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Biology

배아 세포 이식 및 Testis 조직 마우스에 Xenografting

doi: 10.3791/3545 Published: February 6, 2012
* These authors contributed equally

Summary

배아 세포 이식과 testis 조직 xenografting을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 배아 세포 이식받는 testes의 기증자 파생 spermatogenesis의 결과와 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs)의 식별을위한 기능성 reconstitution 분석을 나타냅니다. xenografting Testis 조직이받는 생쥐에서 다양한 공여 종의 testis 개발과 spermatogenesis를 재현한.

Abstract

배아 세포 이식 1994 1,2의 펜실베니아 대학에서 박사 랄프 Brinster 및 동료에 의해 ​​개발되었다. 이러한 지상 최신 연구받는 동물이별로 공여자 - 파생 spermatogenesis과 정자 생산에 불임받는 생쥐 결과의 정액을 운반하는 장치 tubules에 비옥한 공여 마우스의 배아 세포의 microinjection을 보여주었다. 받는 동물 1 자손에 기증 haplotype의 기증자 - 파생 spermatogenesis 및 전송의 세균성 β-갈락토 유전자 허용 신분증을 들고 기증자 남성의 사용. 놀랍게도, 정액을 운반하는 tubules의 루멘으로 이식 후 이식된 배아 세포 spermatogonia가 3 위치한 지하 막에 luminal 구획에서 이동할 수있었습니다. 이것은 일반적으로 오직 SSCs가받는 testis에서 틈새 시장과 재연결 spermatogenesis를 식민지 수있는 것으로 인정된다. 따라서 배아 세포이식은 testis에서 줄기 세포 틈새 시장을 연구하고 putative spermatogonial 줄기 세포를 특성화하기 위해 기능적 접근 방식을 제공합니다. 지금까지 배아 세포 이식은, 기본적인 줄기 세포 생물학을 명료하게하다하기 전에 이식 4,5에 배아 세포의 유전자 조작을 통해 형질 전환 동물을 생산, Sertoli 세포 - 배아 세포 상호 작용 6,7, SSC 유도하고 식민지 3 공부하는 데 사용됩니다 8,뿐만 아니라 SSC 자기 갱신과 차별화 9,10.

배아 세포 이식은 큰 종 11도 가능한 것입니다. 이들의 주요 응용 프로그램은 다산의 보존, 동물 집단의 엘리트 유전학의 보급, 그리고이 기술 spermatogenesis과 SSC 생물학 연구 logistically 설치류보다 더 어렵고 비싼 등 유전자 변형 동물의 세대입니다. colonizat의 생쥐 결과의 정액을 운반하는 장치 tubules에 큰 수종으로부터 배아 세포의 이식공여 세포 spermatogonial 확장 이온 아니지만 phylogenetically 먼 종 12에서 배아 세포로받는 체세포 구획의 비호 환성으로 아마도 인해 전체 차별화 인치 대안적인 접근은 그들 주변의 체세포의 구획과 함께 대형 종의 배아 세포의 이식입니다. 우리가 먼저 immunodeficient 생쥐의 지느러미 피부 밑에 이식 미숙한 남성의 testis 조직의 작은 조각이 기름지게 관할 정자 13 생산과 전체 개발을 생존하고 받아야 할 수있는 것으로, 2002 년 보도했다. 이후 xenografting testis 조직은 많은 종의에서 성공을 보여줘왔다와 생쥐 14 대형 동물의 testis 개발과 spermatogenesis을 공부하는 귀중한 대안으로 나타났다.

Protocol

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생쥐에 참여하기 A. 배아 세포 이식

1. 받는 생쥐의 작성

  1. 수신자 기증 testis 세포에 (중 유전적으로 기증자 또는 면역 - 결함과 일치) immunologically 허용해야합니다.
  2. 받는 사람도 자연스럽게 spermatogenesis의 결여된 (예, W / W V 쥐)이나 내생 배아 세포 고갈 있어야합니다. 배아 세포 고갈은 조사 또는 Busulfan 같은 chemotherapeutic 약물에 의해 형성될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 Busulfan으로받는 생쥐를 준비하는 방법을 설명합니다.
  3. Busulfan의 IP 주입을 통해 시대의 4-6주에서 수신자를 드셔보세요. Busulfan의 최적 복용량은 변형에 따라 달라지게된다. 일반적으로 사용되는받는 종자에서 40-50 밀리그램 / kg의 복용량은 내생 배아 세포 (예 : 44 누드 마우스에 대한 밀리그램 / kg, 50 밀리그램 / B6/129 F1을받는 사람에 대한 ㎏).를 고갈에 충분하다
  4. DMSO의 Busulfan 파우더를 해산하고 멸균 증류수의 전술이 동일한 볼륨을 추가4 MG / ML의 최종 농도를 O. Busulfan의 석출을 방지하는 데 사용할 35-40시 ° C에서 이전 솔루션은 따뜻하게. 강수량이 관찰되는 경우 솔루션을 폐기하십시오.
  5. Busulfan 치료 후 한 달쯤 수신자를 사용하기 전에 수 있습니다. 받는 사람은 1 달 삼개월 후 Busulfan 치료 사이에 사용할 수 있습니다.

2. microinjection의 pipettes의 작성

  1. 1.0 mm 외경, 0.75 mm 내경, 3 인치 길이 borosilicate 유리 pipettes (모세관 튜브)를 선택합니다.
  2. Sigmacote와 유리 pipettes를 Siliconize, 메탄올과 pipettes 씻어 건조 폭파.
  3. 피펫 풀러를 사용하여 pipettes를 당겨. 다른 피펫 풀러 기계는 다른 설정은, 그러므로, 몇몇 설정을 테스트할 수 있습니다. 일반적으로 핵의 제거를 pipettes를 만들기 위해 사용하는 것과 비슷한 설정은 작동합니다.
  4. 약 50 μm의의 직경을 달성하기 위해 사용하기 전에 해부 현미경 피펫 팁 떨어져일각에서.

3. 이식을위한 기증자 세포의 준비

  1. 기증자 변형의 Choise는 연구 실험 문제에 따라 달라집니다. spermatogenesis의 부량가 종점으로 사용되는 경우, 해당 LAC-Z와 같은 쉽게 식별 가능한 유전자 마커와 기증자의를 사용 (예 : B6.129S7-GT (로사) 잭슨 연구소에서 26Sor / J) 또는 GFP (예 : C57BL/6-Tg ( 잭슨 연구소에서 편대의 편대-EGFP) 1Osb / J).
  2. 7 MG / ML에서 DMEM에 DNase의 MG / ML, 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ML (0.25 % 트립신 플러스 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 2 ML 1에서 DMEM에서 collagenase 7 ML을 준비합니다. 이 금액은 2 기증자 마우스 testes을 소화입니다.
  3. 무균 testes를 수집하고 tunica의 albuginea를 제거합니다. 확산 정액을 운반하는이 효소 소화를 촉진하기 위해 미세 집게로 부드럽게 tubules.
  4. 5-10 분, 그리고 자주 활발히 논의를 위해 37 ° C에서 품어 collagenase로 전송 tubules.
  5. 방적 (3 분 2백~3백g)과 PBS W / O 칼슘 2에 다시 정지하여 두 tubules 씻으 + +
  6. 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 tubules를 다시 중지들이 끈적끈적한와 흐린가 될 때까지 흔들어. 그것 1-2 분 이내에 발생한다 ° C로 37 tubules의 소화를 모니터링합니다.
  7. DNase을 추가하고 잘 흔들어. 1-2 분 동안 품어.
  8. 효소의 작용을 중지 FBS 3 ML을 추가합니다.
  9. 세포 / 조직 덩어리를 제거하는 40-70 μm의 기공 크기 나일론 메쉬를 사용하여 필터 세포 현탁액.
  10. 5 분 대한 600g에 세포를 수집하여 DMEM (<100 μl)의 소량에 다시 정지 세포.
  11. 세포를 세고 원하는 최종 농도 (일반적으로 100 × 10 6)으로 볼륨을 조정합니다. 사용하기 전에 빙판에 세포 현탁액을 유지.
  12. 각각 Busulfan - 대우 마우스 testis는 세포 현탁액의 단지 10-15 μl로 가득합니다. 잠재적인 낭비와 누수로 인해 testis 당 30-50 μl를하고자합니다.

4. 이식 절차 (그림 1)

  1. 승인된 프로토콜에 따라받는 사람을 마취시키다.
  2. 지느러미의 장소드러누움 및 수술 복부 영역을 준비합니다. 복부 벽을 폭로하기 위해 ~ 1cm 중간선 복부 절개를합니다. 우연히 복부 장기를 손상하지 않도록하고, 복막 구멍을 노출하는 복벽의 중간선에서 ~ 0.5 cm의 절개를 만들기 위해 진행 흰색 라인의 시점에서 작은 집게를 사용하여 복벽 들어 봐요.
  3. 복부 벽을 사수 하나 홍채 집게를 사용하여 복막에 고인 epididymis와 testis에 부착된 기름 패드를 검색할 홍채 포셉 또 한 쌍의을 사용합니다. 부드럽게 testis가 exteriorized 때까지 지방 패드를 꺼내와 고환 동맥과 epididymis 명확하게 볼 수 있습니다. 한 번에 한 testis에서 작동합니다.
  4. 더 나은 시각적 식별 (옵션)에 대한 지방 패드 / testis 아래 autoclaved 색인 카드로 만든 얇은 무균 드레이프를 놓습니다. 드레이프 또한 액체를 흡수하기 위해 노력하고 있습니다.
  5. 세포 현탁액으로 Trypan 블루 염료 방울을 넣고 조심스럽게 polyethy에 세포 현탁액을로드lene 튜빙은 1 ML의 주사기에 연결. 튜빙으로 뽑았 피펫을 첨부하고 부드럽게 주사기에 압력을 적용하여 피펫으로 세포 현탁액을 강제.
  6. efferent 덕트 (epididymis로 testis 연결하는)를 식별하고 부드럽게 덕트 주위 지방 조직을 제거합니다. 그들 주위 덕트와 멤브레인가 반투명 있기 때문에 신중하게 작동합니다.
  7. 조심스럽게 efferent 관의 번들로 덕트로 피펫을 삽입, 부드럽게 testis 향해 몇 mm에 실을 꿰다.
  8. 주입 피펫을 이동 피하는 동안 주사기를 위해 도달, 부드럽게 작성하기 시작 정지가 rete testis와 정액을 운반하는 tubules로 흐르는 수 있도록 주사기의 플런저를 우울하게.
  9. 세포 현탁액의 주입 속도와 흐름은 엄지손가락의 압력에 의해 규제됩니다. 압력의 갑작스런 증가를 피한다; tubules에있는 정지의 움직임을 모니터링합니다.
  10. testis는 벡을 시작하기 전에 거의 모든 표면 tubules가 충만되어 분사를 중지합니다허혈성 ome.
  11. 복강에 testis를 반환합니다. contralateral testis에 절차를 반복합니다. 6-0 실크 봉합사와 복부 벽 치료와 금속 상처 클립으로 피부를 닫습니다. 전체 복구까지 온난 패드에서 마우스를 모니터링합니다.

5. 받는 사람 testes 분석

  1. 2-4개월 분석하기 전에 이식 후 허용합니다.
  2. 동물 관리 및 사용 지침에 따라받는 마우스를 안락사시켜야하고 PBS로 testis와 epididymis를 수집합니다. 그것이 내생적인 베타 갈락토 활동이로 LAC-Z 유전자 변형 기증자 스트레인이 사용되면, epididymis는 긍정적인 염색법 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
  3. LAC-Z의 염색법에 의한 공여 세포의 검출 들어, 4에 1~2시간 위해 testis를 해결 ° C를 PBS에서 4 % paraformaldehyde (PFA)에. lacZ의 실온에서 3 X 30 분 린스하면 버퍼를 린스.
  4. lacZ의 염색법 용액에서 37 ° C에서 밤새 품어. Testis은 전체적으로 또는 분산 후에 물들일 수tubules.
  5. 수정하고 중립은 포르말린 버퍼 10 % 저장합니다. 섹션이 필요한 경우에는 반대 얼룩과 같은 중립 빠른 빨간색을 사용합니다.

부 B. 자궁외은 생쥐에 xenografting

(Dobrinski 및 Rathi 2008 15,로드 리게스 - 소사 외부터. 2,011 16).

1. 공여 조직의 모음

  1. 거세에 의해 testis 조직을 확보하거나 기증자 남성에서 생검.
  2. 멸균 조건을 유지하는 PBS 또는 배지에 biopsies의 장소 testis.
  3. 얼음과 실험실로 이송에서 수집된 조직을 유지.

2. 공여 조직의 준비

  1. 불임을 유지하기 위해 조직 문화 후드에서 수행합니다.
  2. 2 ~ 3 배 PBS와 문화 그릇에 전송하기 전에 얼음처럼 차가운 PBS가 들어있는 항생제 각 testis 씻으십시오. biopsies의 경우, 심심풀이 문화 메디와 함께 testis 조각에게 2 ~ 3 배 씻어음 .. 2 분 동안 150g에 회전과 신선한 얼음처럼 차가운 배지에 resuspending하여 항생제를 포함하는.
  3. 그대로 testes은 표면을 따라 절개하여 tunica vaginalis 장치를 제거하고 testis을 압출 성형. testis 모든 별관 구조 (정액의 코드, epididymis, 결합 조직)에서 제거합니다. PBS와 문화 그릇에 차가운 PBS 및 전송에 한 번 testes 씻으십시오.
  4. 조심스럽게 메스 블레이드와 가위를 사용하여 testis의 tunica의 albuginea를 제거합니다. testis가 매우 작은 경우, tunica는 다른 끝에 작은 포셉 한 켤레로 tunica를 누른 상태에서 한쪽에 만들어진 작은 절개를 통해 tunica의 고환 조직을 착취하여 제거할 수 있습니다.
  5. testis의 크기에 따라 하나를 전체 testis 조직은 1 주위를 작은 조각으로자를 수 있습니다 - 곡선 집게와 메스 블레이드, 또는 testis 조직의 큰 조각을 사용하여 크기가 2mm 3 처음엔 testis에서 제거하실 수 있습니다 작은로 잘라조각. 모든 이것은 얼음처럼 차가운 배지와 작은 문화 요리 (60 x15 ㎜)에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다.
  6. 접목 때까지 얼음 작은 문화 요리 심심풀이 문화 매체로 준비된 조직 조각을 전송합니다.

3. 받는 마우스의 거세

  1. 위의 마우스를 마취시키다 70 %의 에탄올과 Betadine 용액으로 닦고, 머리를 (없는 누드 마우스에 필요한) 클리핑하여 무균 수술 부위를 준비합니다.
  2. 복부 벽을 폭로하기 위해 0.5 -1 cm 복부 중간선에 피부 절개를합니다.
  3. 신중 PartA, 4.2-4.3에서 설명한대로 testis, 고환 동맥과 epididymis을 폭로.
  4. 무딘 절개로 gubernaculum에서 epidydimis의 꼬리를 분리합니다.
  5. 고환 동맥을 Ligate하고 중이야 실크로 혈관과 함께 정관 및 testis와 끈 사이를 절단하여 섹션의 출혈도 잡았 구조.
  6. seco 절차를 반복차 testis.
  7. 하나 또는 두 개의 수술용 봉합사와 복부 벽 봉합해.
  8. 하나 또는 두 개의 미셸 클립으로 피부 절개를 닫습니다.

4. xenografting 자궁외

  1. 복부 드러누움에 마우스를 위치 이상 등 그 뒷면에 불임 수술 부위를 준비합니다.
  2. (일반적으로 4-8/mouse) 삽입하는 것입니다 얼마나 많은 이식에 따라, 마우스 뒤쪽의 중간 라인의 각 면에 ~ 0.5 cm 길이 피부 incisions하다.
  3. 피부 절개의 테두리를 잡고 집게를 사용하여 가위를 사용하여 결합 조직을 분열 괴롭히고하여 피하 충치합니다​​.
  4. 다른 홍채 포셉로 피부 절개의 테두리를 잡고 아이리스 포셉 장소에게 피하 캐비티에 깊은 testis 조직의 조각을 사용합니다.
  5. 한 미셸 클립으로 피부 절개를 닫고 그것이 마취에서 회복하기 시작할 때까지 가열 패드에서 마우스를 보관하십시오.
  6. 부가 절연 및 공동과 새장에 마우스를 전송버전 및 모니터 마우스까지 완전히 회복됩니다.

5. 분석 및 정자 추수할 testis xenografts 수집

  1. 동물 관리 및 사용 지침에 따라 호스트 마우스를 안락사, 그리고 꼬리의 목 및 개방형 피부에 실행 다시 피부에 중간선에 피부 절개를합니다. 이것은 피하 조직에 어느 위치하거나 피부에 장착할 수 이식술을 제공합니다.
  2. 조심스럽게 페어 집게와 가위를 사용하여 이식을 제거합니다.
  3. 이식술은 회복, 크기 및 개별 이식술의 무게의 레코드 번호입니다.
  4. 마우스의 복부에서 정액 vesicles를 검색하고 이식할 조직에서 남성 호르몬 생산은 표시대로 자신의 체중을 기록합니다.
  5. histological 분석
    1. 볼륨에 Bouin의 솔루션을 (또는 다른 정착액) 포함하는 샘플 유리병에 xenografts을 일시 중지하면 해당 이종 이식의 10 배 정도요, 그리고 라벨 유리병 적절.
    2. 알을 품다선호 24 시간 간격으로 70 % 에탄올에 적어도 3 회 씻고 다음 냉장고에서 하룻밤.
    3. 처리과 파라핀에 삽입을 위해 진행합니다.
  6. 정자 추수할
    1. 1 분 동안 300g에 그들을 아래로 회전과 문화 매체를 포함하는 항생제에 그들을 resuspending하여 xenografts 씻으십시오.
    2. 작은 조각으로 이식을 잘라와 3를 포함하는 조직 배양 접시에있는 집게로 조심스럽게 말하다 - 배지 5 ML.
    3. 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 다진 조직.

부 C. 대표 결과

1. 배아 세포 이식

이식된 공여 세포 현탁액 등 LacZ transgene,받는 testis의 기증자 SSCs의 식민지와 같은 유전자 마커를 들고 spermatogonial 줄기 세포가 포함되어 있으면 SEM의 독특한 푸른 세그먼트로 X-여자의 염색법에 의해 시각이 될 수iniferous는 2~3개월 사후 이식 3 (그림 2A) 이후 tubules. 탄탄한 식민지가 끝나 모두에서 두 개 이상의 가까운 센터에 청색의 세포 레이어, 그리고 상대적으로 약한 스테인드 영역으로 완전히 채워진 세그먼트 긴 진한 파란색 신축성이 있어야 어디 단일, 이점 또는 파란색 세포의 작은 그룹의 네트워크 3 (그림 2B) 겉보기입니다. 진한 파란색의 정액을 운반하는 가느다란 관 영역의 단면이 잘 설립 밝히지 각종 분화 단계 (그림 2C)에서 파란색 배아 세포로 잘 조직 spermatogenesis한다.

2. xenografting Testis 조직

이식 후 testis 조직의 생존 능력은 반대 기증자의 발달 단계와 서로 관련되며 성인 조직은 17-21 타락한 후 죽게 높은 경향을 보여주면서 최고의 결과는 신생아 남성의 조직이 사용되었을 때 얻어진다. 기증자 조직이 나를 거쳐로서 일반적으로, 이종 이식 성공은 감소spermatogenesis의 첫 번째 물결의 iosis. 미숙 기증자 조직하고 완전한 spermatogenesis의 전체 개발 시간은 수종 구체적이고, 원래의 장소에 testes에 비해 자주 다소 짧아. 전체 spermatogenesis으로 정액을 운반하는 장치 tubules의 수는 종류에 따라 변수입니다. 양에있는 동안 숫자가 소와 고양이에, 50 %보다 큰 것으로 염소와 돼지는 채 15% 14 (그림 3)입니다.

그림 1
1 그림. 배아 세포 이식 절차. 플레이스 마취 후 지느러미 드러누움에있는 수신자와 ~ 0.4 인치 중간선 복부 절개 (를) 확인하십시오. epididymis와 testis에 부착된 지방 패드를 철수하여 testis을 폭로하고 더 나은 시각적 식별 (B)에 대한 지방 패드 / testis 밑에 얇은 무균 드레이프를 놓습니다. 지방 패드에 묻힌 efferent 덕트는 (C, D, E)보고 알 수있는가되도록 testis와 epididymis를 둡니다. 신분증엔티티 efferent 덕트 부드럽게 덕트 주위 지방 조직을 제거합니다. 색 종이 또는 플라스틱의 조각이 더 나은 시각화 (G) 용 덕트 아래에 배치될 수 있습니다. 피펫 (H)로 덕트 및로드 세포 현탁액의 크기에 따라 피펫 팁을 빠져나가거나 갈아서. 조심스럽게 efferent 관의 번들로 덕트로 피펫을 삽입, 부드럽게 testis (H의 화살표가 피펫 사출 및 스레딩의 방향을 보여주는)을 향해 몇 mm에 실을 꿰다. 정액을 운반하는 tubules로 성공적인 분사와 testis는 (I) 표시됩니다. TS : Testis, EP : epididymis.

그림 2
그림 2. 배아 세포 이식) X-여자 물들일 주입 testis위한 대표 결과입니다. 정액을 운반하는 장치 tubules의 푸른 세그먼트는 유전자 변형 기증 SSCs (LacZ transgene)에서 설립 식민지를 나타냅니다. 삼개월 후 이식에서 SSC 식민지의 B) 높은 배율. 일중앙에 전자 진한 파란색 영역은 끝에 전체 spermatogenesis과 하늘색 지역을 대표하는 식민지의 성장 확장자를 나타냅니다. C) 진한 파란색의 정액을 운반하는 가느다란 관의 histological 섹션 (삼개월 이후 이식)은 잘 조직 spermatogenesis를 보여줍니다. B와 C의 스케일 바는 200 μm의 각각 30 μm의입니다. (숫자는 Annu 레브 데브 세포 Biol에서 적응 2008;. 24:263-86 및 Biol Reprod 1999 6월는;. 60 (6) :1429-36).

그림 3
그림 3. 자궁외 immunodeficient 생쥐로 큰 동물의 미숙 testis 조직의 xenografting. immunodeficient 생쥐의 지느러미 피부 ()에서 이식 미숙 기증자 testis 파편 (~ 1mm 3)하고 생존과 마우스 gonadotropins에 응답할 수 있습니다. 그 결과, testis 조직 기름지게 관할 정자 (B)의 형성을 포함한 완벽한 개발을 거쳐. testis의 xenografts가 수집되면 (C)그들은 분석을 위해 또는 ICSI (E)와 배아 생산 (F)에 정자 (D)을 구하는 데 사용될 수 있습니다. 바 동등 50 μm의 (B, E 및 F) 또는 10 μm의 (D). (로드 리게스 - 소사와 Dobrinksi 2,009 14에서 수정).

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Discussion

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1. 배아 세포 이식

배아 세포 이식은 세포 인구의 spermatogonial 줄기 세포의 존재 (SSCs)의 애매하지 않은 확인하는 유일한 기능 분석을 제공합니다. 오직 SSCs는하고 지하 막에서 SSC의 틈새를 식민지와 기증자 파생 spermatogenesis을 시작할 가정 수 있습니다. 배아 세포 이식은 전례없는 방식으로 SSCs을 연구하고 조작하는 것이 가능했다. 기술은 SSCs 4의 유전자 조작을 통해 형질 전환 동물을 생산하기 위해 사용되고, SSC의 식민지 3,8의 패턴, 효율과 속도론을 명료하게하다하려면, SSC 자기 갱신과 차별화 9,10 조절 신호 전달 경로를 연구하기 위해, 성격 자신의 신분 22,23위한 SSCs의 표면 마커; SSCs 6,7,24위한 틈새 환경을 공부합니다. 또한, 상호 이식은 조사를 채용되었는지 infertilit의 표현형y는 Sertoli 세포의 결함이나 배아 세포 25,26에서 유래.

이식이 효과적으로 작동하기 위해서는 선택과받는 동물의 치료가 중요하다. 수신자는 어느 유전자 기증자 또는 면역 - 억압과 일치해야합니다. W / W V 마우스와 같은 돌연변이로 인해 중, 또는 방사선이나 Busulfan 같은 chemotherapeutic 의약품에 의한 배아 세포 고갈로 인한 불임 렌더링 :받는 사람도 내생 spermatogenesis이 부족합니다. 또한, 기증자 세포 현탁액 및 이식 과정에서 실력 좋은 준비뿐만 아니라 기술의 성공을 위해 중요하다.

배아 세포 이식을 자체적으로 제한 사항이 있습니다. 결과에 대한 읽기 밖으로 더 빠른가 없습니다. 받는 사람 testes의 분석은 별도 불임 수신자의 전체 spermatogenesis의 회복은 이식 후 3 이개월 발생으로 적어도 이개월 기다릴 필요가 있습니다. 그것은 내가휴대폰 번호를 주입하고받는 배아 세포 억제 정도에 큰 차이로 인한 SA 질적 또는 반 정량 분석​​. 배아 세포 이식의 개념은 다른 동물 종의 적응되었지만, 절차 자체는 기술적으로 서로 다른과 종 11 전체 해부학 차이의 결과로 비 쥐 종에서 다소 더 도전입니다.

2. xenografting Testis 조직

Testis 조직은 많은 포유 동물 기증​​ 수종에 걸쳐 작품을 xenografting하고 비교적 간단한 기술입니다. transplantations 다른 종류와 마찬가지로, 빨리 후 컬렉션 조직은 성공의 큰 기회를 이식하고 있습니다. 따라서 컬렉션에서 이식까지 보존하고 조직의 처리가 중요합니다. 그러나 우리의 경험 testis 조직에서 냉장 보관되는 이외의 다른 특수 취급을 필요로하지 않습니다. 36 시간 - Testis 조직은 24 냉장고 온도에서 최대 유지 수 있습니다그리고 파편들이 이식을 위해 준비를 할 수 있습니다. 또한, 신선한 testis의 조각이 접목 결과 27 눈에 띄는 효과없이 4 ° C에서 하룻밤 사전 이식에서 표준 배지 유지하실 수 있습니다. 장기 보관이 필요한 경우에는 Testis 조직도 cryopreserved 수 있습니다. 염소 13, 13,27 돼지와 원숭이 28 수행된 연구 testis 조직의 동결 융해 이후 크게 생쥐에서 xenografting 자궁외 후 정자를 개발하고 생산하기위한 능력에 영향을주지 않는 것으로 나타났습니다. testis 조직의 성공 cryopreservation는 FBS를 포함하는 표준 조직 배양 매체에서 cryoprotectant로 DMSO를 사용하여 알코올 목욕 13,27에서 자동 언 28 종래의 느린 냉동에 의해 형성될 수 있습니다. 이식의 경우 cryopreserved testis 조직 그러면 표준 방법으로 해동되고 이후 이식 27 전에 배지에 세차. 일단 모습슈가받는 마우스 생체내 인큐베이터없이 주요 개입의가 필요한지 역할을 이식되었습니다. 그러나, 경우에 따라 외인성 gonadotropins와 보완이 필요할 수 있습니다;에서 testis 조직을 6 개월 된 붉은 털원숭이 원숭이 6-7개월 29에서 전체 spermatogenesis을 달성하기 위해 일주일에 두 번씩 hCG의 10 IU로 subcutaneously받는 생쥐 주입이 필요합니다.

위에서 언급한 바와 같이 신생아 남성의 조직가 사용될 때, 가장 좋은 결과가 얻어진다. postmeiotic 배아 세포가 존재하는 남성의 피부 조직이 퇴화하는 경향을 보여줍니다. 그러나 미숙 동물 testis 개발의 전체 요점의 반복이 가능하며 다양한 임상 및 연구 애플 리케이션을 가지고 있습니다. 임상 설정에서 xenografting testis 조직은 특히 정자 복구가 이루어지는 것이 아니 란다있는 미숙 남성에서 불임 보존을 위해 사용될 수 있습니다. biopsies의 형태로 작은 조각은 장기 보관을 위해 수집하여 냉동 수 있습니다. 때 DESired, 조각은 해동과 생쥐 27,28로 이식할 수 있습니다. 또 다른 대안은 xenografts에서 수확되는 정자의 cryopreservation입니다. 돼지 testis의 xenografts에서 스냅인 냉동 정자로 Microinjection은 고환, epididymal에 비해 낮은 효율성에 있지만, morphologically 정상적인 배아의 생성을 초래하거나, 정자 27 ejaculated. 티슈가 개발한 후에, 그것은 정자를 수확으로 수집 수 있으며, 정자는 체외 13,16,30에서 배아를 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 이 제한은 그러나 정자를 올린 것은 epididymal 성숙을 받아야하므로 수정을위한 ICSI를 필요로하지 않는 것이 사실입니다. 따라서 수정을위한 이종 이식 파생 정자의 사용은 ICSI가 설립되었습니다 수종으로 제한됩니다.

연구에서는 xenografting testis 조직은 쥐 모델에서 큰 종 testis 개발과 spermatogenesis를 공부하는 매력적인 대안입니다. 예를 들어,단일 공여 testis은 여러 생쥐에 이식 할 수 있습니다. 받는 생쥐 후 이종 이식 컬렉션에 대한 서로 다른 시간 시점에서 희생 다른 트리 트먼트, 그리고 / 또는 노출 수 있습니다. 이것은 기증자 효과를 제거뿐만 아니라 특정 실험이나 연구에 필요한 큰 남성의 수를 줄일뿐만 아니라. 이것은 여러 수컷과 관련된 연구 logistically 어렵고 비싸다 큰 동물에 특히 중요하며, 특히 영장류에 윤리적 한계를 가지고 있습니다. 이식을 쉽게 불가능하며 spermatogenesis의 효율성을 특정 기증자 종 14 낮습니다 전에 그러나, testis 조직 xenografting의 응용 프로그램은 특정 세포 유형의 조작으로 제한됩니다.

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Disclosures

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgments

저자 연구실의 작품은 USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213)에 의해 지원되었다; NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2)와 앨버타 혁신 - 건강 솔루션.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase (type IV) Sigma-Aldrich C5138
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
DNaseI Sigma-Aldrich DN25
DMEM Invitrogen 31053-028
Trypan blue stain Invitrogen 15250-061
Nylon mesh cell strainer BD Biosciences 352340 (40µm) 352350 (70µm)
Busulfan Sigma-Aldrich B2635
Thin-Wall Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100) BD Biosciences CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture Ethicon Inc. 706G
Wound clips BD Biosciences 427631
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2
X-gal Sigma-Aldrich B4252
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Potassium Ferricyanide Sigma-Aldrich P3667
magnesium chloride Sigma-Aldrich 208337
sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich 18896

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References

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배아 세포 이식 및 Testis 조직 마우스에 Xenografting
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Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545, doi:10.3791/3545 (2012).More

Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545, doi:10.3791/3545 (2012).

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