Summary
Protocollen voor kiemcellen transplantatie en testis weefsel xenografting worden beschreven. Germ celtransplantatie resulteert in een donor-afgeleide spermatogenese in de ontvangende testes en vertegenwoordigt een functionele reconstitutie test voor de identificatie van spermatogoniale stamcellen (SSC's). Testis weefsel xenografting reproduceert testis ontwikkeling en spermatogenese van verschillende soorten donor in de ontvangende muizen.
Abstract
Germ celtransplantatie is ontwikkeld door Dr Ralph Brinster en collega's van de Universiteit van Pennsylvania in 1994 1,2. Deze baanbrekende studies toonden aan dat micro-injectie van kiemcellen van vruchtbare donor muizen in de testes van de onvruchtbare ontvangende muizen resulteert in een donor-afgeleide spermatogenese en sperma productie door de ontvanger dier 2. Het gebruik van donor mannen dat het bacteriële β-galactosidase gen toegestaan identificatie van donor-afgeleide spermatogenese en de overdracht van de donor haplotype aan het nageslacht door ontvangende dieren 1. Verrassend, na transplantatie in het lumen van de tubuli seminiferis, getransplanteerde kiemcellen konden van de luminale compartiment verplaatsen naar de kelder membraan waar spermatogonia zich bevinden 3. Het is algemeen aanvaard dat alleen SSC's kunnen de nis en herstellen spermatogenese bij de ontvanger testis koloniseren. Daarom kiemceltransplantatie zorgt voor een functionele benadering van de stamcel niche in de testis te bestuderen en vermeende spermatogoniale stamcellen te karakteriseren. Tot op heden is kiemcel transplantatie gebruikt om de basis stamcelbiologie toe te lichten, om transgene dieren produceren door middel van genetische manipulatie van geslachtscellen voorafgaand aan de transplantatie 4,5 tot Sertoli cel-kiemcel interactie 6,7, SSC homing en kolonisatie 3 te bestuderen, 8, evenals SSC zelfvernieuwing en differentiatie 9,10.
Germ celtransplantatie is ook mogelijk in grote soorten 11. In deze, de belangrijkste toepassingen zijn het behoud van de vruchtbaarheid, de verspreiding van de elite van de genetica bij dieren, en het genereren van transgene dieren als de studie van de spermatogenese en SSC biologie met deze techniek is logistiek moeilijker en duurder dan in knaagdieren. Transplantatie van kiemcellen van grote soorten in de testes van muizen resulteert in colonization van donor cellen en spermatogonia expansie, maar niet in hun volledige differentiatie vermoedelijk wegens onverenigbaarheid van de ontvanger somatische cel compartiment met de kiem cellen van fylogenetisch verre species 12. Een alternatieve benadering is de transplantatie van kiemcellen van grote soorten samen met hun omringende somatische compartiment. We hebben eerst gemeld in 2002, dat kleine fragmenten van testis weefsel van onvolwassen mannetjes getransplanteerd onder de dorsale huid van immunodeficiënte muizen in staat zijn om te overleven en te ondergaan volle ontwikkeling met de productie van de bevruchting bevoegde sperma 13. Sindsdien testis weefsel xenografting is gebleken om succesvol te zijn in vele soorten en naar voren gekomen als een waardevol alternatief voor de testis ontwikkeling en spermatogenese van de grote dieren in muizen 14 te bestuderen.
Protocol
DEEL A. Germ cel transplantatie bij muizen
1. Voorbereiding van de ontvanger muizen
- Ontvangers moeten immunologisch tolerant (hetzij genetisch aangepast aan donoren of immuun-deficiënte) aan de donor testis cellen.
- De afnemers moeten worden hetzij van nature, zonder spermatogenese (bijv. W / W v muizen) of helemaal leeg van endogene kiemcellen. Germ cel depletie kan worden bereikt door bestralen of chemotherapeutische medicijnen zoals Busulfan. In dit protocol beschrijven we de methode voor het bereiden ontvangende muizen met busulfan.
- Behandel de ontvangers op 4-6 week van leeftijd door ip injectie van busulfan. De optimale dosis van busulfan is stam afhankelijk. In veel gebruikte ontvanger stammen, een dosis van 40-50 mg / kg is voldoende om endogene kiemcellen (bijv. 44 mg / kg voor naakt muizen, 50 mg / kg voor B6/129 F1 ontvangers). Afbrekende
- Los Busulfan poeder in DMSO en voeg dan een gelijk volume van steriel gedistilleerd water to maken een eindconcentratie van 4 mg / ml. Houd de oplossing warm bij 35-40 ° C voor gebruik om de neerslag van Busulfan te voorkomen. Gooi oplossing als neerslag wordt waargenomen.
- Na de behandeling met busulfan, zodat ten minste een maand voor het gebruik van ontvangers. Ontvangers kunnen gebruikt worden tussen 1 maand en 3 maanden na de behandeling met busulfan.
2. Voorbereiding van micro-injectie pipetten
- Kies borosilicaatglas pipetten (capillaire buizen) met een 1.0 mm buitendiameter, een 0,75 mm binnendiameter, en een lengte van 3 inch.
- Siliconize glazen pipetten met Sigmacote afspoelen pipetten met methanol en föhnen.
- Trek de pipetten met een pipet trekker. Verschillende pipet trekker machines hebben verschillende instellingen dan ook een paar instellingen te testen. Algemeen kan een instelling vergelijkbaar met die gebruikt voor de vervaardiging enucleatie pipetten werken.
- Voorafgaande Breek de pipetpunten onder stereomicroscoop te gebruiken tot een diameter van ongeveer 50 micrometer te bereikenaan het uiteinde.
3. Voorbereiding van de donor cellen voor transplantatie
- Choise van donorstam is afhankelijk van de studeerde experimentele vraag. Indien kwantificering van de spermatogenese wordt gebruikt als eindpunt, het gebruik van donoren met een gemakkelijk herkenbare genetische merker zoals de Lac-Z (bijv. B6.129S7-GT (ROSA) 26Sor / J van Jackson Laboratory) of GFP (bijv. C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J van Jackson Laboratory).
- Bereid 7 ml van collagenase in DMEM bij 1 mg / ml, 4 ml trypsine-EDTA (0,25% trypsine plus 1 mM EDTA), en 2 ml van DNase in DMEM bij 7 mg / ml. Dit bedrag is voor de vertering 2 donor muis testes.
- Aseptisch Verzamel testes en verwijder de tunicaalbuginea. Spread testes voorzichtig met fijn pincet te vergemakkelijken enzymatische spijsvertering.
- Transfer tubuli in collagenase, incuberen bij 37 ° C gedurende 5-10 min en schud vaak.
- Tweemaal Was tubuli door spinnen (200-300 g voor 3 min) en opnieuw suspenderen in PBS w / o Ca 2 + +
- Opnieuw te schorten tubuli in trypsine-EDTA en schud totdat ze plakkerig en troebel is. Monitor de vertering van pijpjens bij 37 ° C zoals het dient binnen 1-2 min.
- Voeg DNase en goed schudden. Incubeer gedurende 1-2 min.
- Voeg 3 ml van FBS aan de actie van enzymen stoppen.
- Filter celsuspensie met behulp van een nylon mesh met 40-70 micrometer poriegrootte naar cel / weefsel brokken te verwijderen.
- Verzamel cellen bij 600 g gedurende 5 min en resuspendeer cellen in een kleine hoeveelheid DMEM (<100 ul).
- Tel cellen en het volume op een gewenste uiteindelijke concentratie (meestal 100 x 10 6). Blijf celsuspensie op ijs vóór gebruik.
- Elke Busulfan-behandelde muizen testis zal gevuld worden met slechts 10-15 pi van celsuspensie. Vanwege potentiële afval en lekkage, beogen met 30-50 pi per testis hebben.
4. Transplantatie procedure (figuur 1)
- Verdoof ontvangers volgende goedgekeurde protocollen.
- Plaats in dorsaledecubitus en chirurgisch de voorbereiding van de buikstreek. Maak een ~ 1 cm middellijn incisie in de buikwand naar de buikwand bloot te leggen. Til buikwand met behulp van kleine tang op het punt van de witte lijn om te voorkomen dat per ongeluk verwonden buikorganen, en om een ~ 0,5 cm insnijding maken op de middellijn van de buikwand naar de peritoneale holte bloot te gaan.
- Gebruik een iris een tang om de buikwand te houden, en gebruik een ander paar iris tang te zoeken naar de vetkussentjes aan de bijbal en de testis in de buikholte. Trek het vet pad uit tot de testis is exteriorized en de testis slagader en bijbal zijn duidelijk zichtbaar. Werk op een testis op een moment.
- Leg een dun steriel laken gemaakt van autoclaaf fiches onder de dikke pad / testis voor een betere visuele identificatie (optioneel). De incisiefolie werkt ook te vangen vloeistof.
- Voeg een druppel trypan blauw kleurstof in de celsuspensie en zorgvuldig de celsuspensie te laden in de polyethyleenlene slang aangesloten op een 1 ml spuit. Bevestig de getrokken pipet in de slang en voorzichtig de celsuspensie te ver in de pipet door het toepassen van druk op de spuit.
- Identificeer de efferente kanalen (dat de testis te sluiten op de bijbal) en voorzichtig vetweefsel te verwijderen rond de kanalen. Ga voorzichtig te werk als de leidingen en het membraan om hen heen zijn doorschijnend.
- Voorzichtig de pipet in te voegen in een kanaal in de bundel van de efferente leidingen, voorzichtig draad een paar mm in de richting van de testis.
- Terwijl het vermijden van het verplaatsen van de injectie pipet, te bereiken voor de spuit, zachtjes druk de zuiger van de spuit om ervoor te zorgen dat de schorsing uitmondt in de rete testis en testes te vullen beginnen.
- De injectie snelheid en doorstroming van celsuspensie wordt geregeld door druk van de duim. Vermijd plotselinge toename van de druk; toezicht op de beweging van suspensie in tubuli.
- Stop de injectie bijna alle oppervlakte-tubuli zijn gevuld voordat de testis begint te BECome ischemische.
- Zet de testis naar de buikholte. Herhaal de procedure op de contralaterale testis. Hecht de buikwand met 6-0 zijden hechtdraad en sluit de huid met metalen wond clips. Monitor muizen op een warming-pad tot volledig herstel.
5. Analyse van de ontvanger testes
- Laat 2-4 maanden na de transplantatie voor de analyse.
- Euthanaseren van de ontvanger muis op basis van dierlijke zorg en gebruik van richtlijnen en het verzamelen van de testis en epididymis in PBS. Wanneer een Lac-Z transgene donorstam is gebruikt, kan de epididymis worden gebruikt als een positieve kleuring beheersing als het heeft endogene beta-galactosidase activiteit.
- Voor detectie van donor cellen door Lac-Z kleuring, bevestig de testis gedurende 1-2 uur bij 4 ° C in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Spoel 3 x 30 min bij kamertemperatuur in lacZ spoelen buffer.
- Incubeer overnacht bij 37 ° C in lacZ kleuroplossing. Testis kan worden gebeitst als een geheel of na dispergerende tubuli.
- Fix en op te slaan in 10% neutraal gebufferde formaline. Indien delen zijn nodig neutrale snel rood als contra-vlek.
DEEL B. Ectopische xenografting bij muizen
(Van Dobrinski en Rathi 2008 15, en Rodriguez-Sosa et al.. 2011 16).
1. Het verzamelen van donorweefsel
- Verkrijgen testis weefsel door castratie of biopsie van een donor man.
- Plaats testis in PBS of biopten in kweekmedium, handhaven van de steriele omstandigheden.
- Houd de verzamelde weefsel op het ijs en het transport naar het laboratorium.
2. Voorbereiding van donorweefsel
- Voer in de weefselkweek kap om de steriliteit te behouden.
- Was beide testikels in ijskoud PBS met antibiotica twee tot drie keer alvorens het in een cultuur-schotel met PBS. In het geval van biopten, was testis fragmenten twee tot drie keer met ijskoude cultuur medium met antibiotica door het draaien op 150 gram voor 2 min en resuspenderen in verse ijskoude kweekmedium.
- Voor intact testes, verwijder tunica vaginalis door het maken van een incisie langs het oppervlak en de extrusie van de testis. Verwijderen uit testis alle bijlage structuren (zaadstreng, bijbal, bindweefsel). Ze wast testes in koude PBS en de overdracht in een cultuur-schotel met PBS.
- Verwijder voorzichtig het tunicaalbuginea van de testis met behulp van een scalpel en een schaar. Als de testis erg klein is, kan de tunica worden verwijderd door knijpen de testismassa uit de tunica via een kleine incisie gemaakt op een uiteinde terwijl u de tunica met een paar kleine forceps aan de andere kant.
- Afhankelijk van de grootte van de testis ofwel de hele testis weefsel kan worden versneden in kleine stukjes van ongeveer 1 - 2 mm 3 in maat met gebogen pincet en een scalpel blade, of grote stukken testis weefsel kan eerst verwijderd uit de testis en vervolgens gesneden in kleinerestukken. Dit alles dient te gebeuren in ijskoud kweekmedium en onder steriele omstandigheden in een kleine cultuur schotel (60 x15 mm).
- Breng de voorbereide weefsel fragmenten te ijskoud kweekmedium in kleine cultuur-gerechten op ijs tot enten.
3. Castratie van de ontvanger muis
- Verdoof de muis zoals hierboven en voor te bereiden steriele chirurgische veld door het knippen van de haren (niet noodzakelijk in naakt muizen), bestrijken met 70% ethanol en Betadine-oplossing.
- Maak een 0,5 -1 cm ventrale middellijn incisie in de huid van de buikwand bloot te leggen.
- Voorzichtig bloot te leggen van de testis, de testis slagader en bijbal, zoals beschreven in PARTA, 4,2-4,3.
- Maak de staart van de epidydimis uit de gubernaculum door stompe dissectie.
- Ligeren van de testiculaire slagader, en de zaadleider, samen met het bloedvat met zijde, en het gedeelte geligeerde structuren door te snijden tussen de testis en de ligatuur.
- Herhaal de procedure voor de secoND testis.
- Hecht het buikwand met een of twee chirurgische steken.
- Sluit de incisie in de huid met een of twee Michel clips.
4. Ectopische xenografting
- Plaats de muis in ventrale decubitus en bereid je een steriel chirurgisch veld op zijn rug als hierboven.
- Afhankelijk van hoeveel grafts worden ingevoegd (algemeen 4-8/mouse), maken ~ 0.5 cm lang huidincisies aan weerszijden van het midden lijn van de rug van de muis.
- Gebruik een tang om een rand van de huid incisie te houden, en een onderhuidse holte door plagen elkaar het bindweefsel met een schaar.
- Met behulp van een iris een tang plaats een stukje testis weefsel diep in de onderhuidse holte, die de grens van de huid incisie met een andere iris tang.
- Sluit de incisie in de huid met een clip Michel en houd muis op verwarmingskussen tot het begint te herstellen van anesthesie.
- Breng de muis naar een kooi met extra isolatie en cover en monitor tot muizen zijn volledig hersteld.
5. Het verzamelen van testis xenografts voor analyse en sperma oogsten
- Euthanaseren de host muis op basis van dierlijke zorg en gebruik van richtlijnen, en maak een middellijn incisie in de huid op de rug huid die loopt van de staart tot aan de nek en open huid. Dit onthult de grafts die hetzij worden kunnen op het subcutane weefsel of aan de huid.
- Verwijder voorzichtig het enten met een paar pincet en een schaar.
- Record aantal grafts hersteld, de grootte en het gewicht van de individuele transplantaten.
- Haal de zaadblaasjes uit de buik van de muis en het opnemen van hun gewicht als een indicatie van de productie van testosteron door de geënte weefsel.
- Voor histologische analyse
- Suspend xenografts in monsterflesje bevattende Bouin's oplossing (of andere fixatief) in een volume op ~ 10x die van de xenograft, en label injectieflacon gepast.
- Broedennacht in de koelkast, gevolgd door het wassen van minstens 3 keer in 70% ethanol met tussenpozen van 24 uur bij voorkeur.
- Ga voor de verwerking en de inbedding in paraffine.
- Voor sperma oogsten
- Was xenotransplantaten door het draaien van hen neer op 300 g gedurende 1 minuut en resuspenderen in kweekmedium met antibiotica.
- Snijd grafts in kleine stukjes en gehakt zorgvuldig met de tang in een weefselkweek schotel met 3 - 5 ml kweekmedium.
- Filter gehakt weefsel door middel van de 40 micrometer cel zeef.
DEEL C. representatieve resultaten
1. Germ celtransplantatie
Als de getransplanteerde donor cel suspensie bevat spermatogoniale stamcellen het dragen van een genetische marker, zoals de LacZ transgen, kolonisatie van donor SSC's in de ontvangende testis kunnen worden gevisualiseerd door X-gal kleuring als kenmerkende blauwe segmenten van de seminiferous tubuli na 2-3 maanden na de transplantatie 3 (figuur 2A). Een goed gevestigde kolonie moeten een lange donkerblauwe strook van geheel gevuld segmenten met twee of meer lagen blauwe cellen dichter bij het centrum, en relatief zwakkere gebrandschilderde regio aan beide eindigt waar een netwerk van single, gepaarde of kleine groepen blauwe cellen blijkt 3 (figuur 2B). Een dwarsdoorsnede van de donkerblauwe seminiferous regio moet uitwijzen gevestigde en goed georganiseerde spermatogenese met blauwe kiemcellen in verschillende stadia differentiatie (figuur 2C).
2. Testis weefsel xenografting
De levensvatbaarheid van testis weefsel na de transplantatie is omgekeerd evenredig met de ontwikkelingsfase van de donor; het beste resultaat wordt verkregen wanneer weefsel van pasgeboren mannen wordt gebruikt, terwijl de volwassen weefsel vertoont een sterke neiging tot degenereren en afsterven 17-21. Algemeen xenograft succes af naarmate donor weefsel ondergaat meiosis van de eerste golf van de spermatogenese. Tijd om volledige ontwikkeling van de onvolwassen donorweefsel en volledige spermatogenese is soortspecifiek, en vaak iets korter in vergelijking met de testes in situ. Het aantal van de tubuli seminiferi met volledige spermatogenese is variabel afhankelijk van de soort. Terwijl in schapen, geiten en varkens dat aantal groter is dan 50%, in vee en katten het is minder dan 15% 14 (Figuur 3).
Figuur 1. Germ cel transplantatie procedure. Plaats ontvangers in dorsale decubitus na de anesthesie en maak een ~ 0.4-inch middellijn incisie in de buikwand (A). Expose testis door intrekking van het vet pad aan de epididymis en testis en leg een dun steriel laken onder de dikke pad / testis voor een betere visuele identificatie (B). Plaats de testis en epididymis, zodat de efferente kanalen begraven in de dikke pad te onderscheiden zijn (C, D, E). Identiteit van de efferente leidingen en zacht vet weefsel te verwijderen rond de kanalen. Een stuk gekleurd papier of plastic kan worden geplaatst onder de leidingen voor betere visualisatie (G). Breken of de pipet tip malen volgens de grootte van de leidingen en load celsuspensie in de pipet (H). Voorzichtig de pipet in te voegen in een kanaal in de bundel van de efferente leidingen, voorzichtig draad een paar mm in de richting van de testis (de pijl in de H geeft de richting van de pipet injectie en threading). Een testis met succesvolle injectie in de testes wordt weergegeven (I). Ts: testis; Ep: bijbal.
Figuur 2. Representatieve resultaten voor kiemcellen transplantatie A) Een geïnjecteerd testis gekleurd met X-gal. De blauwe segmenten van de testes vertegenwoordigen gevestigde kolonies van transgene donor SSC's (LacZ transgen). B) Hogere vergroting van een SSC kolonie op 3 maanden na de transplantatie. The donkerblauwe gebied in het centrum vertegenwoordigt volledige spermatogenese en de lichtblauwe regio's aan de uiteinden vertegenwoordigen groeiende uitbreiding van de kolonie. C) Een histologische deel van de donkerblauwe seminiferous (3 maanden na de transplantatie) toont goed georganiseerd spermatogenese. Scale bars in B en C zijn 200 micrometer en 30 urn, respectievelijk. (Cijfers aangepast van Annu Rev Cell Dev Biol 2008;. 24:263-86 en Biol Reprod 1999 Jun;. 60 (6) :1429-36).
Figuur 3. Ectopische xenografting van onrijpe testis weefsel van grote dieren in immunodeficiënte muizen. Fragmenten van onvolwassen donor testis (~ 1 mm 3) getransplanteerd onder de dorsale huid van immunodeficiënte muizen (A) in staat zijn om te overleven en de muis gonadotrofinen reageren. Als gevolg, testis tissue ondergaat volledige ontwikkeling, inclusief vorming van bevruchting bevoegde sperma (B). Zodra testis xenotransplantaten worden verzameld (C)ze kunnen worden gebruikt voor analyse of om sperma (D) verkrijgen voor ICSI (E) en embryo productie (F). Bars gelijke 50 pm (B, E en F) of 10 micrometer (D). (Modified van Rodriguez-Sosa en Dobrinksi 2009 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Germ celtransplantatie
Germ celtransplantatie vormt het enige functionele assay voor ondubbelzinnige bevestiging van de aanwezigheid van spermatogoniale stamcellen (SSC's) in een cel populatie. Alleen SSC's kunnen naar huis aan en de SSC niche in de kelder membraan en koloniseren initiëren donor-afgeleide spermatogenese. Germ celtransplantatie maakte het mogelijk om te studeren en SSC's te manipuleren in een ongekende manier. De techniek is gebruikt om transgene dieren te produceren door middel van genetische manipulatie van SSC's 4, tot het patroon, de efficiëntie en de kinetiek van SSC kolonisatie 3,8 verduidelijken, om de signaalwegen die SSC zelfvernieuwing en differentiatie 9,10 reguleren te bestuderen; te karakteriseren oppervlakte markers op SSC's voor de identificatie van 22,23, op de niche-omgeving te bestuderen voor SSC's 6,7,24. Verder is wederzijdse transplantatie in dienst om te onderzoeken of een fenotype van infertility is ontstaan uit een defect in Sertoli cellen of in kiemcellen 25,26.
Voor transplantatie om efficiënt te werken, de keuze en behandeling van de ontvanger dieren is belangrijk. Ontvangers moeten genetisch ofwel worden aangepast aan donoren of immuun-onderdrukt. Ook ontvangers zouden tekort hebben aan endogeen spermatogenese: hetzij vanwege een mutatie als in W / W v muizen, of gesmolten onvruchtbaar als gevolg van kiemcellen depletie door bestralen of chemotherapeutische medicijnen zoals Busulfan. Bovendien is een goede voorbereiding van de donor celsuspensies en vaardigheid in het transplantatie procedure zijn belangrijk voor het succes van de techniek ook.
Germ celtransplantatie heeft zijn eigen beperkingen. Er is geen snelle lees-out voor de resultaten. De analyse van ontvanger testes moet ten minste twee maand wachten als herstel van volledige spermatogenese in de anders onvruchtbare ontvangers gebeurt twee maand na transplantatie 3. Het iis een kwalitatieve of semi-kwantitatieve test te wijten aan grote variaties in het aantal cellen ingespoten en de mate van de ontvanger kiemcel onderdrukking. Hoewel het concept van de kiemcel transplantatie is aangepast aan de andere diersoorten, de procedure zelf is technisch anders en iets meer uitdaging in niet-knaagdieren als gevolg van de anatomische verschillen tussen de soorten 11.
2. Testis weefsel xenografting
Testis weefsel xenografting werken over een groot aantal zoogdieren donor soorten en is een relatief eenvoudige techniek. Net als in andere vormen van transplantaties, hoe eerder na de collectie van het weefsel wordt getransplanteerd de grotere kans op succes. Daarom, bewaring en behandeling van het weefsel uit de collectie tot transplantatie is belangrijk. Echter, in onze ervaring testis weefsel geen speciale behandeling andere manier dan door de koelkast bewaard. Testis weefsel kan worden gehandhaafd op koelkasttemperatuur up tot 24 - 36 HR,en vervolgens fragmenten kunnen worden bereid voor transplantatie. Bovendien kan fragmenten van verse testis worden gehandhaafd standaard kweekmedium bij 4 ° C overnacht voorafgaande transplantatie zonder een merkbaar effect op de enten uitkomst 27. Testis weefsel kan ook worden ingevroren als opslag op lange termijn gewenst is. Studies uitgevoerd bij geiten 13, varken 13,27, en aap 28 hebben aangetoond dat invriezen en vervolgens ontdooien van testis weefsel niet significant van invloed op de mogelijkheden voor het ontwikkelen en sperma te produceren na een buitenbaarmoederlijke xenografting bij muizen. Succesvolle cryopreservering van testis weefsel kan worden bereikt door geautomatiseerde-bevriezing 28 of conventionele traag Snelkoelen in een alcohol bad 13,27, gebruikt DMSO als cryoprotectant in standaard weefselkweek medium bevattende FBS. Voor transplantatie, is gecryopreserveerde testis weefsel vervolgens ontdooid door standaard methoden en vervolgens gewassen in kweekmedium vóór de transplantatie 27. Zodra de tissue is getransplanteerd de ontvanger muis fungeert als een in-vivo-incubator en er geen grote ingrepen nodig zijn. Echter, in sommige gevallen suppletie met exogene gonadotrofinen kan nodig zijn; testis weefsel van 6-maanden oude resusapen vereist het injecteren van de ontvanger muizen subcutaan met 10 IU van hCG twee keer per week naar volledige spermatogenese te bereiken op 6-7 maand 29.
Zoals hierboven vermeld, wordt het beste resultaat verkregen wanneer weefsel uit pasgeboren mannetjes wordt gebruikt. Tissue van de mannetjes waarin postmeiotische geslachtscellen aanwezig zijn een neiging te degenereren. Echter, met onvolgroeide dieren volledige samenvatting van testis ontwikkeling is mogelijk en heeft tal van klinische en wetenschappelijke toepassingen. In een klinische setting, kan testis weefsel xenografting worden gebruikt voor de vruchtbaarheid behouden, met name in onvolwassen mannetjes waar sperma herstel is geen optie. Kleine stukjes in de vorm van biopten kunnen worden verzameld en ingevroren voor langdurige opslag. Bij het desvoor hot, kunnen de fragmenten worden ontdooid en geënt in muizen 27,28. Een ander alternatief is de cryopreservatie van het sperma dat wordt geoogst van xenotransplantaten. Micro-injectie met een snap-ingevroren sperma van varkens testis xenotransplantaten resulteerde in productie van morfologisch normale embryo's, zij het in een lager rendement in vergelijking met de testis, epididymis, of klaarkomen, sperma 27. Nadat weefsel heeft uitgewerkt, kan dit worden verzameld voor oogsten sperma en sperma kunnen worden gebruikt om embryo produceren in vitro 13,16,30. Een beperking van deze is echter het feit dat resulterende sperma niet epididymale rijping derhalve ondergaan en vereisen ICSI voor bevruchting. Daarom wordt gebruik van xenograft-afgeleide sperma voor bevruchting beperkt tot soorten waar ICSI is vastgesteld.
In het onderzoek, testis weefsel xenografting is een aantrekkelijk alternatief voor de testis ontwikkeling en spermatogenese van grote soorten in een knaagdier model te bestuderen. Bijvoorbeeld, eendonor testis kunnen worden getransplanteerd naar meerdere muizen. Ontvanger muizen kunnen vervolgens worden blootgesteld aan diverse behandelingen, en / of opgeofferd op verschillende tijdstippen voor xenograft collectie. Dit niet alleen elimineert donor effecten maar ook vermindert het aantal grote mannetjes vereist voor een bepaald experiment of studie. Dit is vooral belangrijk in grote dieren waar studies waarbij tal mannetjes logistiek moeilijk en duur, en mag ethische beperkingen, vooral in primaten. Zijn echter toepassingen van testis weefsel xenografting beperkt als manipulatie van specifieke celtypen vóór transplantatie is niet goed mogelijk en efficiëntie van spermatogenese is laag in bepaalde donor species 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Werk van de auteurs laboratorium werd ondersteund door USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213); NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) en Alberta innoveert - Health Solutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase (type IV) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053-028 | |
| Trypan blue stain | Invitrogen | 15250-061 | |
| Nylon mesh cell strainer | BD Biosciences | 352340 (40µm) 352350 (70µm) | |
| Busulfan | Sigma-Aldrich | B2635 | |
| Thin-Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-3 | |
| BD intramedic plyethylene tubing (PE100) | BD Biosciences | CA-63018-725 | |
| Ethicon 6-0 Silk Suture | Ethicon Inc. | 706G | |
| Wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P3667 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 |
References
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).
- Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).
- Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells. Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).
- Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis. Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).
- Nagano, M. C. Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice. Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).
- Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).
- Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).
- Dobrinski, I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).
- Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).
- Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Recent developments in testis tissue xenografting. Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).
- Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. Methods in Molecular Biology. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).
- Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts. Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).
- Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice. Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).
- Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts. Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).
- Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. Xenografting of adult mammalian testis tissue. Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).
- Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft. Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).
- Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).
- Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells. Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).
- Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).
- Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).
- Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege. Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).
- Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. Preservation and transplantation of porcine testis tissue. Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).
- Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).
- Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice. Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).
- Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice. Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).
