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Biology

Transplantation des cellules germinales et de tissus testiculaire xénogreffe chez la souris

doi: 10.3791/3545 Published: February 6, 2012
* These authors contributed equally

Summary

Protocoles pour la transplantation de cellules germinales et xénogreffe de tissus testiculaires sont décrits. Les résultats des cellules germinales de transplantation dans les pays donateurs dérivé spermatogenèse dans les testicules bénéficiaires et représente un test fonctionnel pour la reconstitution d'identification des cellules souches des spermatogonies (SSC). Tissu testiculaire xénogreffe reproduit le développement des testicules et de la spermatogenèse des espèces des différents donateurs dans les souris receveuses.

Abstract

La transplantation des cellules germinales a été développé par le Dr Ralph Brinster et ses collègues de l'Université de Pennsylvanie en 1994 1,2. Ces études avant-gardistes ont montré que la micro-injection de cellules germinales des souris donneuses fertiles dans les tubules séminifères des souris receveuses infertiles résultats dans les pays donateurs dérivé spermatogenèse et la production de spermatozoïdes par l'animal 2 destinataire. L'utilisation de mâles donneurs transportant des l'identification gène bactérien β-galactosidase a permis de donneur-dérivée spermatogenèse et la transmission de l'haplotype des bailleurs de fonds à la descendance par 1 animaux receveurs. Étonnamment, après la transplantation dans la lumière des tubes séminifères, les cellules germinales transplantés ont pu se déplacer à partir du compartiment luminal de la membrane sous-sol où se trouvent les spermatogonies 3. Il est généralement admis que seuls les SSC sont capables de coloniser la niche et de rétablir la spermatogenèse dans les testicules bénéficiaires. Par conséquent les cellules germinales,la transplantation offre une approche fonctionnelle pour étudier la niche de cellules souches dans les testicules et de caractériser les cellules souches putatives spermatogonies. À ce jour, la transplantation de cellules germinales est utilisée pour élucider la biologie des cellules souches de base, pour produire des animaux transgéniques par manipulation génétique des cellules germinales avant la transplantation 4,5, pour étudier l'interaction cellules de Sertoli cellules germinales 6,7, SSC homing et de la colonisation 3, 8, ainsi que la SSC auto-renouvellement et la différenciation 9,10.

Une transplantation de cellules germinales est également possible dans les grandes espèces 11. Dans ces derniers, les principales applications sont la préservation de la fertilité, la diffusion de la génétique d'élite dans les populations animales, et la génération d'animaux transgéniques comme l'étude de la spermatogenèse et la biologie de la SSC avec cette technique est logistiquement plus difficile et plus coûteux que chez les rongeurs. La transplantation de cellules germinales à partir de grandes espèces dans les tubes séminifères des souris entraîne dans colonization de cellules du donneur et l'expansion des spermatogonies, mais pas dans leur différenciation complète sans doute en raison de l'incompatibilité du compartiment receveur de cellules somatiques avec des cellules germinales à partir de 12 espèces phylogénétiquement éloignées. Une approche alternative est la transplantation de cellules germinales à partir de grandes espèces avec leur compartiment somatique environnant. Nous avons d'abord rapporté en 2002, que de petits fragments de tissu testiculaire des mâles immatures transplantées sous la peau dorsale de souris immunodéficientes sont capables de survivre et connaître un développement complet de la production de sperme fertilisation compétente 13. Depuis lors, tissu testiculaire xénogreffe a été démontré que pour réussir dans de nombreuses espèces et a émergé comme une alternative intéressante à étudier le développement testiculaire et la spermatogenèse des animaux de grande taille chez la souris 14.

Protocol

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PARTIE A. transplantation de cellules germinales chez la souris

1. Préparation de la souris receveuses

  1. Les bénéficiaires devraient être immunologiquement tolérantes (soit génétiquement identiques à celles des donateurs ou des immuno-déficients) pour les cellules testiculaires des donateurs.
  2. Les bénéficiaires devraient être soit naturellement dépourvue de la spermatogenèse (par exemple W / W v souris) ou appauvri des cellules germinales endogènes. L'épuisement des cellules germinales peut être obtenue par irradiation ou médicaments chimiothérapeutiques tels que le busulfan. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de préparation de souris receveuses avec busulfan.
  3. Traiter les bénéficiaires à 4-6 semaine de l'âge grâce à l'injection ip de busulfan. La dose optimale de busulfan est la souche dépendante. Dans les souches de bénéficiaires couramment utilisés, une dose de 40-50 mg / kg est suffisante pour épuiser les cellules germinales endogènes (par exemple 44 mg / kg pour les souris nude, 50 mg / kg pour les bénéficiaires B6/129 F1).
  4. Dissoudre la poudre dans le DMSO busulfan puis ajoutez un volume égal d'eau distillée stérile to faire une concentration finale de 4 mg / ml. Conserver la solution chaude à 35-40 ° C avant utilisation pour éviter la précipitation du busulfan. Jeter la solution si on observe une précipitation.
  5. Après traitement par le busulfan, permettent au moins un mois avant d'utiliser les bénéficiaires. Les destinataires peuvent être utilisés entre 1 mois et 3 mois post-traitement busulfan.

2. Préparation de pipettes microinjection

  1. Choisissez pipettes en verre borosilicate (tubes capillaires) avec un diamètre de 1,0 mm extérieure, une 0,75 mm de diamètre intérieure, et une longueur de 3 pouces.
  2. Siliconize pipettes en verre avec Sigmacote, rincer les pipettes avec du méthanol et sécher.
  3. Tirez sur les pipettes en utilisant un extracteur de pipette. Différentes machines extracteur pipettes ont des réglages différents, donc, de tester quelques réglages. En règle générale, un cadre similaire à celui utilisé pour la fabrication de pipettes énucléation peuvent travailler.
  4. Cassez les pointes de pipette sous le microscope de dissection avant de l'utiliser pour atteindre un diamètre d'environ 50 pmà la pointe.

3. Préparation de cellules du donneur pour une transplantation

  1. Choise de souche donneuse est tributaire de la question expérimental étudié. Si la quantification de la spermatogenèse est utilisé comme critère d'évaluation, l'utilisation de bailleurs de fonds avec un marqueur facilement identifiable génétique comme Lac-Z (par exemple B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J auprès de Jackson Laboratory) ou GFP (par exemple C57BL/6-Tg ( ACG-EGFP) 1Osb / J auprès de Jackson Laboratory).
  2. Préparer 7 ml de collagénase dans du DMEM à 1 ml mg / ml, 4 ml de trypsine-EDTA (0,25% plus la trypsine EDTA 1 mM), et 2 de DNase dans du DMEM à 7 mg / ml. Ce montant est à la digestion des 2 testicules de souris donateurs.
  3. Recueillir les testicules de façon aseptique et enlever la tunique albuginée. Étendre tubes séminifères doucement avec des pinces fines pour faciliter la digestion enzymatique.
  4. Tubules de transfert dans la collagénase, incuber à 37 ° C pendant 5-10 min, et agiter fréquemment.
  5. Laver deux fois par la filature tubules (200-300 g pendant 3 min) et re-mise en suspension dans du PBS w / o Ca 2 + +
  6. Re-suspendre tubules dans la trypsine-EDTA et agiter jusqu'à ce qu'ils deviennent collantes et nuageux. Surveiller la digestion des tubules à 37 ° C, car elle devrait se produire au sein de 1-2 min.
  7. Ajouter DNase et bien agiter. Incuber pendant 1-2 min.
  8. Ajouter 3 ml de FBS pour arrêter l'action des enzymes.
  9. Suspension cellulaire filtre en utilisant un filet de nylon avec la taille des pores 40-70 um pour éliminer les cellules / tissus morceaux.
  10. Recueillir les cellules à 600 g pendant 5 min et remettre en suspension les cellules dans une petite quantité de DMEM (<100 pi).
  11. Compter les cellules et ajuster le volume à une concentration finale désirée (habituellement 100 x 10 6). Conserver la suspension cellulaire sur la glace avant de les utiliser.
  12. Chaque testicule de souris traitées par le busulfan sera rempli avec seulement 10-15 pi de suspension cellulaire. En raison de déchets potentiels et les fuites, visent à avoir 30-50 pi par les testicules.

4. Procédure de transplantation (Figure 1)

  1. Anesthésiez bénéficiaires suivant des protocoles approuvés.
  2. Placer dans dorsaledécubitus et chirurgicalement préparer la zone abdominale. Faire un ~ 1cm ligne médiane incision abdominale pour exposer la paroi abdominale. Soulevez la paroi abdominale à l'aide de petites pinces sur le point de la ligne blanche pour éviter de blesser les organes abdominaux, et de procéder à une incision ~ 0,5 cm sur la ligne médiane de la paroi abdominale pour exposer la cavité péritonéale.
  3. Utilisez un pince iris pour maintenir la paroi abdominale, et d'utiliser une autre paire de pince à iris pour rechercher les coussinets adipeux attachées à l'épididyme et les testicules dans la cavité péritonéale. Tirez doucement sur le coussinet adipeux jusqu'à ce que le testicule est extériorisé et l'artère testiculaire et de l'épididyme sont clairement visibles. Les travaux sur un testicule à la fois.
  4. Placez un drap mince stérile fabriqué à partir de fiches autoclave sous le coussinet adipeux / testicules pour une identification visuelle de mieux (en option). Le drapé travaille également à absorber de fluide.
  5. Ajouter une goutte de colorant bleu trypan dans la suspension cellulaire et soigneuse au chargement de la suspension cellulaire dans le polyéthytubulure lène connecté à une seringue de 1 ml. Fixez la pipette tiré dans la tubulure et lentement forcer la suspension de cellules dans la pipette en appliquant une pression à la seringue.
  6. Identifier les canaux efférents (qui relient les testicules à l'épididyme) et retirez délicatement le tissu adipeux autour des conduits. Travailler avec soin que les conduits et la membrane qui les entourent sont translucides.
  7. Insérez soigneusement la pipette dans un conduit dans le faisceau de canaux efférents, doucement enfiler quelques mm vers le testicule.
  8. Tout en évitant déplaçant la pipette d'injection, atteindre pour la seringue, doucement appuyez sur le piston de la seringue afin de s'assurer que la suspension se jette dans le rete testis et de tubes séminifères commencent à se remplir.
  9. Le débit d'injection et le débit de la suspension cellulaire est régulée par la pression du pouce. Évitez augmentation soudaine de la pression, de surveiller le mouvement de la suspension dans les tubules.
  10. Arrêtez l'injection lorsque presque tous les tubes de surface ont été remplis avant le testicule commence à becenez ischémique.
  11. Retour du testicule à la cavité abdominale. Répéter la procédure sur le testicule controlatéral. Suturer la paroi abdominale avec suture de soie 6-0 et fermer la peau avec des pinces métalliques plaies. Surveiller souris sur un coussin chauffant jusqu'à la guérison complète.

5. L'analyse des testicules bénéficiaires

  1. Laisser 2-4 mois après la transplantation avant l'analyse.
  2. Euthanasier la souris bénéficiaire selon les soins aux animaux et les lignes directrices d'utilisation et de recueillir le testicule et l'épididyme dans le PBS. Quand une souche Lac-Z donateurs transgénique a été utilisé, l'épididyme peut être utilisé comme un contrôle coloration positive car elle a endogène bêta-galactosidase.
  3. Pour la détection de cellules du donneur par Lac-Z coloration, fixer le testicule pendant 1-2 heures à 4 ° C dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS. Rincer 3 x 30 min à température ambiante dans lacZ tampon de rinçage.
  4. Incuber une nuit à 37 ° C dans une solution de coloration lacZ. Testicules peut être teinté dans son ensemble ou après la dispersionles tubules.
  5. Fixez et gardez dans 10% du formol tamponné neutre. Si des sections est nécessaire, utiliser le rouge neutre vite que la contre-coloration.

PARTIE B. ectopique xénogreffe chez la souris

(De Dobrinski et Rathi 2008 15, et Rodriguez-Sosa et al. 2011 16).

1. Collection de tissus de donneurs

  1. Obtenir tissu testiculaire par la castration ou la biopsie d'un mâle donneur.
  2. Place du testicule dans du PBS ou des biopsies dans un milieu de culture, le maintien des conditions stériles.
  3. Gardez le tissu prélevé sur la glace et le transport au laboratoire.

2. Préparation de tissu du donneur

  1. D'assumer dans le hotte culture de tissus pour maintenir la stérilité.
  2. Laver chaque testicule dans les antibiotiques PBS glacées contenant deux à trois fois avant le transfert dans une culture-plat avec du PBS. Dans le cas de biopsies, se laver les fragments de testicules de deux à trois fois avec de la glace froide medi la cultureum contenant des antibiotiques par centrifugation à 150g pendant 2 min et remise en suspension dans un milieu de culture frais glacée.
  3. Pour testicules intacts, retirez tunique vaginale en faisant une incision le long de la surface et extruder les testicules. Retirer du testicule toutes les structures annexes (cordon spermatique, l'épididyme, du tissu conjonctif). Laver les testicules fois dans du PBS froid et le transfert dans une culture-plat avec du PBS.
  4. Retirez délicatement la tunique albuginée du testicule à l'aide d'un scalpel et une paire de ciseaux. Si le testicule est très petite, la tunique peut être éliminé par serrant le tissu testiculaire étoiles sur la tunique par une petite incision faite sur une extrémité tout en tenant la tunique avec une paire de forceps petites sur l'autre extrémité.
  5. En fonction de la taille de la testicule ou l'autre le tissu testicule son ensemble peut être coupé en petits morceaux de autour de 1 - 2 mm 3 dans la taille en utilisant une pince incurvées et d'une lame de scalpel, ou des morceaux de grandes de tissu testiculaire peut d'abord être retiré de la testicule et puis coupé en petitspièces. Tout cela doit être fait en milieu de culture glacée et dans des conditions stériles dans une boîte de culture petite (60 x15 mm).
  6. Transfert des fragments de tissus préparés au milieu de culture glacée dans de petits plats de la culture des sur la glace jusqu'à la greffe.

3. La castration du destinataire de la souris

  1. Anesthésiez la souris comme ci-dessus et de préparer champ opératoire stérile par clipsage les cheveux (pas nécessaire chez la souris nude), en essuyant avec de l'éthanol 70% et une solution de Betadine.
  2. Faire une incision de 0,5 à 1 cm ventral cutanée médiane pour exposer la paroi abdominale.
  3. Dégager prudemment le testicule, l'artère testiculaire et de l'épididyme, comme décrit dans Partie A, 4.2 à 4.3.
  4. Détacher la queue de l'épididyme de les le gubernaculum par dissection.
  5. Ligaturer l'artère testiculaire, et les canaux déférents avec le vaisseau sanguin avec de la soie, et la section des structures ligaturés en coupant entre les testicules et la ligature.
  6. Répétez la procédure pour le secotesticule nd.
  7. Suturer la paroi abdominale avec un ou deux points de suture chirurgicaux.
  8. Fermer l'incision cutanée avec des clips de Michel un ou deux.

4. Ectopique xénogreffe

  1. Placez la souris en décubitus ventral et préparer un champ opératoire stérile sur son dos comme ci-dessus.
  2. Selon le nombre de greffons sont à être inséré (généralement 4-8/mouse), faire des ~ 0,5 cm incisions cutanées de longues sur chaque côté de la ligne mi de l'arrière de la souris.
  3. Utilisez une pince pour maintenir une frontière de l'incision de la peau, et de faire une cavité sous-cutanée par décomposant le tissu conjonctif à l'aide de ciseaux.
  4. Utilisation de une lieu l'iris pince un morceau de tissu testiculaire profondément dans la cavité sous-cutanée, de maintien de la frontière de l'incision de la peau avec un autre pince l'iris.
  5. Fermer l'incision cutanée avec un clip de Michel et de garder la souris sur un coussin chauffant jusqu'à ce qu'il commence à se remettre de l'anesthésie.
  6. Transfert de la souris dans une cage avec une isolation supplémentaire et cover et moniteur jusqu'à ce que les souris sont entièrement recouvrés.

5. Collection de xénogreffes testicules pour l'analyse et la récolte de sperme

  1. Euthanasier la souris hôte selon les soins aux animaux et les lignes directrices d'utilisation, et faire une incision cutanée médiane sur la peau du dos allant de la queue au cou et de la peau ouverte. Cette situation expose les greffes qui peuvent être situés soit sur le tissu sous-cutané ou attaché à la peau.
  2. Retirez délicatement les greffes utilisant une pince paire et une paire de ciseaux.
  3. Un nombre record de greffes récupéré, la taille et le poids des greffes individuels.
  4. Récupérer les vésicules séminales de l'abdomen de la souris et enregistrer leur poids comme une indication de la production de testostérone par le tissu greffé.
  5. Pour une analyse histologique
    1. Suspendre xénogreffes dans le flacon d'échantillon contenant une solution de Bouin (ou un autre fixateur) dans un volume ~ de 10x celle de la xénogreffe, et le flacon étiquette appropriée.
    2. Incuberpendant une nuit dans le réfrigérateur suivie d'un lavage au moins 3 fois dans de l'éthanol 70% à des intervalles de 24 heures de préférence.
    3. Procéder pour le traitement et l'incorporation dans la paraffine.
  6. Pour la récolte de sperme
    1. Laver xénogreffes en les faisant tourner vers le bas à 300g pendant 1 min et les remettre en suspension dans du milieu de culture contenant des antibiotiques.
    2. Couper en petits morceaux greffes et émincer soigneusement avec des forceps dans une boîte de culture de tissu contenant de 3 à 5 ml de milieu de culture.
    3. Filtre tissu haché à travers le tamis 40 um cellule.

Résultats partie représentative C.

1. La transplantation des cellules germinales

Si la suspension des bailleurs de fonds transplanté des cellules contient des cellules souches des spermatogonies portant un marqueur génétique comme le transgène LacZ, la colonisation de la SSC donateurs dans les testicules bénéficiaires peuvent être visualisés par coloration X-gal comme distinctifs segments bleus de la seminiferous tubules après 2-3 mois post-transplantation 3 (figure 2A). Une colonie bien établie devrait avoir une longue étendue de segments bleu foncé complètement remplis avec deux ou plusieurs couches de cellules bleues près du centre et les régions colorées relativement plus faibles aux deux extrémités, où un réseau de simple, jumelé ou en petits groupes de cellules bleues est évident 3 (figure 2B). Une section transversale de la région bleu foncé tube séminifère devrait révéler bien établie et bien organisée spermatogenèse avec les cellules germinales bleus à divers stades de différenciation (figure 2C).

2. Tissu testiculaire xénogreffe

La viabilité de tissu testiculaire après la transplantation est inversement corrélée avec le stade de développement du donneur; le meilleur résultat est obtenu lorsque le tissu de nouveau-nés mâles est utilisée, tandis que les tissus des adultes montre une forte tendance à dégénérer et mourir 17-21. En règle générale, le succès diminue à mesure que xénogreffe tissu du donneur subit moiiosis de la première vague de la spermatogenèse. Temps à l'épanouissement de tissu du donneur immature et la spermatogenèse complète est spécifique à l'espèce, et souvent un peu plus courte en comparaison avec les testicules in situ. Le nombre de tubes séminifères avec spermatogenèse complète est variable selon les espèces. Alors que chez les ovins, les caprins et les porcs que Numéro de la est supérieure à 50%, chez les bovins et les chats elle est inférieure à 15% 14 (Figure 3).

Figure 1
Figure 1. Procédure de transplantation des cellules germinales. Place bénéficiaires en décubitus dorsal après l'anesthésie et faire un ~ 0,4 pouces incision abdominale médiane (A). Exposer testicule en retirant le coussinet adipeux attaché à l'épididyme et des testicules et de placer un drap mince stérile sous le coussinet adipeux / testicules pour une identification visuelle de mieux (B). Placez le testicule et l'épididyme de sorte que les canaux efférents enterrés dans le coussinet adipeux sont perceptibles (C, D, E). Identité dont les canaux efférents et retirez délicatement le tissu adipeux autour des conduits. Un morceau de papier de couleur ou de matière plastique peut être placé au-dessous des conduits pour une meilleure visualisation (G). Break ou de meuler le la pointe de pipette selon l'une la taille de les conduits et la suspension cellule de pesage dans la pipette (H). Insérez soigneusement la pipette dans un conduit dans le faisceau de canaux efférents, doucement enfiler quelques mm vers le testicule (la flèche en H indique la direction de la pipette d'injection et le filetage). Un testicule avec injection réussie dans les tubules séminifères est montré (I). Ts: Testicule; Ep: l'épididyme.

Figure 2
Figure 2. Les résultats représentatifs pour la transplantation de cellules germinales A) Un testicule injectés colorées avec X-gal. Les segments bleus des tubes séminifères représentent les colonies établies à partir de SSC donateurs transgéniques (LacZ transgène). B) Plus fort grossissement d'une colonie de la SSC à 3 mois post-transplantation. The région bleu foncé au centre, représente la spermatogenèse complète et les régions bleu pâle aux extrémités représentent l'extension croissante de la colonie. C) Une coupe histologique du tube bleu foncé séminifères (3 mois post-transplantation) montre la spermatogenèse bien organisé. Barres d'échelle dans B et C sont de 200 um et 30 um, respectivement. (Les chiffres adaptés à partir de cellules Annu Rev Dev Biol 2008;. 24:263-86 et Biol Reprod 1999 Jun;. 60 (6) :1429-36).

Figure 3
Figure 3. Ectopique xénogreffe de tissu testiculaire immature de gros animaux dans des souris immunodéficientes. Fragments de testicules immatures donateurs (~ 1 mm 3) transplantés sous la peau dorsale de souris immunodéficientes (A) sont capables de survivre et de répondre aux gonadotrophines souris. En conséquence, tissu testiculaire subit de développement complet, y compris la formation du sperme fertilisation compétente (B). Une fois xénogreffes testicules sont collectées (C)ils peuvent être utilisés pour l'analyse ou d'obtenir du sperme (D) pour l'ICSI (E) et de production des embryons (F). Bars égales 50 um (B, E et F) ou 10 uM (D). (Mise à jour de Rodriguez-Sosa et Dobrinksi 2009 14).

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Discussion

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1. La transplantation des cellules germinales

La transplantation des cellules germinales fournit le test ne fonctionne que pour la confirmation sans équivoque de la présence de cellules souches des spermatogonies (SSC) dans une population cellulaire. SSC Seuls peuvent abrite et de coloniser la niche de la SSC à la membrane basale et d'initier des donateurs dérivé spermatogenèse. Germe de la transplantation de cellules ont permis d'étudier et de manipuler des SSC d'une manière sans précédent. La technique a été utilisée pour produire des animaux transgéniques par manipulation génétique des SSC 4; d'élucider la structure, l'efficacité et la cinétique de la colonisation de la SSC 3,8; pour étudier les voies de signalisation qui régulent la SSC auto-renouvellement et la différenciation 9,10; pour caractériser marqueurs de surface sur les SSC pour leur identification; 22,23 pour étudier l'environnement de niche pour SSC 6,7,24. En outre, la transplantation réciproque a été employée pour déterminer si un phénotype de infertility est issue d'un défaut dans les cellules de Sertoli ou cellules germinales 25,26.

Pour la transplantation de travailler efficacement, le choix et le traitement des animaux receveurs est important. Les bénéficiaires devraient être soit génétiquement identiques à celles des donateurs ou immunodéprimé. Les bénéficiaires devraient également manquer la spermatogenèse endogène: soit due à une mutation chez la souris que v W / W, ou rendus stériles à la suite de l'épuisement des cellules germinales par irradiation ou médicaments chimiothérapeutiques tels que le busulfan. En outre, une bonne préparation des suspensions cellulaires donateurs et de compétence dans la procédure de transplantation sont importants pour le succès de la technique ainsi.

La transplantation des cellules germinales a ses propres limites. Il n'ya pas de rapide lecture des résultats. L'analyse des testicules bénéficiaires doit attendre au moins deux mois à compter rétablissement de la spermatogenèse complète chez les receveurs qui autrement seraient stériles arrive deux mois après la transplantation 3. Il idosage SA qualitative ou semi-quantitative en raison de grandes variations dans le nombre de cellules injectées et le degré de suppression de cellules germinales destinataire. Bien que le concept de la transplantation de cellules germinales a été adapté à d'autres espèces animales, la procédure elle-même est techniquement différent et un peu plus difficile en non-rongeurs à la suite des différences anatomiques entre les espèces 11.

2. Tissu testiculaire xénogreffe

Tissu testiculaire xénogreffe œuvres à travers de nombreuses espèces de mammifères et des donateurs est une technique relativement simple. Comme dans d'autres types de transplantations, la collection plus tôt après que le tissu est transplanté le plus de chance de succès. Par conséquent, la préservation et la manipulation des tissus de la collection à la transplantation est important. Cependant, dans notre tissu testiculaire expérience ne nécessite pas de manipulation spéciales autres que d'être conservé au réfrigérateur. Tissu testiculaire peut être maintenue à la température du réfrigérateur jusqu'à 24 à 36 h,puis des fragments peuvent être préparés pour la transplantation. En outre, des fragments de testicule frais peuvent être maintenues dans un milieu de culture standard à 4 ° C avant la transplantation du jour au lendemain sans effet notable sur le résultat de greffage 27. Tissu testiculaire peut également être cryoconservés si stockage à long terme est souhaitée. Des études effectuées chez la chèvre 13, cochon 13,27, et le singe 28 ont montré que la congélation et la décongélation ultérieure du tissu testiculaire n'affecte pas de manière significative sa capacité à développer et à produire des spermatozoïdes après ectopique xénogreffe chez la souris. Cryoconservation réussie de tissu testiculaire peut être atteint par automatisé-congélation 28 ou conventionnelle lente-congélation dans un bain de 13,27 l'alcool, en utilisant du DMSO comme cryoprotecteur dans du milieu de la culture tissulaire standard contenant de FBS. Pour la transplantation, cryoconservé tissu testiculaire est ensuite décongelé par des méthodes standard et ensuite lavé en milieu de culture avant la transplantation 27. Une fois le tisSue a été transplanté de la souris destinataire sert d'incubateur et in vivo sans interventions majeures sont nécessaires. Toutefois, dans certains cas, la supplémentation avec des gonadotrophines exogènes peut être nécessaire; tissu testiculaire de 6-month-old singes rhésus nécessaire injection sous-cutanée souris receveuses avec 10 UI de hCG deux fois par semaine pour atteindre la spermatogenèse complète à 6-7 mois 29.

Comme mentionné ci-dessus, le meilleur résultat est obtenu lorsque le tissu de nouveau-nés mâles est utilisée. Le tissu de mâles dans lequel les cellules germinales postméiotique sont présents montre une tendance à dégénérer. Cependant, avec les animaux immatures récapitulation complète de développement des testicules est possible et a de nombreuses applications cliniques et de recherche. Dans un contexte clinique, tissu testiculaire xénogreffe peut être utilisé pour préservation de la fertilité, en particulier chez les mâles immatures dans lequel la récupération du sperme n'est pas une option. De petits morceaux sous la forme de biopsies peuvent être prélevés et congelés pour stockage à long terme. Lorsque desIRED, les fragments peuvent être décongelés et greffés sur des souris 27,28. Une autre alternative est la cryoconservation du sperme qui est récolté à partir de xénogreffes. Microinjection avec le composant logiciel enfichable congelé le sperme de xénogreffes de porc a entraîné des testicules dans la production d'embryons morphologiquement normaux, mais à un rendement plus faible en comparaison des testicules, épididyme, ou sperme éjaculé 27. Après des tissus a développé, elle peut être recueillie pour la récolte du sperme et le sperme peut être utilisé pour produire des embryons in vitro 13,16,30. Une limitation de cela, cependant, est le fait que le sperme résultant ne subissent pas de maturation épididymaire et nécessitent donc l'ICSI pour la fertilisation. Par conséquent, l'utilisation de la xénogreffe dérivé du sperme pour la fécondation est limitée à des espèces où l'ICSI a été mis en place.

Dans la recherche, tissu testiculaire xénogreffe est une alternative intéressante pour étudier le développement testiculaire et la spermatogenèse des grandes espèces dans un modèle de rongeur. Par exemple, untesticule seul donneur peut être transplanté à des souris multiples. Souris destinataire peut alors être exposé à des traitements différents, et / ou sacrifiés à des moments différents pour la collecte de xénogreffe. Il ne s'agit pas seulement d'éliminer les effets des donateurs, mais aussi de réduire le nombre d'hommes importants qui sont requis pour une expérience particulière ou d'étude. Ceci est particulièrement important chez les gros animaux, où de nombreuses études sur les hommes sont logistiquement difficile et coûteux, et peut effectuer des limites éthiques, en particulier chez les primates. Toutefois, les demandes de xénogreffe de tissus testiculaires sont limitées, car la manipulation de types cellulaires spécifiques avant la transplantation n'est pas facilement possible et l'efficacité de la spermatogenèse est faible en espèces donneuses certains 14.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Travail du laboratoire auteurs a été pris en charge par l'USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213); NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) et de l'Alberta innove - Solutions en santé.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase (type IV) Sigma-Aldrich C5138
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
DNaseI Sigma-Aldrich DN25
DMEM Invitrogen 31053-028
Trypan blue stain Invitrogen 15250-061
Nylon mesh cell strainer BD Biosciences 352340 (40µm) 352350 (70µm)
Busulfan Sigma-Aldrich B2635
Thin-Wall Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100) BD Biosciences CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture Ethicon Inc. 706G
Wound clips BD Biosciences 427631
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2
X-gal Sigma-Aldrich B4252
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P3667
magnesium chloride Sigma-Aldrich 208337
sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896

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References

  1. Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (24), 11303-11303 (1994).
  2. Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (24), 11298-11298 (1994).
  3. Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biology of Reproduction. 60, (6), 1429-1429 (1999).
  4. Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (23), 13090-13090 (2001).
  5. Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells. Journal of Andrology. 28, (2), 353-353 (2007).
  6. Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, (11), 1164-1164 (2006).
  7. Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis. Biology of Reproduction. 84, (4), 639-639 (2011).
  8. Nagano, M. C. Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice. Biology of Reproduction. 69, (2), 701-701 (2003).
  9. Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (47), 16489-16489 (2004).
  10. Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (25), 9524-9524 (2006).
  11. Dobrinski, I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Animal Reproduction Science. 89, (1-4), 137-137 (2005).
  12. Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biology of Reproduction. 61, (5), 1331-1331 (1999).
  13. Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature. 418, (6899), 778-778 (2002).
  14. Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Recent developments in testis tissue xenografting. Reproduction. 138, (2), 187-187 (2009).
  15. Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. Methods in Molecular Biology. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).
  16. Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. Seli, E., Agarwal, A. Springer. New York, NY. 331-331 (2011).
  17. Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts. Reproduction. 130, (6), 923-923 (2005).
  18. Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice. Reproduction. 131, (6), 1091-1091 (2006).
  19. Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts. Reproduction, Fertility, and Development. 19, (7), 869-869 (2007).
  20. Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. Xenografting of adult mammalian testis tissue. Animal Reproduction Science. 106, (1-2), 65-65 (2008).
  21. Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft. Human Reproduction. 21, (2), 384-384 (2006).
  22. Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (10), 5504-5504 (1999).
  23. Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells. Biology of Reproduction. 70, (1), 70-70 (2004).
  24. Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal. Stem Cells. 24, (6), 1505-1505 (2006).
  25. Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics. 36, (6), 653-653 (2004).
  26. Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege. Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).
  27. Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. Preservation and transplantation of porcine testis tissue. Reproduction, Fertility and Development. 21, (3), 489-489 (2009).
  28. Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction. 22, (4), 1060-1060 (2007).
  29. Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice. Endocrinology. 149, (10), 5288-5288 (2008).
  30. Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice. Biology of Reproduction. 70, (5), 1500-1500 (2004).
Transplantation des cellules germinales et de tissus testiculaire xénogreffe chez la souris
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Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545, doi:10.3791/3545 (2012).More

Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545, doi:10.3791/3545 (2012).

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