Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hamsterlar ve Dorsal Skin Kutanöz Leishmaniasis: Antileishmanial Uyuşturucu Tarama için Faydalı Model

doi: 10.3791/3533 Published: April 21, 2012

Summary

Intradermal enjeksiyonu ile kutanöz leishmaniasis için deneysel Hamster model Optimizasyonu

Abstract

Geleneksel olarak, hamster deneysel burun veya haydut olarak aşılanır. Ancak bu sitelerde bir ülser her zaman gerçekleşir değil, lezyon büyüklüğü ölçümü zor bir işlemdir ve hayvanlar nedeniyle lezyonun, yemek nefes ve hareket zorluğu gösterir. Kutanöz leishmaniasis, genç erişkin erkek ve kadın için altın hamster hamster modeli optimize etmek için (Mesocricetus auratus) 1 ile 1,5 x l0 7 Leishmania türlerinin promastigotları ve daha sonraki lezyonların ilerlemesi ile sırt derisine intradermal enjekte edildi kadar değerlendirildi 16 hafta sonrası enfeksiyon. Farklı türleri tarafından enfeksiyona duyarlı olarak Leishmania karşı ilaçları değerlendirmek için biyo-modeli yeterli kabul edilir çünkü altın hamsteri seçildi. Kronik fakat kontrollü lezyonlar ve insanlarda görülen benzer bulguları ile klinik bir evrim hamster sonuçlarının deri enfeksiyonu. Bu nedenle, o kurulmasısertleştirmek ve ülserlerin alanına göre lezyonun boyutu ölçerek enfeksiyon f ölçüde mümkündür. Bu yaklaşım, aşılama sırasında, çok yönlülüğü ve kolay yönetim kanıtlamış, farklı tedavilerden sonra klinik örneklerin farklı yolları ve alınması yoluyla Tipik lezyonlar (ülserler), tedavilerin uygulama takip ve karakterizasyonu. Bu yöntem hareket ile ilgili hayvan yaşam kalitesi, gıda ve su, oyun ve isalso korunmuş sosyal faaliyetler için arama kullanarak.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Hamsterlerin Enfeksiyon

1. Hayvanlar

140-160 g ağırlığında kendilenmiş kadın ve erkek altın hamster (Mesocricetus auratus), 6-8 hafta kullanılır. Onlar standart kemirgen kuru gıda ile beslenen ve su ad libitum ile sağlanan, ısı kontrollü konaklama, hayvan tesiste yer alır. Hayvanları kapsayan tüm işlemler Deney Hayvanları Kullanım kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Dermotropic Leishmania parazitleri hayvanları ile deneysel enfeksiyon seksüel önce, işaretlenir ve standart prosedürlere göre tartılır. Cinsiyet tayini için, hayvanlar gibi meme hattı ve kadınlarda kısa ano-genital mesafenin görselleştirme, ya da testisler ve erkeklerde anüs ve sünnet derisi arasında daha büyük bir mesafe görselleştirme gibi ayırt edici özellikleri açısından kontrol edilir. Sonra, hayvanların kulak delme veya ıslatılmış bir bez ile cildin bir bölümünde boyanarak işaretlenmiştirpikrik asit. Kulak delinmesi için,% 70 alkol ile temizleyin sonra kulak kemirgenler için bir kulak delme kullanarak deldi edilir. Kan damarları ile bölge kaçınılmalıdır. Ketamin (50 mg / kg) ve Xilacine (20 mg / kg) 260-300μl 25-G iğne bir hacmi içinde intraperitonal bir karışımı 09:01 ile sedasyon veya anestezi tavsiye edilir. Son olarak, hayvanların hassas bir denge şartına bağlıdır bindirme veya kutuya yerleştirerek tartılır.

2. Parazitler

Böyle L. gibi dermotropic Leishmania türlerinin promastigotları, amazonensis, 26 at bifazik Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) kültür ortamı kültürlenmiştir ° C Metacyclic (durgun) faz promastigotları (5 gün) hamster bulaştırmak areused. Kısaca, parazitler hasat edilir, iki erkek ya da kadın, sırasıyla aşılamak için sayılır ve 0.1 ml PBS içinde 1 x 10 7 (erkekler için) veya 1.5 x 10 7 (kadınlar için) parazitler için ayarlanabilir fosfat tamponu (PBS), ile yıkanmışBununla birlikte, mikroorganizma boyutu Leishmania türlerinin (prosedürü video gösterilmemiştir) bağlı olarak değişebilir.

3. Deneysel enfeksiyon

Bir deri bölgesi aşılamadan önce traş edilir. Kısaca, hayvanlara anestezi pozisyonda yerleştirilebilir ve makas kullanırken, saç kuyruk tabanından iki inç kaldırılır. Bir papül oluşuncaya kadar steril serum fizyolojik ile traş bölgeyi temizledikten sonra parazitin inokulum intradermal enjekte edilir.

4. Klinik takibi

Hayvanlar 4 ila 7 güne kadar her izlenir - 6 hafta lezyonun görünümü için inokülasyonundan. Kısaca, hayvanların bir tuzak immobilize ve inoküle deri alanı palpe edilir. Daha sonra, oluşan ülser sertleşme alanda tarif edilmektedir ve genişliği ve uzunluğu ülser bir dijital çap pergeliyle ölçülmüş.

2. Hamsterlerin Tedavi

1. YöneticiBileşiklerin istration

Hayvanlar ülsere lezyonlar (4-6 hafta sonrası aşılama) geliştirdiğin zaman tedavi programı başlar. Hayvanlar test edilecek, her bileşik için 5-6 hayvan grupları dağıtılır. Bileşikleri topikal, oral, intramusküler veya intralezyonel yollar vasıtasıyla tatbik edilebilir. Ilaç uygulanmasından önce, hamster anestetize ve lezyon alanı tuz çözeltisi ya da PBS ile temizlenir. Bileşik topikal veya intralezyonel aracılığıyla uygulandığı zaman, hamster bileşiğin ağızdan veya intramüsküler yoldan tatbik edildiğinde hamster güvenli bir boyun baz tarafından sabitlenmiş olan, süre tedavi etmek için alanda ortaya izin Tuzaklarda immobilize edilir. a) Topikal uygulama: bileşiği lezyon isapplied ve birkaç dakika sonra, hayvanlar intramüsküler enjeksiyon için) cage.b döndürülür, ilacın bir kıç semitendinous ya semimembranous kas yoluyla (200 ul maksimum) enjekte edilir. c) Sözlü idari içintration, ilacın bir 1 ml şırınga bağlı bir oro-gastrik sonda aracılığıyla 14G hayvan (200 ul maksimum) ile sağlanır. d) intralezyonel enjeksiyon için ilaç (100 ul maksimum) yavaş yavaş yerleştirilen konik bir 26G iğne kullanarak ülser tabanına enjekte edilir. Lezyonun tüm alanı iğne dönüşü ile kaplıdır. Tedavileri tanımlandığı terapötik şemasına göre, 10-20 gün boyunca her gün uygulanmış edilir.

2. Klinik takibi

Bu deneysel modelde, yeni Antileishmanial bileşiklerin tedavisinden sonra etkinliğini lezyonların yara iyileşmesi ve göre belirlenmesinden dolayı, her bir hayvana bir klinik izleme sonra bileşik ve en çok üç ay uygulamanın sonu haftalık yapılır. Izleme sırasında, bir dijital çap pergeliyle lezyonun tipi tanımlanmıştır ve sertlik ve ülser alanı ölçülür. Farklı bölgelerde lezyonların varlığıinokulasyon sitesi gibi lezyonun atak görünüşünü de açıklanan ve kaydedilir. Her iki hafta, hayvanların ağırlıkları ve lezyonlar resmedilmiştir. Hayvanlar izlemek için günlük gözlenir: a) fiziksel görünüm (kulak saç, koordinasyon, sıcaklık, gözler, konumu, damat, dışkılama, asit sıvısının varlığı, ajitasyon ve dehidratasyon) ve b) davranışı (uyanık, tetikte, meraklı, dikkatli ,), grupla kalır yakalamak için yiyecek ve içecek, ve sert için sabırsızlanıyor. Bileşik uygulama sitesi de hiperemi, enflamasyon ve ısırma ve epilasyon varlığı gözlenmektedir.

Hamsters bileşiklerinin toksisitesi (bkz. aşağıda) ile ilişkili olabilir hematolojik ve serolojik değerlerini belirlemek üzere tedavi sonunda 45. gün, aynı zamanda kanatıldı vardır.

Her tedavinin etkinliği aşağıdaki skoru Sist kullanarak, lezyon boyutları öncesinde ve tedaviden sonra karşılaştırarak değerlendirilirem: (% 100 alan ve lezyonun tamamen kaybolması iyileşme) tedavi; klinik iyileşme (alanının>% 50 lezyon boyutunu azaltma), klinik yetmezliği (lezyon boyutu artar); nüks lezyon üzerinde Kuruduktan sonra). Çalışmanın sonunda, hayvanlar CO2 önceki anestezi inhalasyon bırakılarak itlaf edilmiştir. Ölümden sonra, parazit histolojik ve serolojik analiz için gerekli olan numuneler alınmaktadır.

3. Parazitolojik sınavları

Cilt (lezyon veya yara) alınan örneklerde Leishmania varlığı, karaciğer, dalak ve böbrek Giemsa 1 ve bu dokuların histopatolojik inceleme (bkz. aşağıda) ile boyandı smear inceleyerek doğrudan belirlenir.

Lezyon sitede parazit yükü Titus ve arkadaşları (1985) 2 göre sınır dilüsyon testi ile tahmin edilmektedir. Kısaca, bir doku küçük bir parçası kaldırılırHer bir hayvan, tartılır ve bir şırınga kullanılarak piston soğuk PBS çözeltisi içinde homojenleştirilmiştir. Elde edilen süspansiyon 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edilir 600g Bundan sonra, süpernatan atılır ve pellet% 1 antibiyotik ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde tekrar süspanse edilir. Süspansiyon bir yüz l 50 ul Schneider ortam ile NNN orta üste konan içeren mikrotitre plaka 96 kuyucuklu her birine transfer edilir ve 26 tutulur ° C. Her bir örnek içinde uygulanabilir parazitlerin sayısının promastigotları bir ay süreyle her hafta ters bir mikroskop altında incelenmesi ile tespit edilebilir olan en yüksek seyreltme ile tespit edilir.

4. Histopatolojik deri lezyonu incelenmesi (ya da yara izi) ve diğer dokularda

Cilt, karaciğer ve böbrek alınan biyopsi örneğinin üçüncü bir parça% 10 formalin fikse parafin gömülüdür. Dalak ve kalpten Örnek ayrıca işlenebilir olabilir. FSabit dokuların ive mikron bölümleri haemotoxilin-eozin ile boyandı ve mikro mimari, sızmak hücresel özellikleri ve parazitlerin varlığı veya yokluğu çalışma 200X, 400X veya 1000X immersiyon yağı kullanan optik mikroskop altında incelenmiştir. Fotomikrografları alınan ve dijital görüntüler yakalanır.

5.. Tedavi toksisite değerlendirilmesi

Bileşiğin toksik aktivite (yukarıya bakınız) takip klinik boyunca izlenir parametrelere göre hayvanların ve fiziksel davranışın durumuna bağlıdır. Toksisite da kan örnekleri ve yukarıda açıklandığı gibi haemotoxilin-eozin ile boyanan doku kesitlerinde gözlenen histopatolojik değişiklikler hematolojik ve metabolik parametrelere göre belirlenir.

Kan numuneleri kalp, tercihen ventrikül alınır. Hematolojik testi için kan EDTA'lı tüplere aktarılarak göre işlenirtam kan sayımı için protokoller standardize etmek. Serolojik testleri için, kan 1,5 Eppendorf şişeleri aktarılır ve Kodak Ektachemdry kimyası 3 kullanılarak ölçülür kreatinin, ALT ve üre düzeylerinin metabolik analizi için serum elde etmek için santrifüje tabi tutulur.

6. Veri analizi

Tedavi edilen ve edilmeyen Hayvanlardan elde edilen veriler ANOVA testi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Anlamlılık p <0.05 olarak belirlenmiştir.

4. Temsilcisi sonuçları

Özet

Kutanöz leishmaniasis hamsteri modeli ilaç etkinliğini taramasında bu model kullanılarak amacı ile geliştirildi. Lezyon gelişimi ve parazitolojik parametreleri hamsterlerin dermal deride primer enfeksiyon üzerine çalışıldı. Kendilenmiş kadın ve erkek altın hamster (Mesocricetus auratus), 6-8 hafta, 1 x 10 7 (erkekler için) veya 1.5 x 10 7 (kadınlar için) metacycl ile intradermal olarak enjekte edildiL. ic (sabit faz) promastigotları amazonensis. Nodüller 20 çıktı - 35 gün pi, enfeksiyon kurulduktan sonra, iki dozda beş değerli antimon (SBV) etkinliğini evalauted edildi pi 4-6 hafta sonrası oluşan ülser. Hamster 5 hayvanların her üç gruba ayrıldı ve intramüsküler yolla 10 gün içinde 80 veya 120 mg SBV / kg günlük olarak meglumin antimoniate ile tedavi. Üçüncü grup plasebo olarak PBS ile intramusküler tedavi edildi. Üç hayvandan oluşan bir grup tedavi edilmemiş ve bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Her tedaviye yanıt 3 ay tedavi süresinin bitiminden sonra takip edildi.

1. L. sonra klinik seyir altın hamsteri (Mesocricetus auratus) ve amazonensis enfeksiyonu

Dorsal deri enfekte hamster tutarlı bir enfeksiyondan sonra 4-6 hafta epidermisin klinik olarak belirgin ülserasyon gelişir. Lezyonlar küçük nodüller ve bitiş ülserleri ile başlayanZaman sonrası enfeksiyon göre boyut artış ve (4 haftada 18,99 ile 54,7 mm 2 ve sonrası enfeksiyon altıncı haftanın dördüncü tarafından deneysel ilaçların etkilerinin değerlendirilmesi için optimal bir boyutu olarak kabul edilen ulaşmak 6 hafta 35,55 için 92,71 mm 2) (Figures1, 2). Lezyonlar daha sonra deney sonlandırıldı edildiği anda en fazla 20 hafta sonrası enfeksiyon için açık bir yarası, (Şekil 1) korudu.

L. Enfeksiyon amazonensis 104,9 sırasıyla 124,69 gr ve enfekte ve enfekte hamsterlarda 129,71 ile 134,02 gr, (p> 0.05, Anova) arasında değişmekteydi hamsterlerin vücut ağırlığı etkilemez. Hayvanların çalışma sırasında 25,58 arasında bir ortalama ± vücut ağırlığının% 5,98 kazanmıştır. Kreatinin, alanin amino transferaz (ALT) ve hemogram parametreleri Seric değerleri bulaşmamış ve Leishmania enfekte hamster başvurular değerlere benzer bulunmuştur. Sadece topuz üre azotu (BUN) düzeyi olduEnfekte hayvanların% 60 ugmented.

L. ile enfekte hamsterlarda lezyonların histopatolojik analizi amazonensis bu enfekte hayvanlarla ilgili farklılıklar gösterdi. Bu L. ile enfekte ise genel olarak, enfekte olmamış hamster alınan deri biyopsisi, herhangi bir iltihabi reaksiyon ya da herhangi bir histolojik değişiklik (Şekil 3a) göstermek amazonensis granülomatöz dermatit ve dermis (Şekil 3b) infiltre makrofajlarda bol varlığını daha da geliştirmek. L. ile enfekte hamsterlardan dokuları histopatolojik analizi amazonensis ve 10 gün boyunca 80 ve 120 mg SBV / kg / gün dozlarında meglumin antimoniate ile tedavi edilen kontrol grubu (enfekte olmuş ve tedavi edilmemiş) olanlara benzer gözlemlenen enfeksiyonu sürecine bağlı değişim gözlendi. Genel olarak, hamster ve cilt örnekleri hafif bir plasmocytes düzeyi (% 20) ve lenfosit infiltrasyonu orta (% 80) ile birlikte PMN (% 80) hücreleri, ve hafif (% 20) ya da şiddetli (% 80) infiltr gösterdimakrofajların tirme (Tablo 2). Bu gözlemler granülomatöz dermatit, dermis ve alttaki kas ödün enflamatuar bir olayın bir teşhis karşılık gelir. Bu çalışmada tüm hayvanlarda kutanöz leishmaniasis ciddi tezahürü ile uyumlu enfeksiyon, ilişkili ana lezyon. Bu ilişki istatistiksel korelasyon zaman p <0.05 vermiştir Pearson, bir ki-kare. Hayvanların% 60-100 Böbrek örnekleri böbrek korteks ve hayvanların% 75'inde böbrek hafif atrofi eşlik glomerül orta hiperplazi gösterdi. Bu gözlemler, membran proliferatif glomerulonefritis, daha önce diğer Leishmania türleri ile enfeksiyon enfeksiyonu ile ilişkili olan bir tanı ile uyumludur. İstatistiksel ilişki Pearson p <0.05 bir ki-kare ile büyüktü. Tüm gruplardaki hayvanların% 40-100 arasında ciğeri associat olabilir hepatositlerde hafif vakuoler değişiklikler gösterdiBöyle Karaciğer glikojen birikimi gibi fizyolojik süreçleri ed. Bu tür yağlı dejenerasyon, fibrozis ve tıkanıklık gibi diğer karaciğer doku anormallikleri enfeksiyon süreci karşılık gelir. Böyle vakuoler hepatositlerde değişiklikleri, cardiomegalies, intrasitoplazmik eosinophiles kapanımları varlığında, aynı zamanda böbrek tüpler içerisinde hücre vakuolizasyonu gibi diğer gözlemler istatistiksel olarak test bileşiğinin bir toksik etkinin ilâ (p <0.05) ve ilişkili muhtemel değildir hamster fizyolojik bir süreç nedeniyle.

2. Hamster modeli meglumin antimoniate tedavideki etkinliği

Tedaviden sonra farklı zaman noktalarında enfekte hamsterlerin klinik fenotip Tablo 1'de özetlenmiştir. 10 gün boyunca ağırlığı 120 mg SBV / kg / gün dozunda intramüsküler meglumin antimoniate ile muamele L. indükleyici tam regresyon çok etkili olduğu Tüm hayvanlarda amazonensis lezyonları (Şekil 4). Kür yüzdesi 2 ve 8 hafta tedavi sonrası dönem içindeki% 100 idi. Ancak, üç ay sonra lezyon nüks hamster% 20 oranında gözlenmiştir. Meglumin antimoniate 80 mg SBV / kg vücut ağırlığı olarak uygulandığı zaman, tam kür sadece 3 hayvanları gözlenmiştir. Diğer iki hayvanlarda lezyon, sırasıyla 33,9 ve 69,0%, (Şekil 5) azalmıştır. Üç ay sonra, L. amazonensis 80 mg SBV / kg / gün dozunda meglumin antimoniate ile tedavi edilen bütün hayvanların ciltte bulunan ve 120 mg SBV / meglumin antimoniate kg / gün ile tedavi edilen hayvanların sadece bir kalmıştır. Intramüsküler 120 bir tedavi edici dozu mg SBV / gün boyunca 10 kg / gün tespit edildi.

Sınırlayıcı seyreltme ölçümleme, parazit sayısı tahmini negatif (işlenmemiş) kontrol ve araç (plasebo) tedavi grubuna göre meglumin antimoniate ile tedavi edilen grup için önemli bir azalma (p <0.001) gösterdi. Canlı parazitler (0.4 ile 1, Cilt dokusunun mg başına 6 parazitler) tedavi edilmemiş hayvanların lezyon yerinde tespit ve bu PBS ile tedavi edildi. 120 mg / kg / gün (Şekil 5b) ve 80 mg / kg / gün (Şekil 5c) ile tedavi edilen iki hamster ile tedavi edilen bir hayvan: Parazitler sadece meglumin antimoniate ile tedaviye yanıt vermedi bu hayvanlardan izole edilmiştir. Hiç fark edilmeyen veya PBS ile tedavi edilenlere hayvanlara kıyasla meglumin Antimonit aldıktan sonra tedavi vermedi hamsterlerin parazit yükü gözlendi.

SBV 120 mg / kg / gün intramusküler meglumin antimoniate ile tedavi hamsterlardan deri biyopsisi histopatolojik olarak parazit gözlenen vardır; dermis infiltre birkaç makrofaj ve lenfosit (Şekil 6a, 6b) görülür. Aksine olarak, hamster yoğun SBV 80 mg / kg / gün, dermis infiltre makrofajların bol varlığı ile granülomatöz dermatit olarak meglumin antimoniate ile tedavi edildiğinde (Şekil 6c, 6d) gözlenir.

Etkinlik çalışması, 80 ve 120 mg SBV / kg vücut ağırlığı meglumin antimoniate toksisitesi için aynı tedavi şeması kullanılarak değerlendirilmiştir. Genel sağlık durumu ve vücut ağırlığı son dozdan sonra 3 aya kadar takip edildi. Ile tedavi sırasıyla 104,9 den 124,69 gr ve enfekte ve enfekte hamsterlarda 129,71 ile 134,02 gr arasında değişmekteydi hamsterlerin vücut ağırlığı etkilemedi. Hayvanların tedavi ve 28,74 sırasında 27,59 ortalama ± vücut ağırlığının% 4,22 kazanmış ± 2,26% takip (p> 0.05, Anova) sırasında. Kilo kaybı tedavisi (veri gösterilmemiştir) herhangi bir grup gözlenmedi. Kreatinin, alanin amino transferaz (ALT) ve hemogram parametreleri Seric değerleri tedavi edilmemiş ve meglumin antimoniate tedavi hamster başvurular değerlere benzer bulunmuştur. Sadece topuz üre azotu (BUN) düzeyi ile tedavi edilen hayvanların% 20 artırmış oldu.

HistopatL. ile enfekte hamsterlardan dokuların hological analizi amazonensis ve 80 ve 120 dozlarda meglumin antimoniate ile tedavi mg SBV / 10 gün boyunca kg / gün ilaç toksisitesi ile ilişkili herhangi bir değişiklik gösterdi.

Tablo 1
Tedaviden sonra bir Fosfat tampon tuzlu, b Gün.
Tablo 1. L. klinik fenotipi amazonensis deneysel meglumin antimoniate tedavisinden sonra hamsterlar enfekte

;>% 50 lezyon boyutunu azaltarak klinik iyileşme (kür (% 100 alan ve lezyonun tamamen kaybolması iyileşme): Her tedavinin etkinliği aşağıdaki puan sistemi ile lezyon boyutları öncesi ve tedavi sonrası, karşılaştırarak değerlendirildi alan); klinik yetmezliği (lezyon boyutu artar); nüks (tedavi sonrası lezyon reaktivasyonu).


A: yok işareti, NA: geçerli değil; m: hafif, M: orta, S: Şiddetli; PMN: polimorfonükleer nötrofiller; NSL: anlamlı bir lezyon; GDM: Granülomatöz dermatomiyozit; PGT: Pyogranulomatous dermatit. 1. Lenfanjiektazi; 2. Mineral benzeri bir malzeme.
Tablo 2. Hamsterlerin cilt Histopatoloji deneysel L. ile enfekte amazonensis ve meglumin antimoniate ile muamele

Şekil 1
1-1.5 x 10 7 L. ile intradermal inoküle hamsterlarda enfeksiyon sonrası cilt lezyon gelişimi Şekil 1. Ders amazonensis metacyclic (sabit faz) 20 hafta boyunca promastigotları. Eksen y mm ülser alanını temsil eder.

Şekil 2
Şekil 2. Photog2 hafta (a), 4 haftalık 10 x 10 7 intradermal aşılama sonrası bir altın hamster dorsal cilt lezyon ülserasyon gelişme raphyic geçmişi (b) ve 6 hafta (c).

Şekil 3
. (B) ile enfekte olan ve tedavi edilmezse hamsteri; hiçbir iltihabi reaksiyon, ne anlamlı bir histolojik değişim gözlenir: çok çekirdekli dev hücrelerin varlığı ile granülomatöz dermatit (ok artı yıldız) ve bol parazitler (siyah 3 Cilt (a) Hamster bulaşmamış ve tedavi edilmezse biyopsisi Şekil oklar) ve makrofajlar (beyaz oklar) dermis infiltre. Hematoksilen-Eosin leke 400x.

Şekil 4
Hamsterlerin klinik yanıt Şekil 4. Fotografik geçmişi L. ile enfekte amazonensis ve 120 mg SBV / kg / gün milleri azından intramüsküler meglumin antimoniate ile muamele g 10 gün. Pictures tedavisi (10 gün) (b) bir ucunda, tedavi öncesi lezyonlar görünüşünü (a) gösterir, ve sırasında takip: günde 30 (c), 60 (d) ve 90 (e) sonra tedavi.

Şekil 5,
Şekil 5. Hamsterlarda kutanöz leishmaniasis tedavisinde meglumin antimoniate Etkinliği. Altın hamster L. ile enfekte edildi dorsal deri amazonensis. Enfeksiyon 6 hafta sonra da (a) tedavi edilmemiş ya da tek başına PBS (b), meglumin antimoniate 120 mg SBV / kg / gün (c) ya da 80 mg SBV / kg / gün (d) ile on gün boyunca intramüsküler muamele edildi. Grafikler tedavi sonunda tedavi sonunda lezyon boyutu (gün 0) azalma yüzdesini gösterir, ve günde 15, 30, 60 ve 90 takip. p 120 veya 80 <0.001 mg SBV / kg / gün vs araç ve değildir tedavisi.

"/>
Şekil 6. Cilt 120 mg SBV / kg / gün '(a, b) ve 80 mg SBV / kg / gün' (c, d) de enfekte edilmiş ve intramüsküler megumine antinmoniate ile muamele hamsterlardan biyopsisi. Dermis infiltre kıt makrofaj ve lenfosit varlığı. Hayır parazitler görülür. Fagositize parazitler köpüklü makrofajlar;. Hematoksilen-Eozin yoğun bir şekilde dermisi infiltre makrofajların bol varlığı (c) 1000x (c) granülomatöz dermatit, 200x (a) lekesi. Hematoksilen-Eozin (d) 1000x, 200x (b) leke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kutanöz leishmaniasis tropik ve neotropics endemiktir. Genellikle küçük olduğundan kütanöz nodüllerden gros mukozal doku tahribine arasındadır klinik belirtileri, bir değişken spektrumunun bir grup hastalığı olarak adlandırılır. En mevcut ilaçlar pahalı, uzun tedavi rejimleri gerektiren ve yeni ilaçların keşfi gerektiren, giderek etkisiz hale gelmektedir.

Fare modelinde yaygın olarak kullanılan ama bazı dezavantajlara sahiptir. Oldukça BALB / c görüldüğü gibi genişleyen bir ülserli lezyon ile karakterize kalıcı enfeksiyon ile duyarlı ve: Böylece örneğin, dermotropic Leishmania türlerinin promastigotları intradermal enjeksiyonu sonrası gelişen lezyon temelinde, fareler üç gruba ayrılabileceğini DBA / 2, DBA / 3 fareleri; CBA / H, C3H/He ve A / J ve oldukça dirençli bir grup gerçek bir lezyon tipik ola görülen lezyonlar 8 hafta içinde çözebilir nispeten dirençli grubuNZB ve C57BL içinde / 6 fareleri 4 görüldüğü gibi kutanöz leishmaniasis cal enjeksiyon gelişir. Bunlar duyarlı olarak hastalığın tabii belirgin bir dizi ortak kendilenmiş fare suşlara ve Leishmania türler arasında değişmekteydi kütanöz leishmaniasis'in sıçan modelinde aksine, altın hamster, Mesocricetus auratus biyo-modeline uygun Leishmania türlerine karşı ilaçlar değerlendirmek için kabul edilir Leishmania. 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 farklı türlerin enfeksiyonuna. Dermotropic Leishmania türlerinin herhangi metacyclic (sabit faz) promastigotları Aşılanması bir ve iki ay sonrası aşılama arasındaki deri lezyonları yol yapabiliyor. Lezyonlar ülsere, daha sonra nodüller gelişti papüller olarak pi ve ortaya 20 gün oldu. Inokülasyon sitesi (pe burunları, foodpad, kulak veya baz kuyruk) ve bağlı hamster deneysel enfeksiyon sonrası tahmin edilebilir bir hastalık evrimi, th en görüntülere zaman kutanöz leishmaniasis ile insan görülenlere benzer bir kronik ülsere yerel lezyon gelişimi ile karakterizedir. Bununla birlikte, insan gibi, lezyonlar, her bir bağışıklık durumunun bağlı boyutlarda değişmektedir ve bu yüzden, bazı hamsterlarda lezyon ve lezyon boyutu dolayısıyla redüksiyon çözülmesi için bir girişim görülebilir.

Bu makalenin L. promastigotları kullanarak hamsterlerin dorsal deri deneysel enfeksiyon açıklanır, ancak amazonesis, bu modelde inokulum sadece boyutu değişen, diğer dermotropic Leishmania türler için de mümkündür. Özetle, sırt derisine promastigotları intradermal enjeksiyon yaklaşımı hamster dorsal deri indüklenen kutanöz leishmaniasisin klinik ve patolojik özellikler insan hastalığa oldukça benzer olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, belirli bir bileşik veya d tedavisinden sonra ülserlerinin takip klinikkilim dorsal deri bağlı CL bu modelde kolaylaştırılır. Lezyonların evrimi kolaylıkla tedavi öncesi ve sonrası elde edilen lezyonun boyutu karşılaştırılmasıyla saptanmaktadır. Tedavi açısından klinik yanıt kolaylıkla yeniden epitelizasyonu (Şekil 4'te görüldüğü gibi) göre takip eder. Biz türlerin Leishmania ile hamster dorsal cilt deneysel enfeksiyon bu bileşiklerin olası doğrulamak için yararlı bir modeli gösterir sonucuna Antileishmanial ilaçlar için adaydırlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

COLCIENCIAS ve Tropikal Hastalıklar karşı Ürünleri Geliştirme Merkezi - - CIDEPRO Bu çalışma Antioquia Üniversitesi (Codi), Fen ve Teknoloji Geliştirme Kolombiyalı Enstitüsü Araştırma Komitesi hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ketamine Reagent Holliday –Scott S.A
Xilacine Reagent Synthesis
PBS Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190-136
Digital caliper Equipment Fisher Scientific 15-077-958
Giemsa Reagent Sigma-Aldrich GS1L-1L
Formalin Reagent Nova lab 11273
Paraffin Reagent Pechiney Plastic Packaging PM-996
Haemotoxilin Reagent Nova lab 10870103
Eosin Nova lab 10870203
Kodak Ektachem dry chemistry Equipment Kodak Ektachem DT-60
meglumine antimoniate Reagent Aventis
Microscopy Equipment Nikon Instruments YS2-T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Control of the leishmaniasis. Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis WHO. 949, (2010).
  2. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol. 7, 545-555 (1985).
  3. Reynolds, K. M. The Kodak Ektachem dry layer technology for clinical chemistry. Upsala. J. Med. Sci. 91, 143-146 (1986).
  4. Handman, E., Ceredig, R., Mitchell, G. F. Murine cutaneous leishmaniasis: disease patterns in intact and nude mice of various genotypes and examination of some differences between normal and infected macrophages. Australian J. Exp. Biol. Med. Sci. 57, 9-29 (1979).
  5. Hanson, W., Chapman, W., Waits, V., Lovelace, J. Development of Leishmania (Viannia) panamensis lesions and relationship of numbers of amastigotes to lesion area antimony-treated and untreated hamsters. J. Parasitol. 77, 780-783 (1991).
  6. Henao, H. H., Osorio, Y., Saravia, N. G., Gómez, A., Travi, B. Efficacy and toxicity of pentavalentantimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomédica. 24, 393-402 (2004).
  7. Travi, B. L., Martinez, J. E., Zea, A. Antimonial treatment of hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis: assessment of parasitological cure with different therapeutic schedules. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87, 567-569 (1993).
  8. Hommel, M., jaffe, C. L., Travi, B., Milon, G. Experimental models for leishmaniasis and for testing anti-leishmanial vaccines. Ann. Trop. Med. Parasitol. 89, 55-73 (1995).
  9. Travi, B. L., Osorio, Y., Saravia, N. G. The inflammatory response promotes cutaneous metastasis in hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis. J. Parasitol. 82, 454-457 (1996).
  10. Travi, B. L., Osorio, Y. Failure of Albendazole as an alternative treatment of cutaneous Leishmaniasis in the hamster model. Memorias Instituto Oswaldo. 93, 515 (1998).
  11. Travi, B. L., Osorio, Y., Melby, P. C., Chandrasekar, B., Arteaga, L., Saravia, N. G. Gender is a major determinant of the clinical evolution and immune response in hamsters infected with Leishmania spp. Infect Immun. 70, 2288-2296 (2002).
  12. Osorio, Y., Melby, P. C., Pirmez, C., Chandrasekar, B., Guarín, N., Travi, B. L. The site of cutaneous infection influences the immunological response and clinical outcome of hamsters infected with Leishmania panamensis. Parasite Immunol. 25, 139-148 (2003).
  13. Osorio, Y., Bonilla, D. L., Peniche, A. G., Melby, P. C., Travi, B. L. Pregnancy enhances the innate immune response in experimental cutaneous leishmaniasis through hormone-modulated nitric oxide production. J. Leukoc. Biol. 83, 1413-1422 (2008).
  14. Espitia, C. M., Zhao, W., Saldarriaga, O., Osorio, Y., Harrison, L. M., Cappello, M., Travi, B. L., Melby, P. C. Duplex real-time reverse transcriptase PCR to determine cytokine mRNA expression in a hamster model of New World cutaneous leishmaniasis. BMC Immunol. 22, 11-31 (2010).
Hamsterlar ve Dorsal Skin Kutanöz Leishmaniasis: Antileishmanial Uyuşturucu Tarama için Faydalı Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).More

Robledo, S. M., Carrillo, L. M., Daza, A., Restrepo, A. M., Muñoz, D. L., Tobón, J., Murillo, J. D., López, A., Ríos, C., Mesa, C. V., Upegui, Y. A., Valencia-Tobón, A., Mondragón-Shem, K., RodrÍguez, B., Vélez, I. D. Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs. J. Vis. Exp. (62), e3533, doi:10.3791/3533 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter