Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kutan Leishmaniasis i Dorsal Skin av Hamstere: en Nyttig Modell for Screening av Antileishmanial narkotika

doi: 10.3791/3533 Published: April 21, 2012

Summary

Optimalisering av den eksperimentelle hamster modell for kutan leishmaniasis av intradermal injeksjon av

Abstract

Tradisjonelt er hamstere eksperimentelt inokulert i trynet eller footpad. Men i disse områdene en sår ikke alltid skjer, er måling av lesjon størrelse en hard prosedyre og dyr viser problemer med å spise, puste og bevege på grunn av lesjon. For å optimalisere hamster modell for kutan leishmaniasis, ung voksen mann og kvinnelige gylne hamstere (Mesocricetus auratus) ble injisert intradermalt på dorsal huden med 1 til 1,5 x l0 7 promastigotes av Leishmania arter og progresjon av påfølgende lesjonene ble evaluert for inntil 16 uker etter smitte. Den gylne hamster ble valgt fordi det anses tilstrekkelig bio-modell for å evaluere legemidler mot Leishmania som de er utsatt for smitte av ulike arter. Kutan infeksjon av hamstere resulterer i kroniske men kontrollert lesjoner, og en klinisk utvikling med symptomer som ligner på de som er observert hos mennesker. Derfor, etablering of omfanget av smitte ved å måle størrelsen på lesjonen i henhold til området av indurasjon og sår er gjennomførbart. Denne tilnærmingen har vist sin allsidighet og enkel administrasjon under inokulasjon, oppfølging og karakterisering av typiske lesjoner (magesår), anvendelse av behandlinger gjennom ulike måter og innhenting av kliniske prøver etter ulike behandlinger. Ved å bruke denne metoden kvaliteten på dyrelivet om bevegelse, søker etter mat og vann, lek og sosiale aktiviteter isalso bevart.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Infeksjon av hamstere

1. Dyr

Innavlede kvinnelige og mannlige gylne hamstere (Mesocricetus auratus), 6-8 uker, veier 140-160 g er brukt. De ligger på dyret anlegget, i temperaturkontrollerte innkvartering, matet med standard gnager tørket mat og utstyrt med vann ad libitum. Alle prosedyrer som involverer dyr blir godkjent av institusjonelle Etisk komité for Experimental Animal bruk. Før eksperimentell infeksjon med dermotropic Leishmania parasitter dyr er kjønnede, merket og vektet i henhold til standardiserte prosedyrer. For kjønnsbestemmelse, er dyr inspiseres for særpreg som visualisering av brystkjertelen linjen og den korte ano-genital avstand i kvinner, eller visualisering av testiklene og en større avstand mellom anus og forhuden hos menn. Deretter blir dyrene merket med piercing eller ved farging et område av huden med en bomullsdott fukteti picric syre. For øre perforasjon, etter feilfri med 70% alkohol øret er gjennomboret med en øre slag for gnagere. En region med blodårer må unngås. Sedasjon eller anestesi med en blanding 09:01 av ketamin (50 mg / kg) og Xilacine (20 mg / kg) intraperitonealt i et volum på 260-300μl 25-G nål anbefales. Endelig er dyr veies ved å plassere dem i en felle eller boks som er betinget på en presisjon balanse.

2. Parasitter

Promastigotes av dermotropic Leishmania arter, for eksempel L. amazonensis, dyrkes i bifasisk Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) kultur medium ved 26 ° C. Metacyclic (stasjonær) fase promastigotes (5 dager) areused å infisere hamstere. Kort, er parasitter høstet, vasket to ganger med fosfatbuffer saltvann (PBS), telles og justert til 1 x 10 7 (for menn) eller 1,5 x 10 7 (for kvinner) parasitter i 0,1 ml PBS for inokulere mann eller kvinne, henholdsvis,kan imidlertid inoculums størrelsen varierer i henhold til Leishmania arter (prosedyre ikke vist i videoen).

3. Eksperimentell infeksjon

Et hudområde er barbert før inokulasjon. Kort, blir de bedøvet dyrene plasseres i liggende stilling og bruke saks, er håret fjernes to inches fra bunnen av halen. Etter rydde opp barberte området med steril saltvannsoppløsning parasitten podestoff injiseres intradermalt inntil en papule dannes.

4. Klinisk oppfølging

Dyr er overvåket hver 7. dag opp til 4 - 6 uker etter inokulering for utseende av lesjonen. Kort tid, er dyr immobilisert i en felle og inokulert hudområdet er palperes. Deretter blir det forhardning området av dannet sår avgrenset og bredden og lengden på sår måles med en digital caliper.

2. Behandling av hamstere

1. Administration av forbindelsene

Den kuren starter når dyrene har utviklet sårdannelse lesjoner (4-6 uker etter vaksinering). Dyr er fordelt i grupper på 5-6 dyr for hvert stoff som skal testes. Forbindelser kan administreres av aktuell, oral, intramuskulære eller intralesional ruter. Før påføring av narkotika, hamstere bedøves og lesjonen området rengjøres med saltvannsløsning eller PBS. Når massen er brukt via aktuell eller intralesional, er hamstere immobilisert i feller som lar utsette området for å behandle stund, når det sammensatte administreres av muntlige eller intramuskulær ruter hamstere er festet ved bunnen av nakken. a) Aktuelt program: det sammensatte isapplied på lesjon og etter få minutter dyret tilbake til cage.b) For intramuskulær injeksjon, er stoffet injiseres (200 mL maksimum) gjennom semitendinous eller semimembranous musklene i bakparten. c) For oral administrasjonnen, er stoffet gis til dyr (200 mL maksimum) gjennom en oro-mage probe 14g koblet til en 1 ml sprøyte. d) For intralesional injeksjon stoffet (100 mL maksimum) er gradvis injiseres i bunnen av sår med en 26G kanyle med skråkant plassert ned. Hele området av lesjonen er dekket av rotasjon av nålen. Behandlinger er administrert daglig i løpet av 10-20 dager, ifølge den definerte terapeutisk ordningen.

2. Klinisk oppfølging

Fordi i denne eksperimentelle modellen effektiviteten av nye antileishmanial forbindelser fastsettes i henhold til helbredelse og arrdannelse av lesjoner etter behandling, er en klinisk oppfølging av hvert enkelt dyr gjøres ukentlig på slutten av anvendelsen av det sammensatte og opptil tre måneder etter. Under overvåking, er den type lesjon beskrevet og indurasjon og sår område er målt med en digital caliper. Tilstedeværelsen av lesjoner i ulike regioner tilinokulasjon stedet, samt utseende tilbakefall av lesjonen er også beskrevet og registrert. Annenhver uke, blir dyrene vektes og lesjoner er avbildet. Dyr er observert daglig for å overvåke: a) fysisk utseende (hår, koordinering, temperatur, øyne, plassering av ørene, grooming, defekasjon, tilstedeværelse av ascitic væske, uro og dehydrering) og b) atferd (våken, våken, nysgjerrig, imøtekommende , forblir med gruppen, ser frem til mat og drikke, og vanskelig å fange). Stedet for anvendelse av forbindelsen er også observert for tilstedeværelse av hyperemi, betennelse, og bitende og hårfjerning.

Hamstere er også blødd i dag 45 etter endt behandling for å bestemme hematologisk og serologisk verdier som kan være forbundet med toksisitet av forbindelsene (se nedenfor).

Effektiviteten av hver behandling vurderes sammenlikne lesjon størrelsene før og etter behandlinger, med følgende poengsum system: kurert (helbredelse av 100% areal og fullstendig bortfall av lesjon), klinisk bedring (redusere størrelsen på lesjon i> 50% av arealet), klinisk svikt (øke størrelsen på lesjonen); tilbakefall på av lesjon etter herding). På slutten av studien, er dyr ofret ved innånding av CO2 forrige anestesi. Etter døden, blir de nødvendige prøver for parasitological, histologiske og serologisk analyse tatt.

3. Parasitological eksamener

Tilstedeværelsen av Leishmania i prøver fra hud (lesjon eller arr), er lever, milt og nyre bestemmes direkte ved å undersøke utstryk farget med Giemsa 1 og histopatologisk undersøkelse av disse vev (se nedenfor).

Parasitten byrde i lesjonen nettstedet er anslått av grensen fortynning analysen i henhold til Titus og kolleger (1985) 2. Kort er et lite stykke av vevet fjernetfra hvert dyr, veid og homogenisert i kaldt PBS løsning ved hjelp av en sprøyte stempelet. Suspensjonen innhentet sentrifugeres ved 600g i 10 min ved 4 ° C. Deretter blir supernatants forkastet og pellets er resuspendert i RPMI 1640 medium supplert med 1% antibiotika og 10% kalvefoster serum. Hundre l av suspensjonen blir overført til hver av de 96 brønner til microtitre plate inneholder NNN medium overlappet med 50 mL Schneiders medium og holdes på 26 ° C. Antall levedyktige parasitter i hver prøve bestemmes fra høyeste fortynningen der promastigotes kunne påvises ved undersøkelse under en omvendt mikroskop hver uke i en måned.

4. Histopatologiske undersøkelse av hud lesjon (eller arr) og andre vev

En tredje del av biopsi prøven tatt fra hud, lever og nyre er fast i 10% formalin og innebygd i parafin. Prøve fra milt og hjerte kan også bli behandlet. Five mikron deler av de faste vev ble farget med haemotoxilin-eosin og undersøkt under en optisk mikroskop med 200X, 400x eller 1000x olje nedsenking å studere mikro arkitekturen, egenskapene til mobilnettet infiltrere, og tilstedeværelse eller fravær av parasitter. Photomicrographs blir tatt og digitale bilder tatt.

5. Evaluering av behandling toksisitet

Giftig aktivitet av det sammensatte er basert på fysiske og oppførsel tilstand av dyrene i henhold til de parametrene overvåkes under den kliniske oppfølging (se ovenfor). Toksisitet er også fastsatt i henhold til hematologiske og metabolske parametre i blodprøver og histopatologiske forandringer observert i vevsdelene farget med haemotoxilin-eosin som beskrevet ovenfor.

Blodprøver er tatt fra hjertet, fortrinnsvis ventrikkelen. Til hematologisk test, blir blod overføres til EDTA antikoagulerte rør og behandlet i henholdå standardisere protokoller for komplett blod teller. For serologiske tester, blir blodet overføres til 1,5 Eppendorf hetteglassene og sentrifugeres å få serum for metabolske analyse av kreatinin, ALAT og BUN nivåer målt ved hjelp av Kodak Ektachemdry kjemi tre.

6. Dataanalyse

Data fra behandlede og ubehandlede dyr sammenliknet med ANOVA test. Betydning er satt til p <0,05.

4. Representative resultater

Oppsummering

Den hamster modell av kutan leishmaniasis ble forbedret med det formål å bruke denne modellen i legemidlets effekt screening. Lesjon utvikling og parasitological parametre ble undersøkt ved primær infeksjon i dermal hud hos hamstere. Innavlede kvinnelige og mannlige gylne hamstere (Mesocricetus auratus), 6-8 uker, ble injisert intradermalt med 1 x 10 7 (for menn) eller 1,5 x 10 7 (for kvinner) metacyclIC (stasjonær fase) promastigotes av L. amazonensis. Knuter dukket 20 - 35 dager pi, med sår danner etter 4-6 uker pi Etter infeksjon ble etablert, ble effekten av Pentavalent antimon (SBV) ved to doser evalauted. Hamstere ble randomisert i tre grupper på 5 dyr hver, og behandlet med meglumin antimoniate på 80 eller 120 mg SBV / kg daglig i 10 dager ved intramuskulært. Den tredje gruppen ble behandlet intramuskulært med PBS som placebo. En gruppe på tre dyr var ubehandlet og brukes som en negativ kontroll. Responsen til hver behandling ble fulgt opp 3 måneder etter utløpet av behandlingsperioden.

1. Klinisk kurs etter L. amazonensis infeksjon i gullhamsteren (Mesocricetus auratus)

Hamstere smittet i dorsal huden konsekvent utvikle klinisk tydelig sår i epidermis på 4-6 uker etter smitte. Lesjoner begynne med små knuter og slutter sår somøke i størrelse i henhold til tid etter smitte, og nå hva som ble ansett som en optimal størrelse for evaluering av effekten av eksperimentelle medikamenter ved fjerde til sjette uke etter infeksjon (18,99 til 54,7 mm 2 ved 4 uke og 35,55 til 92,71 mm 2 til 6 uker) (Figures1, 2). Forandringene senere opprettholdt en tydelig sår i inntil 20 WK post-infeksjon, og da forsøkene ble avsluttet (Figure1).

Infeksjon av L. amazonensis påvirker ikke kroppsvekten hos hamstere som varierte fra 104,9 til 124,69 gr og 129,71 til 134,02 gr i friske og infiserte hamstere, henholdsvis (p> 0,05, Anova). Dyrene fikk et gjennomsnitt på 25,58 ± 5,98% av kroppsvekten i løpet av studien. De seric verdier av kreatinin og alanin aminosyrer transferase (ALT) og hemogram parametere var lik referansene verdiene i friske og Leishmania infiserte hamstere. Bare bun urea nitrogen (BUN) nivå var enugmented i 60% av infiserte dyr.

Histopatologisk analyse av lesjoner i hamstere infisert med L. amazonensis viste forskjeller knyttet til disse friske dyr. Generelt hud biopsier fra hamstere uinfiserte viser ingen inflammatorisk reaksjon eller histologiske endringer (figur 3a), mens de som er smittet med L. amazonensis utvikle en granulomatøs betennelse og rikelig forekomst av makrofager infiltrere dermis (figur 3b). Histopatologisk analyse av vev fra hamstere infisert med L. amazonensis og behandles med meglumin antimoniate i doser på 80 og 120 mg SBV / kg / dag i løpet av 10 dager viste endringer knyttet til infeksjonen prosessen lik de observerte i kontrollgruppen (infisert og ubehandlet). Generelt viste hud prøver av hamstere en svak grad av plasmocytes (20%) og PMN (80%) celler ledsaget av moderate infiltrasjon av lymfocytter (80%), og en mild (20%) eller alvorlig (80%) infiltrasjon av makrofager (tabell 2). Disse observasjonene samsvarer med en diagnostisk av granulomatøs betennelse, en inflammatorisk hendelse som kompromitterer dermis og underliggende muskler. Dette er den viktigste lesjonen knyttet til infeksjon, som er kompatibel med alvorlig manifestasjon av kutan leishmaniasis i alle dyr i studien. Denne foreningen ble statistisk korrelert da chi-kvadrat av Pearson, som ga p <0,05. Nyre prøver av 60-100% av dyrene viste moderat hyperplasi i nyrebarken og glomerules akkompagnert av lett atrofi av nyrene i 75% av dyrene. Disse observasjonene er kompatible med membran proliferativ glomerulonefritis, en diagnose som tidligere har vært knyttet til smitte av infeksjon av andre Leishmania arter. Statistical Association var stor med en chi-kvadrat av Pearson p <0,05. De lever fra 40-100% av dyr i alle gruppene viste små vacuolar endringer i hepatocytter, som kan være associated til fysiologiske prosesser som hepatocytic opphopning av glykogen. Andre levervev abnormaliteter som fettdegenerering, fibrose, og lunger tilsvarer infeksjonen prosessen. Andre observasjoner som vacuolar endringer i hepatocytter, cardiomegalies, tilstedeværelse av inneslutninger av intracytoplasmatisk eosinophiles, samt den vacuolization av celler i nyrene rørene er ikke statistisk assosiert (p> 0,05) til en giftig effekt av det sammensatte testet og det er sannsynlig på grunn av en fysiologisk prosess i hamstere.

2. Terapeutisk effekt av meglumin antimoniate i hamster-modellen

Den kliniske fenotypen infiserte hamstere ved ulike tidspunkt etter behandling er oppsummert i Tabell 1. Behandlingen med intramuskulær meglumin antimoniate i en dose på 120 mg SBV / kg / dag i løpet av 10 dager vekt var svært effektive induserende fullstendig tilbaketrekking av L. amazonensis lesjoner i alle dyr (figur 4). Andelen kur var 100% innen 2 og 8 ukers etterbehandling periode. Men etter tre måneder tilbakefall av lesjonen ble observert hos 20% av hamstere. Når meglumin antimoniate ble administrert ved 80 mg SBV / kg kroppsvekt, ble fullstendig helbredelse kun observert i 3 dyr. I de to andre dyrene lesjonen redusert med 33,9 og 69,0%, henholdsvis (figur 5). Etter tre måneder, L. amazonensis forble i huden av alle dyr behandlet med meglumin antimoniate i en dose på 80 mg SBV / kg / dag, og bare ett av dyrene som ble behandlet med 120 mg SBV / kg / dag meglumin antimoniate. En helbredende dose av intramuskulær 120 mg SBV / kg / dag i løpet av 10 dager ble bestemt.

Bruke begrensende fortynning analysen, viste det estimerte antallet parasitter en betydelig reduksjon for behandlede gruppen med meglumin antimoniate i forhold til negative (ubehandlet) kontroll og kjøretøy (placebo) behandlede gruppen (p <0,001). Levedyktige parasitter (0,4 til 1Ble 6 parasitter per mg hud vev) oppdaget i lesjonen stedet ubehandlede dyr og de som ble behandlet med PBS. Parasitter ble bare isolert fra disse dyrene som ikke responderer på behandling med meglumin antimoniate: en dyr behandlet med 120 mg / kg / dag (figur 5b) og to hamstere som ble behandlet med 80 mg / kg / dag (figur 5c). Ingen forskjell ble observert i parasittbelastning av hamstere som ikke kurere etter mottak meglumin antimonite i forhold til disse dyrene ubehandlede eller behandlet med PBS.

I histopatologi av hud biopsier fra hamstere behandlet med intramuskulær meglumin antimoniate ved 120 mg SBV / kg / dag ingen parasitter er observert; få makrofager og lymfocytter infiltrere dermis sees (figur 6a, 6b). På Tvert i mot, da hamstere ble behandlet med meglumin antimoniate ved 80 mg SBV / kg / dag, granulomatøs betennelse med rikelig forekomst av makrofager infiltrere dermis utstrakt observert (6c figur, 6d).

Bruke samme terapeutiske ordning for effekt studie, giftigheten av meglumin antimoniate ved 80 og 120 mg SBV / kg kroppsvekt ble evaluert. Generell helsestatus og kroppsvekt ble overvåket opp til 3 måneder etter siste dosering. Behandling med ikke påvirke kroppsvekt hos hamstere som varierte fra 104,9 til 124,69 gr og 129,71 til 134,02 gr i friske og infiserte hamstere, henholdsvis. Dyrene fikk et gjennomsnitt på 27,59 ± 4,22% av kroppsvekten under behandlingen og 28,74 ± 2,26% i løpet av oppfølgingen (p> 0,05, Anova). Tap av vekt ble ikke observert i noen gruppe av behandlingen (data ikke vist). De seric verdier av kreatinin og alanin aminosyrer transferase (ALT) og hemogram parametere var lik referansene verdiene i ubehandlede og meglumin antimoniate behandlet hamstere. Bare bun urea nitrogen (BUN)-nivået ble utvidet i 20% av behandlede dyr.

Histopathological analyse av vev fra hamstere infisert med L. amazonensis og behandles med meglumin antimoniate i doser på 80 og 120 mg SBV / kg / dag i løpet av 10 dager viste ingen endringer knyttet til narkotika toksisitet.

Tabell 1
en fosfatbuffer saltvann, b dager etter behandling.
Tabell 1. Clinical fenotype av L. amazonensis eksperimentelt smittet hamstere etter behandling med meglumin antimoniate

Effektiviteten av hver behandling ble vurdert å sammenligne lesjon størrelsene før og etter behandlinger, ved hjelp av følgende poengsystemet: kur (helbredelse av 100% areal og fullstendig bortfall av lesjon), klinisk bedring (redusere størrelsen på lesjon i> 50% av området), klinisk svikt (øke størrelsen på lesjonen), tilbakefall (reaktivering av lesjon etter kur).


A: fraværende skilt, NA: ikke relevant; m: mild, M: moderat; S: alvorlig; PMN: polymorfnukleære nøytrofile; NSL: Ingen signifikant lesjon; GDM: Granulomatøs dermatomyositt; PGD: Pyogranulomatous dermatitt. 1. Lymphangiectasia; to. Mineral-aktig materiale.
Tabell 2. Histopatologi av huden hos hamstere eksperimentelt infisert med L. amazonensis og behandlet med meglumin antimoniate

Figur 1
Figur 1. Course av hudlesjon utvikling etter smitte i hamstere inokulerte intradermalt med 1 til 1,5 x 10 7 L. amazonensis metacyclic (stasjonær fase) promastigotes under 20 uker. Axis y representerer sår området i mm.

Figur 2
Figur 2. Fotografraphyic historie utvikling av ulcerating lesjon i dorsal huden en gylden hamster etter intradermal inokulering av 10 x 10 7 på 2 uker (a), 4 uker (b) og 6 uker (c).

Figur 3
Figur 3 hudbiopsi fra (a) hamster infisert og ubehandlet:. Ingen inflammatorisk reaksjon verken betydelig histologisk forandring er observert, (b) hamster infisert og ubehandlet: granulomatøs betennelse med tilstedeværelse av multinucleated gigantiske celler (pil pluss asterisk) og rikelig parasitter (svart piler) og makrofager (hvite piler) infiltrere dermis. Hematoxylin-eosin flekken 400x.

Figur 4
Figur 4. Fotografisk historie klinisk respons hos hamstere infisert med L. amazonensis og behandles med intramuskulær meglumin antimoniate ved 120 mg SBV / kg / dag Durin g 10 dager. Bildene viser utseendet på lesjonen før behandling (a), ved slutten av behandlingen (dag 10) (b), og under oppfølging: dag 30 (c), 60 (d) og 90 (e) etter behandling.

Figur 5
Figur 5. Effektivitet av meglumin antimoniate i behandling av kutan leishmaniasis i hamstere. Gylne hamstere ble smittet med L. amazonensis i dorsal huden. Etter 6 uker med infeksjon var de ubehandlet (a) eller behandlet intramuskulært i løpet av ti dager med PBS alene (b), meglumin antimoniate 120 mg SBV / kg / dag (c) eller 80 mg SBV / kg / dag (d). Grafene viser prosentandelen av nedgangen i lesjonen størrelse på slutten av behandlingen (dag 0), og på dager 15, 30, 60 og 90 av oppfølging etter avsluttet behandling. p <0,001 for 120 eller 80 mg SBV / kg / dag vs kjøretøy og ikke behandling.

"/>
Figur 6. Hudbiopsi fra hamstere smittet og behandles med intramuskulær megumine antinmoniate ved 120 mg SBV / kg / dag (a, b) og 80 mg SBV / kg / dag (c, d). Tilstedeværelse av knappe makrofager og lymfocytter infiltrere dermis. Ingen parasitter er observert. Hematoxylin-Eosine flekken 200x (a), 1000x (c) Granulomatøs dermatitt med rikelig forekomst av makrofager infiltrere dermis utstrekning (c);. Skumcellemakrofager med phagocyted parasitter. Hematoxylin-Eosine flekken 200x (b), 1000x (d).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kutan leishmaniasis er endemisk i tropene og neotropics. Det blir ofte referert til som en gruppe av sykdommer på grunn av den varierte spekter av kliniske manifestasjoner, som spenner fra små kutane knuter til brutto slimhinnene vev ødeleggelse. De fleste tilgjengelige medikamenter er kostbare, krever lange behandlingsregimer og blir stadig ineffektivt, nødvendiggjør oppdagelsen av nye legemidler.

Musen Modellen er mye brukt, men har noen ulemper. Dermed for eksempel på grunnlag av lesjon som utviklet etter intradermal injeksjon av promastigotes av dermotropic Leishmania arter, kunne musene deles inn i tre grupper: en svært utsatt med vedvarende infeksjon preget av en ekspanderende ulcerøs lesjon som sett i BALB / c og DBA / 2, DBA / 3 mus, en relativt motstandsdyktig gruppe hvor lesjoner kan løse innen 8 uker sett i CBA / H, C3H/He og A / J og en svært motstandsdyktig gruppe hvor ingen reell lesjon typical av kutan leishmaniasis utvikler på injeksjonsstedet som sett i NZB og C57Bl / 6 mus fire. I motsetning til murine modell av kutan leishmaniasis hvor sykdomsforløpet markert varierte mellom ulike vanlige innavlede musestammer og Leishmania arter, den gylne hamster, er Mesocricetus auratus anses tilstrekkelig bio-modell for å evaluere legemidler mot Leishmania arter som de er utsatt for smitte av ulike arter av Leishmania. 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Inokulering av metacyclic (stasjonær fase) promastigotes av noen av dermotropic Leishmania arten er i stand til å forårsake kutane lesjoner mellom en og to måneder etter inokulasjon. Lesjoner bli tydelig 20 dager PI som papler som utviklet seg til knuter og senere til sår. Avhengig av inokulasjon hotellet (pe snute, foodpad, øre eller base hale) hamsteren viser en forutsigbar sykdom evolusjon etter eksperimentell infeksjon, de fleste av the tid preget av utvikling av en kronisk danne sår lokal lesjon ligner observert hos mennesker med kutan leishmaniasis. Men som hos mennesker, lesjoner varierte i størrelse avhengig av immunsystemet status for hver enkelt, og derfor i noen hamstere et forsøk på å løse lesjon og dermed reduksjon av størrelsen på lesjonen kan sees.

Selv om denne artikkelen beskriver eksperimentell infeksjon i dorsal huden hos hamstere med promastigotes av L. amazonesis, er denne modellen også mulig for andre dermotropic Leishmania arter, endrer bare størrelsen på podestoff. Oppsummert viser tilnærming av intradermal injeksjon av promastigotes på dorsal huden som klinikken og patologisk trekk av kutan leishmaniasis indusert i dorsal huden hos hamstere er påfallende lik sykdom hos mennesker. I tillegg til klinisk oppfølging av sår etter behandling med spesielle forbindelser eller dtepper er lettere i denne modellen av indusert CL i dorsal hud. Utviklingen av lesjonene er lett bestemmes ved å sammenligne størrelsen på lesjonen innhentet før og etter behandling. Klinisk respons i form av helbredelse er lett følges i henhold til re-epithelialization (som sett i figur 4). Vi konkluderer med at den eksperimentelle infeksjon i dorsal huden hos hamstere med Leishmania arter representerer en nyttig modell for å validere potensialet i forbindelser som er kandidater for antileishmanial narkotika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet med tilskudd fra Utvalget for forskning ved University of Antioquia (CODI), Den colombianske Institutt for utviklingen av vitenskap og teknologi - COLCIENCIAS og Senter for utvikling av produkter mot tropiske sykdommer - CIDEPRO.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ketamine Reagent Holliday –Scott S.A
Xilacine Reagent Synthesis
PBS Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190-136
Digital caliper Equipment Fisher Scientific 15-077-958
Giemsa Reagent Sigma-Aldrich GS1L-1L
Formalin Reagent Nova lab 11273
Paraffin Reagent Pechiney Plastic Packaging PM-996
Haemotoxilin Reagent Nova lab 10870103
Eosin Nova lab 10870203
Kodak Ektachem dry chemistry Equipment Kodak Ektachem DT-60
meglumine antimoniate Reagent Aventis
Microscopy Equipment Nikon Instruments YS2-T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Control of the leishmaniasis. Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis WHO. 949, (2010).
  2. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol. 7, 545-555 (1985).
  3. Reynolds, K. M. The Kodak Ektachem dry layer technology for clinical chemistry. Upsala. J. Med. Sci. 91, 143-146 (1986).
  4. Handman, E., Ceredig, R., Mitchell, G. F. Murine cutaneous leishmaniasis: disease patterns in intact and nude mice of various genotypes and examination of some differences between normal and infected macrophages. Australian J. Exp. Biol. Med. Sci. 57, 9-29 (1979).
  5. Hanson, W., Chapman, W., Waits, V., Lovelace, J. Development of Leishmania (Viannia) panamensis lesions and relationship of numbers of amastigotes to lesion area antimony-treated and untreated hamsters. J. Parasitol. 77, 780-783 (1991).
  6. Henao, H. H., Osorio, Y., Saravia, N. G., Gómez, A., Travi, B. Efficacy and toxicity of pentavalentantimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomédica. 24, 393-402 (2004).
  7. Travi, B. L., Martinez, J. E., Zea, A. Antimonial treatment of hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis: assessment of parasitological cure with different therapeutic schedules. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87, 567-569 (1993).
  8. Hommel, M., jaffe, C. L., Travi, B., Milon, G. Experimental models for leishmaniasis and for testing anti-leishmanial vaccines. Ann. Trop. Med. Parasitol. 89, 55-73 (1995).
  9. Travi, B. L., Osorio, Y., Saravia, N. G. The inflammatory response promotes cutaneous metastasis in hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis. J. Parasitol. 82, 454-457 (1996).
  10. Travi, B. L., Osorio, Y. Failure of Albendazole as an alternative treatment of cutaneous Leishmaniasis in the hamster model. Memorias Instituto Oswaldo. 93, 515 (1998).
  11. Travi, B. L., Osorio, Y., Melby, P. C., Chandrasekar, B., Arteaga, L., Saravia, N. G. Gender is a major determinant of the clinical evolution and immune response in hamsters infected with Leishmania spp. Infect Immun. 70, 2288-2296 (2002).
  12. Osorio, Y., Melby, P. C., Pirmez, C., Chandrasekar, B., Guarín, N., Travi, B. L. The site of cutaneous infection influences the immunological response and clinical outcome of hamsters infected with Leishmania panamensis. Parasite Immunol. 25, 139-148 (2003).
  13. Osorio, Y., Bonilla, D. L., Peniche, A. G., Melby, P. C., Travi, B. L. Pregnancy enhances the innate immune response in experimental cutaneous leishmaniasis through hormone-modulated nitric oxide production. J. Leukoc. Biol. 83, 1413-1422 (2008).
  14. Espitia, C. M., Zhao, W., Saldarriaga, O., Osorio, Y., Harrison, L. M., Cappello, M., Travi, B. L., Melby, P. C. Duplex real-time reverse transcriptase PCR to determine cytokine mRNA expression in a hamster model of New World cutaneous leishmaniasis. BMC Immunol. 22, 11-31 (2010).
Kutan Leishmaniasis i Dorsal Skin av Hamstere: en Nyttig Modell for Screening av Antileishmanial narkotika
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).More

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter