और ए / जम्मू और एक उच्च प्रतिरोधी समूह जिसमें कोई वास्तविक घाव typi में देखा हो सकता है;cutaneous लीशमनियासिस की कैलोरी इंजेक्शन पर विकसित रूप में से NZB और C57BL में / 4 6 चूहों देखा. जहां रोग के पाठ्यक्रम को स्पष्ट रूप से विभिन्न आम जन्मजात माउस उपभेदों और लीशमैनिया प्रजातियों के बीच विविध cutaneous लीशमनियासिस की murine मॉडल के विपरीत, सुनहरा हम्सटर, Mesocricetus औराटस जैव मॉडल पर्याप्त लीशमैनिया प्रजातियों के खिलाफ दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए माना जाता है के रूप में वे अतिसंवेदनशील होते हैं 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 लीशमैनिया की विभिन्न प्रजातियों से संक्रमण के लिए. लीशमैनिया विशिषकर त्वचा पर कार्य करने वाला प्रजाति के किसी भी metacyclic promastigotes (स्थिर चरण) की टीका के बीच एक और दो महीने के बाद टीका cutaneous घावों के कारण करने में सक्षम है. घावों स्पष्ट 20 papules जो पिंड के लिए विकसित रूप में गड़बड़ी और बाद में अल्सर, दिन हो गया है. टीका साइट (पे थूथन, foodpad, कान या पूंछ आधार) के आधार पर हम्सटर प्रयोगात्मक संक्रमण के बाद एक उम्मीद के मुताबिक रोग विकास, वें के सबसे प्रदर्शित करता हैई समय एक पुरानी ulcerating स्थानीय cutaneous लीशमनियासिस साथ मानव प्राणियों में मनाया उन लोगों के लिए इसी तरह के घाव के विकास के द्वारा विशेषता है. हालांकि, के रूप में मानव में, घावों प्रत्येक व्यक्ति के प्रतिरक्षा स्थिति के आधार आकार में विविध और इसलिए, कुछ hamsters में घाव और घाव के आकार के फलस्वरूप कमी को हल करने के लिए एक प्रयास के देखा जा सकता है.
हालांकि इस अनुच्छेद एल के promastigotes का उपयोग कर hamsters के पृष्ठीय त्वचा में प्रयोगात्मक संक्रमण का वर्णन amazonesis, इस मॉडल भी अन्य विशिषकर त्वचा पर कार्य करने वाला लीशमैनिया प्रजातियों के लिए संभव है, केवल inoculum का आकार बदल रहा है. सारांश में, पृष्ठीय त्वचा पर promastigotes की त्वचा के अंदर इंजेक्शन के दृष्टिकोण को दर्शाता है कि cutaneous लीशमनियासिस के क्लिनिक और वैकृत सुविधाओं के हैम्स्टर्स की पृष्ठीय त्वचा में प्रेरित उल्लेखनीय मानव रोग के लिए समान हैं. इसके अतिरिक्त, अल्सर के ऊपर का पालन करें विशिष्ट यौगिकों या घ के साथ उपचार के बाद नैदानिकआसनों पृष्ठीय त्वचा में प्रेरित सीएल के इस मॉडल में मदद की है. घावों के विकास को आसानी से पहले और बाद में उपचार प्राप्त घाव के आकार की तुलना द्वारा निर्धारित किया जाता है. इलाज के मामले में नैदानिक प्रतिक्रिया आसानी से फिर से किसी जख् के ऊपर उपकला की वृद्धि हो जाने से जख्म का भर जाना (के रूप में चित्रा 4 में देखा) के अनुसार पीछा किया जाता है हम निष्कर्ष है कि लीशमैनिया प्रजातियों के साथ hamsters के पृष्ठीय त्वचा में प्रयोगात्मक संक्रमण यौगिकों कि की क्षमता को मान्य करने के लिए एक उपयोगी मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है. antileishmanial दवाओं के लिए उम्मीदवार हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
COLCIENCIAS और उत्पाद के विकास के लिए उष्णकटिबंधीय रोगों के खिलाफ केंद्र - CIDEPRO इस अध्ययन Antioquia के विश्वविद्यालय (CODI), विज्ञान और प्रौद्योगिकी के विकास के लिए कोलंबिया के संस्थान में अनुसंधान के लिए समिति से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Reagent | Holliday –Scott S.A | ||
| Xilacine | Reagent | Synthesis | ||
| PBS | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-136 | |
| Digital caliper | Equipment | Fisher Scientific | 15-077-958 | |
| Giemsa | Reagent | Sigma-Aldrich | GS1L-1L | |
| Formalin | Reagent | Nova lab | 11273 | |
| Paraffin | Reagent | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Haemotoxilin | Reagent | Nova lab | 10870103 | |
| Eosin | Nova lab | 10870203 | ||
| Kodak Ektachem dry chemistry | Equipment | Kodak Ektachem | DT-60 | |
| meglumine antimoniate | Reagent | Aventis | ||
| Microscopy | Equipment | Nikon Instruments | YS2-T |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis. Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis WHO. 949, (2010).
- Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol. 7, 545-555 (1985).
- Reynolds, K. M. The Kodak Ektachem dry layer technology for clinical chemistry. Upsala. J. Med. Sci. 91, 143-146 (1986).
- Handman, E., Ceredig, R., Mitchell, G. F. Murine cutaneous leishmaniasis: disease patterns in intact and nude mice of various genotypes and examination of some differences between normal and infected macrophages. Australian J. Exp. Biol. Med. Sci. 57, 9-29 (1979).
- Hanson, W., Chapman, W., Waits, V., Lovelace, J. Development of Leishmania (Viannia) panamensis lesions and relationship of numbers of amastigotes to lesion area antimony-treated and untreated hamsters. J. Parasitol. 77, 780-783 (1991).
- Henao, H. H., Osorio, Y., Saravia, N. G., Gómez, A., Travi, B. Efficacy and toxicity of pentavalentantimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomédica. 24, 393-402 (2004).
- Travi, B. L., Martinez, J. E., Zea, A. Antimonial treatment of hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis: assessment of parasitological cure with different therapeutic schedules. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87, 567-569 (1993).
- Hommel, M., jaffe, C. L., Travi, B., Milon, G. Experimental models for leishmaniasis and for testing anti-leishmanial vaccines. Ann. Trop. Med. Parasitol. 89, 55-73 (1995).
- Travi, B. L., Osorio, Y., Saravia, N. G. The inflammatory response promotes cutaneous metastasis in hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis. J. Parasitol. 82, 454-457 (1996).
- Travi, B. L., Osorio, Y. Failure of Albendazole as an alternative treatment of cutaneous Leishmaniasis in the hamster model. Memorias Instituto Oswaldo. 93, 515 (1998).
- Travi, B. L., Osorio, Y., Melby, P. C., Chandrasekar, B., Arteaga, L., Saravia, N. G. Gender is a major determinant of the clinical evolution and immune response in hamsters infected with Leishmania spp. Infect Immun. 70, 2288-2296 (2002).
- Osorio, Y., Melby, P. C., Pirmez, C., Chandrasekar, B., Guarín, N., Travi, B. L. The site of cutaneous infection influences the immunological response and clinical outcome of hamsters infected with Leishmania panamensis. Parasite Immunol. 25, 139-148 (2003).
- Osorio, Y., Bonilla, D. L., Peniche, A. G., Melby, P. C., Travi, B. L. Pregnancy enhances the innate immune response in experimental cutaneous leishmaniasis through hormone-modulated nitric oxide production. J. Leukoc. Biol. 83, 1413-1422 (2008).
- Espitia, C. M., Zhao, W., Saldarriaga, O., Osorio, Y., Harrison, L. M., Cappello, M., Travi, B. L., Melby, P. C. Duplex real-time reverse transcriptase PCR to determine cytokine mRNA expression in a hamster model of New World cutaneous leishmaniasis. BMC Immunol. 22, 11-31 (2010).
