生殖细胞的移植和睾丸组织在小鼠异种移植

Summary

生殖细胞移植和睾丸组织异种移植的协议描述。在捐助源性受援国睾丸精子的生殖细胞移植的结果和鉴定精原干细胞（SSCS）为代表的功能重建法。睾丸组织异种移植在受体小鼠睾丸发育和精子各捐助国物种再现。

Abstract

生殖细胞移植是由拉尔夫Brinster博士和他的同事在美国宾夕法尼亚大学在1994年^1,2。这些开创性的研究表明，捐助衍生的精子和精子生产由收件人动物²到不孕受体小鼠的结果曲细精管生精细胞注射从肥沃的供体小鼠。的使用捐赠受援国动物携带细菌β-半乳糖苷酶基因，鉴定捐助衍生的精子和捐赠单体的传输后代男性。令人惊讶的是，进入曲细精管的管腔移植后，移植的生殖细胞能够从管腔车厢移动其中精原细胞位于基底膜。它被普遍接受，唯一的SSC能够殖民的利基，并在收件人睾丸重新建立精子。因此，生殖细胞移植提供了一个功能的方法来研究在睾丸干细胞小生境的特点推测的精原干细胞。到今天为止，生殖细胞移植用于澄清基本的干细胞生物学，生殖细胞的遗传操作，通过生产转基因动物移植^4,5之前，研究Sertoli细胞的生殖细胞相互作用^6,7，SSC的归巢和定植^{3， 8，}以及SSC的自我更新和分化^9,10。

¹¹大物种生殖细胞移植也是可行的。主要应用在这些保存生育能力，传播精英在动物种群遗传学，转基因动物精子和SSC生物学研究这一技术是后勤更加困难和昂贵的，比在啮齿类动物中的一代。从大型物种的生殖细胞移植到小鼠结果在colonizat曲细精管离子的供体细胞和精原干细胞扩张，但没有充分分化，大概是由于收件人的体细胞与生殖细胞系统发育遥远的物种¹²间不相容。另一种方法是从大型物种与周围的体车厢的生殖细胞的移植。我们首次报道于2002年，即从下背部皮肤移植免疫缺陷小鼠的不成熟男性睾丸组织的小碎片能够生存和接受的全面发展与生产的施肥主管精子^13。此后睾丸组织异种移植已被证明是成功在许多物种中，并作为一种有价值的替代研究小鼠¹⁴大型动物的睾丸发育和精子出现。

Protocol

A部分胚芽细胞移植在小鼠

1。受体小鼠的制备

1. 受助人应是免疫耐受（无论是捐助者或免疫缺陷的基因相匹配的）捐助睾丸细胞。
2. 收件人应当要么自然没有精子（ 如 W / ^宽 V小鼠）或内源性的生殖细胞耗尽。可以通过辐射或化疗药物，如马利兰生殖细胞耗竭。在这个协议中，我们描述的准备与马利兰受体小鼠的方法。
3. 对待受助人的年龄在4-6周，通过腹腔注射白消安。白消安的最佳剂量是应变依赖。在常用收件人株，剂量为40-50毫克/千克足以消耗内源性生殖细胞（如44毫克/千克裸鼠，50毫克/公斤为B6/129 F1的收件人）。
4. 溶解在二甲基亚砜马利兰粉，然后加入等量的无菌水净化O的终浓度为4毫克/毫升。保持溶液温在35-40℃前使用，以避免沉淀白消安。丢弃的解决方案，如果降水观察。
5. 马利兰治疗后，允许使用收件人之前至少一个月。受助人之间可以使用1个月和3个月后马利兰治疗。

2。显微注射移液器的制备

1. 选择外径1.0毫米，0.75毫米内径，长度为3英寸的高硼硅玻璃吸液管（毛细管）。
2. 硅化（siliconize）Sigmacote玻璃吸管，用甲醇冲洗移液器和吹干。
3. 用吸管拔拉移液器。不同的吸管拔机有不同的设置，因此，测试一些设置。一般来说，用于眼球摘除移液器类似的设置工作。
4. 打破解剖显微镜下的枪头前使用，以实现一个直径约为50微米尖端。

3。用于移植的供体细胞的制备

1. 供体菌的体例选择是依赖于实验研究的问题。如果精子量化为端点使用，使用一个容易辨认的遗传标记，如紫胶-Z的捐助者（如B6.129S7-GT（罗莎）26Sor“/ J从杰克逊实验室）或GFP（如C57BL/6-Tg（ CAG-EGFP）/ 1Osb从杰克逊实验室十）。
2. 准备在1毫克/毫升，4毫升的胰蛋白酶-EDTA（0.25％胰蛋白酶加1mM的EDTA），2毫升的DMEM的DNase在7毫克/毫升，7毫升培养液胶原酶。这一数额是2体小鼠睾丸消化。
3. 无菌条件下收集睾丸和去除白膜。传播的曲细精管细镊子轻轻以促进消化酶。
4. 传输管将胶原酶，在37°C孵育5-10分钟，并经常鼓动。
5. 洗管两次旋转（200-300克）为3分钟，重新悬浮在PBS W / O ^钙+
6. 重新挂起管在胰蛋白酶-EDTA和动摇，直到他们成为粘性和阴天。监测的37°C的，它应该出现1-2分钟内消化管。
7. 加入DNase和摇匀。孵育1-2分钟。
8. 胎牛血清加入3毫升，以阻止酶的作用。
9. 过滤细胞悬液，用40-70微米孔径的尼龙网，以消除细胞/组织块。
10. 600Ğ5分钟收集细胞重新悬浮细胞在培养液（100微升）少量。
11. 计数细胞和音量调整到理想的最终浓度（通常为100×10 ^6）。在冰上保持细胞悬液后才能使用。
12. 将充满每个马利兰治疗的小鼠睾丸细胞悬液只有10-15微升。由于潜在的浪费和泄漏，旨在有30-50％睾丸液。

4。移植过程（图1）

1. 麻醉受助人按照批准的协议。
2. 背地点斜卧和手术准备的腹部。使了〜1厘米中线腹部切口暴露腹壁。提起腹壁用在白线的小镊子，以避免意外受伤的腹部器官，进行了〜0.5厘米的切口，暴露腹腔，腹壁中线。
3. 使用一个虹膜钳举行腹壁，并使用另一个虹膜钳对搜索连接到附睾和睾丸在腹腔的脂肪垫。脂肪垫轻轻一拉，直到睾丸形象化和睾丸动脉和附睾都清晰可见。一个睾丸在工作时间。
4. 将薄的无菌悬垂性从蒸压指数卡下方的脂肪垫/睾丸更好的视觉识别（可选）。悬垂性也吸收液。
5. 添加一台盼蓝染料进入细胞悬液下降仔细到polyethy加载细胞悬液lene的油管连接到1毫升注射器。连接进油管拉移液器和移液器轻轻迫使细胞悬液，通过施加压力的注射器。
6. 确定传出管道（连接睾丸附睾），轻轻地取下导管周围的脂肪组织。管道和他们周围的膜是半透明的，工作认真。
7. 小心地插入导管传出管道包吸管，轻轻线程向睾丸数毫米。
8. 同时避免移动的注射针，注射器，达到轻轻压下注射器的柱塞，以确保暂停进入睾丸曲细精管流开始填写。
9. 注射率和细胞悬液流受拇指压力。避免突然增加的压力;监测肾小管悬挂在运动。
10. 停止注射时，几乎所有的表面管已填补前睾丸开始BEC青梅缺血。
11. 返回睾丸腹腔。对侧睾丸的重复过程。缝合用6-0丝线缝合腹壁，关闭与金属伤口剪辑的皮肤。监测小鼠变暖垫，直到完全恢复。

5。收件人睾丸的分析

1. 允许分析前2-4个月后移植。
2. 安乐死的收件人鼠标根据动物护理和使用准则，并收集至PBS的睾丸和附睾。当乳糖-Z的转基因供体菌已被使用，附睾可以用来作为阳性控制，因为它有内源性β-半乳糖苷酶的活性。
3. 为紫胶-Z的染色检测供体细胞，修复睾丸1-2小时，在4°C的4％多聚甲醛（PFA）的PBS中。冲洗3×30分钟，在室温中的lacZ冲洗缓冲区。
4. 在37℃孵育过夜LacZ染色解决方案。睾丸作为一个整体或分散后可染色肾小管。
5. 修复并存储在10％中性福尔马林。如果需要部分使用中性的快速反染色的红色。

B部分异位异种移植小鼠

（从Dobrinski和Rathi 2008 ^15，罗德里格斯·索萨等 2011 ^16）。

1。收集组织的捐助

1. 获得通过阉割睾丸组织活检从捐助者男性。
2. PBS或培养基中的活组织切片检查，保持无菌条件下的地方睾丸。
3. 保持实验室的冰和运输组织收集。

2。捐助组织的制备

1. 在组织文化引擎盖执行，以保持无菌。
2. 每个睾丸洗净，在冰冷的PBS含有抗生素转移到文化与PBS菜前的两到三倍。在活检的情况下，洗睾丸碎片的两到三倍，与冰冷的文化的Medi嗯含有抗生素，由纺纱在150克的2分钟，新鲜冰冷的培养基重新悬浮。
3. 对于完整的睾丸，消除沿表面切开鞘膜，挤出睾丸。从睾丸附件结构（精索，附睾，结缔组织）。成菜用PBS文化睾丸一次洗冷PBS和转让。
4. 用手术刀刀片和一把剪刀，小心地取出睾丸白膜。如果睾丸很小，挤压睾丸组织的外膜，而通过一个小切口一端与另一端的一个小镊子对控股的鞘膜，鞘膜可以被删除。
5. 根据睾丸的大小，无论是整个睾丸组织可以切成小块的大约1 - 2毫米大小用弯钳和手术刀刀片，或睾丸组织的大块可以首先从睾丸中删除，然后切细件。这一切应做在冰冷的培养基和无菌条件下，在一个小培养皿（60 X15毫米）。
6. 转让冰冰冷的小文化，美食培养基准备组织碎片，直到嫁接。

3。阉割的收件人鼠标

1. 麻醉鼠标如上，并准备通过修剪头发（没有必要在裸鼠），用70％乙醇和优碘溶液擦拭无菌医疗器械领域。
2. 使0.5 -1厘米腹正中皮肤切口，显露腹壁。
3. 仔细地暴露睾丸和附睾睾丸动脉在4.2-4.3 A部，所述。
4. 尾引带epidydimis，钝性分离。
5. 结扎睾丸动脉和输精管连同血管与丝绸，部分切割之间的睾丸和结扎，结扎结构。
6. 重复塞科议事第二睾丸。
7. 与一个或​​两个手术针缝合腹壁。
8. 关闭一个或两个米歇尔剪辑的皮肤切口。

4。异位异种移植

1. 鼠标放置在腹卧，并准备在其上面的回无菌医疗器械领域。
2. 根据移植是多少要插入（一般4-8/mouse），使鼠标背面的中线两侧约0.5厘米长的皮肤切口。
3. 使用镊子，以保持皮肤切口的边界，使皮下腔外的结缔组织，用剪刀戏弄。
4. 使用虹膜钳地方的一块睾丸组织深入到皮下腔，持有边境的皮肤切口与另一虹膜钳。
5. 关闭一个米歇尔剪辑的皮肤切口，并保持在加热垫的鼠标，直到它开始从麻醉中恢复。
6. 额外的绝缘和合作，将鼠标笼子VER和小鼠显示器直到完全康复。

5。收集，分析和精子收获睾丸移植瘤

1. 安乐死的主机鼠标，根据动物护理和使用指南，并从尾部至颈部皮肤和开放的背面皮肤作正中皮肤切口。这暴露了它可以位于皮下组织或附着在皮肤移植。
2. 小心取出移植，使用一对钳子和一把剪刀。
3. 移植康复，个别移植的大小和重量的记录数。
4. 检索从腹部鼠标的精囊，并记录自己的体重，睾酮生产的指示，通过嫁接的组织。
5. 组织学分析
   1. 暂停到卷中的样品中含有的Bouin的解决方案（或其他固定液）的小瓶的裸鼠~~移植的10倍，，标签小瓶适当的。
   2. 孵化在70％乙醇洗涤，最好在24小时的间隔至少3次冰箱过夜。
   3. 进行处理和石蜡包埋。
6. 精子的收获
   1. 洗纺纱他们在300克1分钟，重新悬浮在培养基中含有抗生素，他们的异种移植。
   2. 切成小块，移植和百果精心组织文化包含3菜钳 - 5毫升培养基。
   3. 通过40微米的细胞过滤器的过滤器的碎组织。

C部分代表性成果

1。生殖细胞移植

如果移植的供体细胞悬浮液含有精原​​干细胞携带的LacZ基因的捐助者在接受睾丸精原干定植，如遗传标记，可以通过X-gal染色观察独特的蓝色部分的SEMiniferous肾小管后2-3个月后移植^3（图2A）。一套行之有效的殖民地应该完全填充的段长的暗蓝色舒展，两端有两个或更多层的蓝色细胞向中间靠拢，相对较弱的染色地区单个，成对或小团体的蓝色细胞网络很明显^（图2B）。一个深蓝色的曲细精管区的横截面应揭示以及建立和有组织的精子与蓝色的生殖细胞在不同分化阶段（图2C）。

2。睾丸组织异种移植

睾丸组织移植后的生存能力呈负相关与捐赠人的发展阶段;从新生男婴的组织使用时，得到最好的结果，而成年组织的退化和死亡^17-21显示了较高的倾向。一般来说，移植成功降低捐助组织经历我福特iosis的精子发生的第一次浪潮。时间不成熟的捐助组织和完整的精子的全面发展是种属特异性，往往有些原位睾丸比较短。根据物种的完整的精子的曲细精管的数量是可变的。虽然在绵羊，山羊和猪的数量大于50％，牛，猫，它是小于^15％14（图3）。

图1。生殖细胞移植手术。广场受助人在麻醉后，背卧，并作出了〜0.4英寸中线腹部切口（一）。公开撤回脂肪垫附睾和睾丸的睾丸和更好的视觉识别（二）脂肪垫/睾丸下方放置一个薄的无菌悬垂。定位，使埋在脂肪垫传出管道可辨（的C，D，E），睾丸和附睾。 ID实体传出管道，轻轻地清除管道周围的脂肪组织。一张彩纸或塑料，可以放在下面更好的可视化（G）的管道。打破或磨枪头，根据管道和负载细胞悬液，将移液器（高）的大小。小心地插入导管传出管道束的吸管，轻轻地向睾丸（H中的箭头显示的吸管注射液和线程的方向）线程数毫米。睾丸曲细精管与成功注入（一）所示。 TS：睾丸; EP：附睾。

图2。生殖细胞移植 ）注射用X-gal的染色睾丸有代表性的成果 。曲细精管的蓝色部分代表从转基因捐助的SSC（LacZ基因的转基因）建立殖民地。 b）高倍在移植后3个月的SSC殖民地。日Ë深蓝色区域中心代表完整的精子在两端和淡蓝色区域代表日益扩展殖民地。 C）深蓝色的曲细精管组织切片（移植后3个月），显示了良好的组织的精子。在B和C的比例尺为200微米和30微米，分别。 （图每年牧师细胞开发生物学改编自2008年24:263-86和生物学复制业1999年六月60（6）:1429-36）。

图3。异位异种移植到免疫缺陷小鼠的大型动物的睾丸组织发育不成熟，不成熟的捐助睾丸片段（约1毫米^3）移植免疫缺陷小鼠背部皮肤（一）下都能够生存和响应鼠标促性腺激素。作为一个结果，睾丸组织经历了完整的开发，包括施肥主管（二）精子的形成。一旦睾丸移植瘤收集（三）它们可用于分析或获得精子受精（E）和胚胎生产（六）（四）。酒吧等于50微米（B，E和F）的10微米（四）。 （罗德里格斯索萨和Dobrinksi的2009 ^14个从修改）。

Discussion

1。生殖细胞移植

生殖细胞移植提供了明确确认的精原干细胞存在于细胞的人口（SSCS）的唯一功能检测。只有共享服务中心可以回家和拓殖在基底膜SSC的利基，并发起捐助源性精子。生殖细胞移植使人们有可能以前所未有的方式SSC的研究和操纵。该技术已用于生产转基因动物通过SSCS ^4的基因操纵澄清定植^3,8南南合作的模式，效率和动力学研究信号通路调节SSC的自我更新和分化^9,10表征其识别^22,23 SSC的表面标志;研究SSCS ^6,7,24利基环境。此外，互惠移植已调查是否有不孕症型Ÿ源于Sertoli细胞中的缺陷或生殖细胞^25,26。

为移植工作效率，受援国动物的选择和治疗具有重要意义。收件人应当向捐助者或免疫抑制基因匹配。受助人也缺乏内源性的精子：要么由于在瓦/ ^宽 V小鼠突变，或作为放疗或化疗药物，如马利兰生殖细胞耗竭呈现不孕。此外，做好准备的供体细胞悬液移植过程中的能力，以及该技术的成功是重要的。

生殖细胞移植有其自身的局限性。有没有结果的快速读出。受援国睾丸的分析，需要等待至少2个月的重建完整的精子，否则不孕的收件人发生移植后2个月。它，我定性或半定量分析，由于细胞数量的注入和受援国生殖细胞抑制程度大的变化。虽然已被改编到其他动物物种的生殖细胞移植的概念，过程本身在技术上是不同的和非啮齿类动物中较为具有挑战性的，作为一个¹¹跨物种的解剖差异的结果。

2。睾丸组织异种移植

睾丸组织异种移植在许多种哺乳动物捐助的作品，是一个相对简单的技术。至于其他类型的移植，越早收集后组织移植成功的机会更大。因此，保存和处理，从收集到移植组织是重要的。然而，在我们的经验，睾丸组织不需要其他特殊处理，比冷藏保存。睾丸组织可以在冰箱内温度保持24 - 36小时，然后碎片可以准备移植。此外，新鲜的睾丸碎片可以维持在4°C过夜之前移植没有明显的效果对接枝结果²⁷标准培养基中。睾丸组织也可以冷冻保存，如果需要长期储存。在^13，13,27猪，山羊和猴子²⁸进行的研究显示，冻结和睾丸组织随后解冻不影响其能力，以开发和生产后异位异种移植小鼠的精子。成功的超低温保存的睾丸组织，可以实现自动冻结²⁸或酒精浴^13,27在标准组织培养的培养基中含有胎牛血清的冷冻保护剂DMSO，在传统的慢速冷冻。冷冻的睾丸组织移植，然后解冻的标准方法，并随后在文化移植前^27的培养基洗净。一旦TIS苏已移植受体小鼠在体内孵化，并没有重大的干预需要服务。然而，在某些情况下，补充外源性促性腺激素可能需要;睾丸组织从6个月大的恒河猴需要注入受体小鼠皮下注射10 IU hCG的每周两次，以达到完整的精子在6-7个月²⁹只猴子。

如上所述，获得最好的结果是，新生儿男性的组织时使用。从男性中，其中postmeiotic生殖细胞存在的组织，显示出退化的趋势。然而，未成熟动物的睾丸发育完整的概括是可能的，并有大量的临床和研究中的应用。在临床上，睾丸组织异种移植可以用于保存生育能力，特别是在不成熟的男性在精子复苏是不是一种选择。小块活检的形式，可以收集和长期储存的冻结。当DESIRED的片段，可以解冻并移植到小鼠^27,28。另一种方法是从裸鼠收获的精子冷冻保存。单元从猪睾丸移植瘤的冷冻精子显微注射导致一代形态正常的胚胎，虽然在低效率比较，睾丸，附睾，或精液精子^27。组织已经开发后，它可以收集收获精子和精子可以被用来生产体外胚胎^13,16,30。然而，本限制是事实，导致精子不接受附睾成熟，因此需要为受精受精。因此，移植衍生的精子受精使用仅限于已成立受精的物种。

睾丸组织异种移植的研究，是一个有吸引力的替代研究啮齿动物模型中的睾丸发育和精子大型物种。例如，单一捐助睾丸，可以移植到多个小鼠。受体小鼠，然后可以接触到不同的治疗方法，和/或在异种收集不同时间点牺牲。这不仅消除了捐助者的影响，但也减少了一个特定的实验或研究需要大量的男性人数。这是特别重要的涉及众多男性的研究是后勤困难和昂贵的大型动物，并可以进行，尤其是在灵长类动物中的伦理限制，。然而，睾丸组织异种移植的应用是有限的操纵特定的细胞类型，移植前是不容易的，精子的生成效率低，在某些捐助物种^14。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase (type IV)	Sigma-Aldrich	C5138
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma-Aldrich	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Trypan blue stain	Invitrogen	15250-061
Nylon mesh cell strainer	BD Biosciences	352340 (40µm) 352350 (70µm)
Busulfan	Sigma-Aldrich	B2635
Thin-Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100)	BD Biosciences	CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture	Ethicon Inc.	706G
Wound clips	BD Biosciences	427631
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium Ferricyanide	Sigma-Aldrich	P3667
magnesium chloride	Sigma-Aldrich	208337
sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
N,N-Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	D4551
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896