Summary
रोगाणु सेल प्रत्यारोपण और वृषण ऊतक xenografting के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन कर रहे हैं. दाता व्युत्पन्न प्राप्तकर्ता testes में शुक्राणुजनन में रोगाणु सेल प्रत्यारोपण परिणाम और spermatogonial स्टेम सेल (SSCs) की पहचान के लिए एक कार्यात्मक पुनर्गठन परख का प्रतिनिधित्व करता है. वृषण xenografting ऊतक प्राप्तकर्ता चूहों में वृषण और विभिन्न दाता प्रजातियों के विकास शुक्राणुजनन reproduces.
Protocol
PART चूहों में ए रोगाणु सेल प्रत्यारोपण
1. प्राप्तकर्ता चूहों की तैयारी
- प्राप्तकर्ता दाता वृषण कोशिकाओं immunologically सहिष्णु होना चाहिए (या तो आनुवंशिक दाताओं या प्रतिरक्षा की कमी करने के लिए मिलान).
- प्राप्तकर्ता या तो स्वाभाविक रूप से शुक्राणुजनन से रहित (जैसे डब्ल्यू डब्ल्यू / चूहों वी) या अंतर्जात जर्म कोशिकाओं का समाप्त होना चाहिए. रोगाणु सेल रिक्तीकरण विकिरण या Busulfan जैसे chemotherapeutic दवाओं के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम Busulfan साथ प्राप्तकर्ता चूहों की तैयारी की विधि का वर्णन.
- Busulfan आईपी इंजेक्शन के माध्यम से उम्र के 4-6 सप्ताह में प्राप्तकर्ताओं को समझो. Busulfan का इष्टतम खुराक तनाव निर्भर है. आमतौर पर इस्तेमाल किया प्राप्तकर्ता उपभेदों में 40-50 मिलीग्राम / किग्रा की एक खुराक अंतर्जात जर्म कोशिकाओं (जैसे नग्न चूहों के लिए / 44 किलो मिलीग्राम, 50 मिलीग्राम / किलो B6/129 F1 के प्राप्तकर्ताओं के लिए). व्यय के लिए पर्याप्त है
- DMSO में Busulfan पाउडर भंग और तो बाँझ आसुत जल टी के एक समान मात्रा जोड़ेंओ 4 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता. 35-40 डिग्री सेल्सियस से पहले Busulfan की तेज़ी से बचने के लिए उपयोग समाधान गर्म रखें. समाधान त्यागें अगर तेज़ी मनाया जाता है.
- Busulfan उपचार के बाद, प्राप्तकर्ताओं का उपयोग करने से पहले कम से कम एक महीने की अनुमति देते हैं. प्राप्तकर्ता 1 माह और 3 महीने पोस्ट - Busulfan उपचार के बीच में इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. Microinjection pipettes की तैयारी
- एक 1.0 मिमी की बाहरी व्यास, एक .75 मिमी भीतरी व्यास, और 3 इंच की लंबाई के साथ borosilicate ग्लास pipettes (केशिका ट्यूब) चुनें.
- Sigmacote साथ कांच pipettes Siliconize, मेथनॉल साथ pipettes कुल्ला और सूखी झटका.
- एक विंदुक डांड़ी का उपयोग pipettes खींचो. अलग विंदुक खींचने मशीन है, इसलिए, विभिन्न सेटिंग्स कुछ सेटिंग्स का परीक्षण करें. आम तौर पर, एक स्पष्टीकरण pipettes बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है कि इसी तरह की स्थापना का काम कर सकते हैं.
- विदारक माइक्रोस्कोप के तहत विंदुक युक्तियाँ पहले तोड़ने के लिए लगभग 50 माइक्रोन की एक व्यास को प्राप्त करने के लिए उपयोगनोक पर.
3. दाता कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए तैयार
- दाता तनाव के choise प्रयोगात्मक अध्ययन प्रश्न पर निर्भर है. यदि शुक्राणुजनन की मात्रा का ठहराव endpoint के रूप में प्रयोग किया जाता है, Lac-Z के रूप में आसानी से पहचाना आनुवंशिक मार्कर के साथ दाताओं के उपयोग (जैसे B6.129S7 जी.टी. (रोजा) / जैक्सन प्रयोगशाला से 26Sor जे) या GFP (जैसे C57BL/6-Tg ( सीएजी EGFP) के 1Osb / जैक्सन प्रयोगशाला से जम्मू).
- 1 DNase की DMEM में 7 मिलीग्राम / एमएल पर मिलीग्राम / एमएल, trypsin - EDTA की 4 मिलीग्राम (0.25% trypsin अधिक 1mm EDTA), और 2 मिलीलीटर में Collagenase के DMEM में 7 मिलीग्राम तैयार है. यह राशि 2 दाता माउस testes को पचाने के लिए है.
- वृषण aseptically लीजिए और Tunica धवल को हटा दें. फैलाओ बीजदार ठीक संदंश के साथ धीरे tubules लिए एंजाइमी पाचन की सुविधा.
- Collagenase में स्थानांतरण tubules, 5-10 मिनट है, और अक्सर आंदोलन के लिए 37 ° C पर सेते हैं.
- (3 मिनट के लिए 200-300 ग्राम) कताई और पीबीएस w / ओ 2 Ca में फिर से निलंबित कर tubules दो बार धो + +
- Trypsin EDTA में tubules फिर से निलंबित और हिला जब तक वे चिपचिपा और बादल बन. मॉनिटर 37 में tubules की पाचन डिग्री सेल्सियस के रूप में यह 1-2 मिनट के भीतर हो जाना चाहिए.
- DNase जोड़ें और अच्छी तरह हिला. 1-2 मिनट के लिए सेते हैं.
- एंजाइमों की कार्रवाई को रोकने के FBS की 3 मिलीलीटर जोड़ें.
- फ़िल्टर सेल 40-70 माइक्रोन रोमकूप आकार के साथ एक नायलॉन जाल का उपयोग करने के लिए सेल / ऊतक हिस्सा हटाने के निलंबन.
- 5 मिनट के लिए 600 ग्राम से कम कोशिकाओं को इकट्ठा और DMEM (<100 μl) की एक छोटी राशि में फिर से निलंबित कोशिकाओं.
- कोशिकाओं गिनती और एक वांछित अंतिम एकाग्रता (आमतौर पर x 100 10 6) की मात्रा को समायोजित. बर्फ पर सेल निलंबन से पहले रखें उपयोग करने के लिए.
- प्रत्येक Busulfan इलाज माउस वृषण सेल निलंबन का केवल 10-15 μl से भर जाएगा. संभावित बेकार और रिसाव के कारण, वृषण प्रति 30-50 μl है उद्देश्य है.
4. प्रत्यारोपण प्रक्रिया (चित्रा 1)
- बेहोश करना प्राप्तकर्ताओं को मंजूरी दी प्रोटोकॉल का पालन.
- पृष्ठीय में रखेंअवलंबन और शल्य चिकित्सा पेट क्षेत्र तैयार. एक ~ 1cm midline के पेट चीरा बनाने के लिए पेट की दीवार का पर्दाफाश करने के लिए. सफेद लाइन के बिंदु पर छोटे संदंश का उपयोग गलती से पेट अंगों को घायल कर से बचने के लिए, और उदर गुहा peritoneal बेनकाब दीवार के midline पर एक ~ 0.5 सेमी चीरा बनाने के लिए आगे बढ़ना द्वारा पेट की दीवार उठा.
- एक परितारिका संदंश का उपयोग करने के लिए पेट की दीवार पकड़ करने के लिए, और वसा और peritoneal गह्वर में अधिवृषण वृषण से जुड़ी पैड के लिए खोज करने के लिए परितारिका संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करें. धीरे वसा पैड बाहर खींच तक वृषण exteriorized है और वृषण धमनी और अधिवृषण स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. एक समय में एक वृषण पर काम करते हैं.
- एक पतली बाँझ वसा बेहतर दृश्य पहचान (वैकल्पिक) के लिए पैड / वृषण के नीचे autoclaved सूचकांक कार्ड से बना कपड़ा रखें. कपड़ा भी तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए काम करता है.
- सेल निलंबन में Trypan ब्लू डाई की एक बूंद जोड़ें और ध्यान से polyethy में सेल निलंबन लोडlene टयूबिंग 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा है. टयूबिंग में खींच लिया विंदुक देते हैं और धीरे पिपेट में सिरिंज के लिए दबाव लागू करने से सेल निलंबन मजबूर.
- अपवाही नलिकाओं (कि अधिवृषण वृषण कनेक्ट) को पहचानें और धीरे नलिकाओं के आसपास वसा ऊतकों को हटाने. सावधानी से काम के रूप में और उनके आसपास झिल्ली नलिकाओं पारभासी हैं.
- ध्यान से अपवाही नलिकाओं के बंडल में पिपेट वाहिनी में सम्मिलित करने के लिए, धीरे वृषण की ओर कुछ मिमी धागा.
- इंजेक्शन विंदुक चलती से परहेज, सिरिंज तक पहुँचने के लिए, धीरे सिरिंज का गोताख़ोर दबाना करने के लिए सुनिश्चित करें कि निलंबन जाल वृषण और बीजदार tubules में बहती है को भरने के लिए शुरू.
- इंजेक्शन और सेल निलंबन की दर प्रवाह अंगूठे दबाव के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. दबाव में अचानक वृद्धि से बचें, tubules में निलंबन के आंदोलन की निगरानी.
- इंजेक्शन जब लगभग सभी सतह tubules से पहले वृषण bec करने के लिए शुरू होता है भर दिया गया है बंद करोइस्कीमिक ome.
- उदर गुहा वृषण लौटें. Contralateral वृषण पर प्रक्रिया दोहराएँ. सीवन 6-0 रेशम सीवन के साथ पेट की दीवार और धातु घाव क्लिप के साथ त्वचा बंद करें. पूरी वसूली जब तक एक वार्मिंग पैड पर चूहों मॉनिटर.
5. प्राप्तकर्ता testes के विश्लेषण
- विश्लेषण से पहले प्रत्यारोपण के बाद 2-4 महीने की अनुमति दें.
- जानवरों की देखभाल और उपयोग से संबंधित मार्गनिर्देशों के अनुसार प्राप्तकर्ता माउस Euthanize और वृषण और पीबीएस में अधिवृषण इकट्ठा. जब एक लाख Z ट्रांसजेनिक दाता तनाव इस्तेमाल किया गया है, अधिवृषण एक सकारात्मक धुंधला नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में यह अंतर्जात बीटा galactosidase गतिविधि है.
- दाता कोशिकाओं का लाख - Z धुंधला द्वारा पता लगाने के लिए, 4 में 1-2 घंटे के लिए वृषण ° पीबीएस में 4% paraformaldehyde की (पीएफए) में सी को ठीक. LacZ में कमरे के तापमान पर 3 एक्स 30 मिनट कुल्ला बफर कुल्ला.
- 37 ° C पर रातोंरात lacZ धुंधला समाधान में सेते हैं. वृषण एक पूरे के रूप में या dispersing के बाद कलंकित किया जा सकता हैtubules.
- फिक्स और 10% तटस्थ formalin बफर में संग्रहीत. यदि वर्गों की जरूरत है काउंटर दाग के रूप में तटस्थ तेजी लाल का उपयोग करें.
भाग बी अस्थानिक चूहों में xenografting
(2011 से Dobrinski और राठी 15, 2008 और Rodriguez के सोसा एट अल. 16).
1. दाता ऊतक का संग्रह
- इस बधिया द्वारा वृषण ऊतक प्राप्त या दाता पुरुष से बायोप्सी.
- पीबीएस या संस्कृति माध्यम में बायोप्सी में जगह वृषण, बाँझ स्थितियों को बनाए रखने.
- बर्फ और प्रयोगशाला के लिए परिवहन पर एकत्र ऊतक रखें.
2. दाता ऊतक की तैयारी
- ऊतक संस्कृति हुड में प्रदर्शन करने के लिए बाँझपन बनाए रखने के लिए.
- पीबीएस के साथ एक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करने से पहले दो से तीन बार बहुत ठंडा पीबीएस युक्त एंटीबायोटिक दवाओं में प्रत्येक वृषण धो लें. बायोप्सी के मामले में, वृषण टुकड़े बहुत ठंडा संस्कृति दवा के साथ दो से तीन बार धोउम 2 मिनट के लिए 150g पर कताई और ताजा बर्फ ठंड संस्कृति मध्यम में resuspending एंटीबायोटिक दवाओं युक्त.
- बरकरार वृषण के लिए, सतह के साथ एक चीरा Tunica vaginalis हटाने के और वृषण को हटा. वृषण सभी चयक संरचनाओं (वृषण रज्जु, अधिवृषण, संयोजी ऊतक) से निकालें. वृषण एक बार एक PBS के साथ एक संस्कृति पकवान में ठंड पीबीएस और हस्तांतरण में धो लें.
- ध्यान से एक स्केलपेल ब्लेड और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके वृषण की Tunica धवल हटा दें. यदि वृषण बहुत छोटा है, Tunica Tunica के वृषण ऊतक फैलाएंगे जबकि दूसरे छोर पर छोटे संदंश की एक जोड़ी के साथ एक छोटा सा चीरा के माध्यम से एक छोर पर बने Tunica पकड़े द्वारा हटाया जा सकता है.
- वृषण का आकार पर निर्भर करता है या तो पूरी वृषण ऊतक लगभग 1 के छोटे टुकड़ों में काटा जा सकता है - 3 मिमी 2 घुमावदार संदंश और एक स्केलपेल ब्लेड, या वृषण ऊतक के बड़े टुकड़ों का उपयोग कर आकार में पहले वृषण से हटाया जा सकता है और फिर छोटे में काटटुकड़े. यह सब बहुत ठंडा संस्कृति के माध्यम में और एक छोटे से संस्कृति पकवान (60 x15 मिमी) में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.
- बहुत ठंडा छोटे संस्कृति बर्तन में संस्कृति के माध्यम से तैयार ऊतक टुकड़े बर्फ पर जब तक कलम बांधने का काम हस्तांतरण.
3. प्राप्तकर्ता माउस का बधिया करना
- माउस के रूप में ऊपर से बेहोश करना और बाल (नहीं आवश्यक नग्न चूहों में) कतरन, 70% इथेनॉल और Betadine समाधान के साथ पोंछते द्वारा बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार.
- एक 0.5 -1 सेमी उदर midline त्वचा के लिए पेट की दीवार का पर्दाफाश चीरा करें.
- ध्यान से वृषण, वृषण धमनी और अधिवृषण 4.2-4.3, PartA में वर्णित के रूप में बेनकाब.
- कुंद विच्छेदन द्वारा gubernaculum से epidydimis की पूंछ को अलग करें.
- वृषण धमनी कटी घमनी को बांधना, और कि वीएएस रेशम के साथ रक्त वाहिका के साथ एक साथ deferens, और वृषण और संयुक्ताक्षर बीच में काटने के द्वारा ligated संरचनाओं अनुभाग.
- Seco के लिए प्रक्रिया को दोहराएँएन डी वृषण.
- एक या दो शल्य टांके के साथ पेट की दीवार सीवन.
- एक या दो मिशेल क्लिप के साथ त्वचा चीरा बंद करें.
4. Xenografting अस्थानिक
- उदर अवलंबन में माउस की स्थिति और ऊपर के रूप में अपनी पीठ पर एक बाँझ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र तैयार है.
- कितने grafts के (आमतौर 4-8/mouse) डाला जा रहे हैं पर निर्भर करता है, माउस की पीठ के मध्य लाइन के प्रत्येक पक्ष पर ~ 0.5 सेमी लंबे समय त्वचा चीरों बनाते हैं.
- संदंश का प्रयोग त्वचा चीरा की एक सीमा पकड़, और एक चमड़े के नीचे गुहा अलावा संयोजी ऊतक का उपयोग कैंची चिढ़ा.
- एक परितारिका संदंश जगह वृषण उपचर्म गुहा में गहरी ऊतक का एक टुकड़ा का उपयोग करना, एक और परितारिका संदंश के साथ त्वचा चीरा की सीमा पकड़े.
- एक मिशेल क्लिप के साथ त्वचा चीरा बंद करो और हीटिंग पैड पर माउस रखें जब तक यह करने के लिए संज्ञाहरण से उबरने के लिए शुरू होता है.
- अतिरिक्त इन्सुलेशन और सह के साथ एक पिंजरे के लिए माउस स्थानांतरणदेखें और निगरानी चूहों जब तक पूरी तरह से ठीक कर रहे हैं.
5. विश्लेषण शुक्राणु कटाई के लिए वृषण xenografts का संग्रह
- जानवरों की देखभाल और उपयोग से संबंधित मार्गनिर्देशों के अनुसार मेजबान माउस Euthanize, और वापस गर्दन और खुली त्वचा पूंछ से चल रहा है त्वचा पर midline त्वचा के चीरा. इस grafts के जो चमड़े के नीचे ऊतक पर स्थित या तो किया जा सकता है या त्वचा से जुड़ी उजागर.
- ध्यान से grafts की एक जोड़ी संदंश और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर हटा दें.
- Grafts के बरामद, आकार और व्यक्तिगत grafts के वजन के रिकार्ड संख्या.
- माउस के पेट से लाभदायक vesicles निकालें और testosterone उत्पादन का एक संकेत के रूप में grafted ऊतकों द्वारा उनके वजन रिकॉर्ड.
- ऊतकीय विश्लेषण के लिए
- नमूना मात्रा में BOUIN समाधान (या अन्य लगानेवाला) युक्त शीशी में xenografts स्थगित xenograft की कि में 10x ~~, और लेबल शीशी उचित.
- सेना70% इथेनॉल में अधिमानतः 24 घंटे के अंतराल पर कम से कम 3 बार धोने के बाद फ्रिज में रातोंरात.
- प्रसंस्करण और पैराफिन में एम्बेड करने के लिए आगे बढ़ें.
- शुक्राणु एकत्रित करने के लिए
- उन्हें कताई नीचे 300g में 1 मिनट के लिए और उन्हें संस्कृति मध्यम युक्त एंटीबायोटिक दवाओं में resuspending xenografts धो लें.
- छोटे टुकड़ों में grafts के कट और एक टिशू कल्चर 3 युक्त पकवान में संदंश के साथ सावधानी से क़ीमा मध्यम संस्कृति की 5 मिलीलीटर.
- 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फिल्टर कीमा बनाया हुआ ऊतक.
भाग सी. प्रतिनिधि परिणाम
1. रोगाणु सेल प्रत्यारोपण
यदि प्रतिरोपित दाता सेल निलंबन spermatogonial स्टेम कोशिकाओं को ले जाने LacZ transgene, प्राप्तकर्ता वृषण में दाता SSCs के औपनिवेशीकरण के रूप में एक आनुवंशिक मार्कर एक्स लड़की धुंधला द्वारा visualized sem की विशिष्ट नीले क्षेत्रों के रूप में हो सकता हैiniferous के बाद 2-3 महीने 3 के बाद प्रत्यारोपण के (2A चित्र) tubules. एक अच्छी तरह से स्थापित कॉलोनी नीले कोशिकाओं के दो या अधिक परतों केंद्र के लिए करीब है, और अपेक्षाकृत कमजोर दाग क्षेत्रों के साथ दोनों सिरों पर एक लंबे समय तक पूरी तरह से भरा क्षेत्रों के गहरे नीले रंग की लगातार होना चाहिए जहां एकल बनती है, या नीले कोशिकाओं के छोटे समूहों के एक नेटवर्क स्पष्ट है (चित्र 2B) 3. गहरे नीले बीजदार छोटी नली क्षेत्र के एक क्रॉस सेक्शन अच्छी तरह से स्थापित प्रकट शुक्राणुजनन और विभिन्न भेदभाव चरणों (चित्रा -2) में नीले जर्म कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह का आयोजन होना चाहिए.
2. वृषण xenografting ऊतक
प्रत्यारोपण के बाद वृषण ऊतक की व्यवहार्यता inversely दाता की विकास मंच के साथ सहसंबद्ध है, सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त होता है, जब नवजात पुरुषों से ऊतक प्रयोग किया जाता है, जबकि वयस्क ऊतक एक उच्च पतित और 17-21 मर प्रवृत्ति से पता चलता है. आम तौर पर, xenograft सफलता कम हो जाती है के रूप में दाता ऊतक मुझे आएशुक्राणुजनन की पहली लहर के iosis. अपरिपक्व दाता ऊतक और पूरा शुक्राणुजनन के पूर्ण विकास के लिए समय प्रजातियों विशिष्ट है, और अक्सर कुछ बगल में वृषण के साथ तुलना में कम है. बीजदार tubules की पूरी शुक्राणुजनन साथ संख्या प्रजातियों के अनुसार चर रहा है. भेड़ों में हालांकि, बकरी और सूअर है कि संख्या 50% से अधिक मवेशी और बिल्लियों में है, यह कम से कम 15 14% (चित्रा 3).
आकृति 1. संज्ञाहरण के बाद पृष्ठीय अवलंबन में रोगाणु सेल प्रत्यारोपण प्रक्रिया जगह प्राप्तकर्ता और एक ~ 0.4 इंच के midline पेट चीरा (ए). वसा पैड अधिवृषण और वृषण से जुड़ी वापस करके वृषण बेनकाब और वसा बेहतर दृश्य पहचान (बी) के लिए पैड / वृषण के नीचे एक पतली बाँझ कपड़ा जगह है. वृषण और अधिवृषण स्थिति तो यह है कि अपवाही वसा पैड में दफन नलिकाओं प्रत्यक्ष कर रहे हैं (सी, डी, ई). पहचानअपवाही नलिकाओं इकाई और धीरे नलिकाओं चारों ओर वसा ऊतकों को हटा दें. रंग का कागज या प्लास्टिक का एक टुकड़ा बेहतर दृश्यावलोकन (जी) के लिए नलिकाओं के नीचे रखा जा सकता है. तोड़ या नलिकाओं और विंदुक (एच) में और लोड सेल निलंबन के आकार के अनुसार विंदुक टिप पीसने. ध्यान से एक नली में अपवाही नलिकाओं के बंडल में पिपेट सम्मिलित करने के लिए, धीरे वृषण (एच में तीर विंदुक इंजेक्शन और सूत्रण की दिशा दिखाता है) की ओर कुछ मिमी धागा. बीजदार tubules में सफल इंजेक्शन के साथ एक वृषण (मैं) दिखाया गया है. टीएस: वृषण, Ep: उपांड.
चित्रा 2. रोगाणु सेल प्रत्यारोपण) इंजेक्शन एक्स - लड़की के साथ दाग वृषण के लिए प्रतिनिधि का परिणाम है. बीजदार tubules की नीले क्षेत्रों ट्रांसजेनिक दाता SSCs (LacZ transgene) से स्थापित कालोनियों का प्रतिनिधित्व करते हैं. बी) के 3 महीने के बाद प्रत्यारोपण एक एसएससी कॉलोनी के उच्च बढ़ाई. गुई केंद्र में गहरे नीले क्षेत्र पूरा हो गया है और सिरों पर शुक्राणुजनन पीली नीली क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करता है कॉलोनी की बढ़ रही है विस्तार का प्रतिनिधित्व करते हैं. सी) गहरे नीले बीजदार छोटी नली के histological खंड (3 महीने के बाद प्रत्यारोपण) अच्छी तरह से आयोजित शुक्राणुजनन से पता चलता है. बी और सी में स्केल सलाखों के 200 माइक्रोन और 30 माइक्रोन, क्रमशः. (आंकड़े सालाना रेव सेल देव बॉय से अनुकूलित 2008;. 24:263-86 और बॉय Reprod के 1999 जून, 60 (6) :1429-36).
चित्रा 3. Immunodeficient चूहों में बड़े जानवरों से अपरिपक्व वृषण ऊतक के अस्थानिक xenografting अपरिपक्व दाता वृषण के टुकड़े (~ 1 3 मिमी) पृष्ठीय immunodeficient चूहों की त्वचा (ए) के तहत प्रतिरोपित. के लिए जीवित और माउस गोनैडोट्रॉपिंस को जवाब कर रहे हैं. एक परिणाम के रूप में, वृषण ऊतक निषेचन सक्षम शुक्राणु (बी) के गठन सहित, पूर्ण विकास की प्रक्रिया है. एक बार वृषण xenografts एकत्र कर रहे हैं (सी)वे विश्लेषण के लिए या आईसीएसआई (ई) और भ्रूण उत्पादन (एफ) के लिए शुक्राणु (डी) प्राप्त किया जा सकता. सलाखों के बराबर 50 (बी ई, और एफ) माइक्रोन या 10 माइक्रोन (डी). (Rodriguez के सोसा और 2009 14 Dobrinksi से संशोधित).
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Discussion
1. रोगाणु सेल प्रत्यारोपण
रोगाणु सेल प्रत्यारोपण के केवल एक सेल आबादी में spermatogonial स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति (SSCs) की स्पष्ट पुष्टि के लिए कार्यात्मक परख प्रदान करता है. केवल SSCs घर और तहखाने झिल्ली में एसएससी आला उपनिवेश और दाता व्युत्पन्न शुक्राणुजनन आरंभ. रोगाणु सेल प्रत्यारोपण यह अध्ययन करने के लिए और एक अभूतपूर्व तरीके से SSCs हेरफेर संभव बनाया. तकनीक लिए 4 SSCs की आनुवंशिक हेरफेर के माध्यम से ट्रांसजेनिक जानवर के उत्पादन में इस्तेमाल किया गया, पैटर्न, और एसएससी 3,8 उपनिवेशण की दक्षता कैनेटीक्स को स्पष्ट संकेत दे रास्ते कि आत्म नवीकरण और 9,10 भेदभाव एसएससी विनियमित अध्ययन, विशेषताएँ सतह मार्कर उनकी पहचान के लिए 22,23 SSCs पर, 6,7,24 SSCs के लिए आला वातावरण का अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, पारस्परिक प्रत्यारोपण की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है कि क्या infertilit की फेनोटाइपy Sertoli कोशिकाओं में एक दोष से या रोगाणु 25,26 कोशिकाओं में उत्पन्न.
के लिए प्रत्यारोपण कुशलतापूर्वक काम करने के लिए, पसंद और प्राप्तकर्ता पशुओं के उपचार महत्वपूर्ण है. प्राप्तकर्ता या तो आनुवंशिक चाहिए दाताओं या प्रतिरक्षा दबा करने के लिए मिलान. प्राप्तकर्ता भी कमी अंतर्जात शुक्राणुजनन चाहिए: या तो डब्ल्यू / डब्ल्यू वी चूहों में के रूप में एक परिवर्तन के कारण या विकिरण या Busulfan जैसे chemotherapeutic दवाओं से रोगाणु सेल कमी का एक परिणाम के रूप में बांझ प्रदान की गई है. इसके अलावा, दाता सेल निलंबन और प्रत्यारोपण प्रक्रिया में प्रवीणता की एक अच्छी तैयारी के रूप में अच्छी तरह से तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं.
रोगाणु सेल प्रत्यारोपण इसकी अपनी सीमाएं हैं. परिणामों के लिए कोई पढ़ने के जल्दी बाहर है. प्राप्तकर्ता वृषण का विश्लेषण करने के लिए कम से कम दो महीने के इंतजार के रूप में दो महीने अन्यथा बांझ प्राप्तकर्ताओं में पूरा शुक्राणुजनन के reestablishment 3 प्रत्यारोपण के बाद होता है की जरूरत है. यह मैंएक गुणात्मक या अर्द्ध मात्रात्मक परख सेल नंबर इंजेक्शन और प्राप्तकर्ता रोगाणु सेल दमन की डिग्री में बड़े बदलाव के कारण. हालांकि रोगाणु सेल प्रत्यारोपण की अवधारणा अन्य जानवरों की प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया गया है, प्रक्रिया ही तकनीकी रूप से अलग और कुछ अधिक 11 प्रजातियों भर में शारीरिक अंतर का एक परिणाम के रूप में गैर कृंतक प्रजातियों में चुनौतीपूर्ण है.
2. वृषण xenografting ऊतक
वृषण ऊतक कई स्तनधारी दाता की प्रजातियों भर में काम करता है xenografting और एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक है. प्रत्यारोपण के अन्य प्रकार के रूप में जल्दी के बाद संग्रह ऊतक सफलता का बड़ा मौका प्रतिरोपित किया जाता है. इसलिए, संरक्षण और संग्रह से प्रत्यारोपण के लिए ऊतक के निपटने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, हमारे अनुभव वृषण ऊतक में विशेष हैंडलिंग की तुलना में किया जा रहा है प्रशीतित रखा अन्य की आवश्यकता नहीं है. वृषण ऊतक रेफ्रिजरेटर के तापमान पर रखा जा सकता है 24 से ऊपर - 36 घंटा,और फिर टुकड़े प्रत्यारोपण के लिए तैयार किया जा सकता है. इसके अलावा, ताजा वृषण के टुकड़े मानक संस्कृति माध्यम में 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पूर्व प्रत्यारोपण किया जा सकता है कलम बांधने का काम परिणाम 27 पर एक प्रत्यक्ष प्रभाव के बिना बनाए रखा. वृषण ऊतक भी अगर लंबी अवधि के भंडारण वांछित है cryopreserved किया जा सकता है. 13 बकरी, सुअर 13,27, और 28 बंदर में प्रदर्शन अध्ययन से पता चला है कि ठंड और वृषण ऊतक का विगलन बाद काफी विकसित करना और अस्थानिक चूहों में xenografting के बाद शुक्राणु उत्पादन क्षमता को प्रभावित नहीं करता है. वृषण ऊतक के सफल स्वचालित ठंड 28 या पारंपरिक एक शराब 13,27 स्नान, मानक टिशू कल्चर FBS युक्त मध्यम में cryoprotectant के रूप में DMSO के उपयोग में धीमी गति से ठंड cryopreservation के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. प्रत्यारोपण के लिए, cryopreserved वृषण ऊतक तो मानक तरीकों से thawed है और बाद में प्रत्यारोपण से पहले 27 मध्यम संस्कृति में धोया. एक बार आज़ादीमुकदमा प्रत्यारोपित किया गया है प्राप्तकर्ता माउस में vivo में इनक्यूबेटर और कोई बड़ा हस्तक्षेप की आवश्यकता है के रूप में कार्य करता है. हालांकि, कुछ मामलों में बहिर्जात गोनैडोट्रॉपिंस के साथ पूरकता के लिए आवश्यक हो सकता है, से वृषण ऊतक 6 महीने की उम्र में रीसस बंदरों प्राप्तकर्ता चूहों subcutaneously एक सप्ताह इंजेक्शन एचसीजी के 10 आइयू साथ है दो बार 6-7 29 महीने में पूरा शुक्राणुजनन पाने के लिए आवश्यक है.
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, सबसे अच्छा परिणाम जब नवजात पुरुषों से ऊतक प्रयोग किया जाता है प्राप्त की है. पुरुषों से ऊतक में postmeiotic जर्म कोशिकाओं मौजूद हैं पतित प्रवृत्ति से पता चलता है. हालांकि, अपरिपक्व जानवरों के साथ वृषण विकास की पूरी संक्षिप्त संभव है और कई नैदानिक अनुसंधान और आवेदन किया है. एक नैदानिक सेटिंग में, वृषण xenografting ऊतक प्रजनन संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विशेष रूप से अपरिपक्व पुरुषों में शुक्राणु वसूली एक विकल्प नहीं है. बायोप्सी के रूप में छोटे टुकड़े और एकत्र किया जा सकता है लंबी अवधि के भंडारण के लिए जमे हुए. डेस जबIRED, टुकड़े और, thawed किया जा सकता 27,28 चूहों में grafted. एक अन्य विकल्प कि xenografts से काटा जाता है शुक्राणु की cryopreservation है. सुअर वृषण xenografts से तस्वीर जमे हुए शुक्राणु के साथ microinjection morphologically सामान्य भ्रूण की पीढ़ी में, हालांकि वृषण, अधिवृषणी की तुलना में एक कम क्षमता पर, या 27 शुक्राणु पड़ा. ऊतक के बाद विकसित की है, यह शुक्राणु कटाई के लिए एकत्र किया जा सकता है और शुक्राणु के 13,16,30 इन विट्रो में भ्रूण का उत्पादन किया जा सकता है. इस की एक सीमा है, तथापि, तथ्य यह है कि शुक्राणु परिणामस्वरूप अधिवृषणी परिपक्वता से गुजरना नहीं और इसलिए निषेचन के लिए आईसीएसआई की आवश्यकता है. इसलिए, xenograft व्युत्पन्न शुक्राणु के निषेचन के लिए उपयोग प्रजातियों जहां आईसीएसआई स्थापित किया गया है के लिए सीमित है.
अनुसंधान में, वृषण xenografting ऊतक वृषण विकास और एक कृंतक मॉडल में शुक्राणुजनन बड़ी प्रजाति का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक विकल्प है. उदाहरण के लिए,एकल दाता वृषण कई चूहों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है. प्राप्तकर्ता चूहे तो अलग उपचार, और / या xenograft संग्रह के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर बलिदान को उजागर किया जा सकता है. यह न केवल दाता प्रभाव समाप्त, लेकिन यह भी एक विशेष प्रयोग या अध्ययन के लिए आवश्यक बड़े पुरुषों की संख्या कम कर देता है. इस बड़े जानवरों में जहां कई पुरुषों को शामिल अध्ययन logistically मुश्किल और महंगा कर रहे हैं विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, और नैतिक सीमाओं primates में, विशेष रूप से ले जाने के लिए,. हालांकि, वृषण ऊतक xenografting के अनुप्रयोग विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में हेरफेर के रूप में सीमित कर रहे हैं पहले प्रत्यारोपण आसानी से संभव नहीं है और कुछ दाता 14 प्रजातियों में शुक्राणुजनन की क्षमता कम है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों प्रयोगशाला से कार्य USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213) द्वारा समर्थित किया गया है, NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (R21 ES014856 1-01A2) और अलबर्टा innovates स्वास्थ्य समाधान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase (type IV) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053-028 | |
| Trypan blue stain | Invitrogen | 15250-061 | |
| Nylon mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 (40µm) 352350 (70µm) | |
| Busulfan | Sigma-Aldrich | B2635 | |
| Thin-Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-3 | |
| BD intramedic plyethylene tubing (PE100) | BD Biosciences | CA-63018-725 | |
| Ethicon 6-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | 706G | |
| Wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P3667 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 |
References
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