Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

Published: March 21, 2012 doi: 10.3791/3546
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, University of California, Davis

Summary

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול המוךפו"גנטי שהולך העצם חלבונים 7 (BMP-7) או Matrigel סלקטיבי לגרום לצמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים העיקריים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של חולדות הלידה.

Abstract

הצורה של הדנדריטים ארבור קובע את הקלט הסינפטי הכולל תא עצב יכול לקבל 1-3, ומשפיע סוגי והפצה של תשומות אלה 4-6. דפוסי שינה של צמיחה הפלסטיות דנדריטים והן קשורות עם תפקוד לקוי neurobehavioral במודלים ניסיוניים 7, והם חשבו לתרום סימפטומים קליניים שנצפה בשתי 8-10 הפרעות התפתחותיות ומחלות ניווניות 11-13. תצפיות אלו מדגישים את החשיבות התפקודית של ויסות בדיוק מורפולוגיה הדנדריטים, וסבורים כי מנגנוני זיהוי השולטים הצמיחה הדנדריטים לא רק לקדם את ההבנה של כמה עצבי קישוריות מוסדר במהלך התפתחות תקינה, אבל עשויה גם לספק תובנות על אסטרטגיות טיפולית חדשנית למחלות נוירולוגיות שונות.

מחקרים שיבדקו את המנגנונים של צמיחת הדנדריטים יהיה להקל במידה רבה על ידי זמינות Ofa מערכת מודל המאפשר נוירונים כדי לפעול באופן ניסיוני ממצב שבו הם לא להאריך דנדריטים אחד שבו הם לפרט ארבור הדנדריטים דומה לזה של עמיתיהם שלהם vivo. תרבויות העיקריות של נוירונים אוהדים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של מכרסמים סביב הלידה לספק מודל כזה. כאשר בתרבית מוגדר בינוני בהעדר מתאי גליה בסרום ו ganglionic, הנוירונים אוהדים להאריך את תהליך יחיד אשר axonal, ואת זה המדינה חד קוטבי נמשכת שבועות עד חודשים בתרבות 14,15. עם זאת, תוספת של המוךפו"גנטי שהולך או עצם חלבונים 7 (BMP-7) 16,17 או 18 Matrigel עד בינוני התרבות מפעילה נוירונים אלה כדי להרחיב את התהליכים רבים העונים על קריטריונים מורפולוגיים, ביוכימיים ופונקציונלי של דנדריטים. נוירונים אוהדים הסתייגותם מן SCG של מכרסמים סביב הלידה ו שגודלו בתנאים מוגדרים הם אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים 19שמגיבים בצורה אחידה לפעילות דנדריט, קידום של Matrigel, BMP-7 ו BMPs אחרים של decapentaplegic (DPP) ו 60A subfamilies 17,18,20,21. חשוב לציין, Matrigel-BMP ו-Induced דנדריט היווצרות מתרחשת בהיעדר שינויים הישרדות התא או צמיחה axonal 17,18.

כאן, נתאר כיצד להגדיר את תרבויות הסתייגותם של נוירונים אוהדים הנגזרות SCG של חולדות סביב הלידה, כך שהם מגיבים על פעילות דנדריט, קידום סלקטיבי של Matrigel או BMPs.

Protocol

1. הכנת בינוני תרבות (בינוני C2)

  1. להוסיף את הדברים הבאים, על מנת ברשימה, כדי סטרילית, חד פעמי בקבוק 500 מ"ל Erlenmeyer:
    כמות רכיב ריכוז סופי
    190 מ"ל DMEM (גלוקוז נמוכה) N / A
    10 מ"ל חומצת שומן חופשית BSA (20mg/ml ב DMEM) 50 מיקרוגרם / מ"ל
    2.8 מ"ל L-גלוטמין 1.4 mM
    4 מ"ל אינסולין / transferrin / סלניום (100x) 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין 5.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​transferrin 38.7 nM סלניום
    0.4 מ"ל NGF (125 מיקרוגרם / מ"ל) 100 ng / mL
    200 מ"ל חם F-12 N / A
  2. לא בעדינות מערבולתo לערבב 10 מ"ל aliquot לכל צינור ב -17 100 x צינורות כובע סטריליים הצמד.
  3. לאחסן ב -80 ° C
  4. הערות חשובות:
    • NGF להפשיר מיד לפני השימוש.
    • לפני aliquoting פתרון המניות NGF, precoat הקירות הפנימיים של pipet רקמת התרבות סרולוגית פלסטיק עם חלבון כדי למזער דבק של NGF כדי פלסטיק. הגישה הקלה ביותר היא פיפטה DMEM תערובת המכילה את מספר פעמים BSA. יש לשטוף את הצינורית NGF מספר פעמים עם תערובת DMEM.
    • הוסף את F-12 האחרון כי ציסטאין חינם עשויה לערער אג"ח דיסולפיד ב אינסולין.
    • אין להקפיא בכמויות יותר מ 10 מ"ל כי קאפו 4 גבישים עלול להיווצר
    • לא להקפיא, להפשיר בינוני C2 יותר מ 2 פעמים.

2. הכנת Coverslips זכוכית

  1. מצאנו כי רק coverslips זכוכית עדינים הגרמנים לעבוד באופן עקבי בפרוטוקול זה (ראה לוח 1 עבור המקור המומלץ ואת מס 'קטלוגי).
  2. הוסף 75-100 מ"ל של חומצה חנקתית 70% ל -300 בקבוקי זכוכית מ"ל הדגימה עם PTFE (טפלון או) ספינות polytetrafluoroethylene ומכסה (קטלוג פישר # 09-911-765).
  3. כפפות, ירידה coverslips בזה אחר זה אל תוך הפתרון חומצה חנקתית. הוסף coverslips מספיק כדי ליצור שכבה לא יותר מ 2-3 coverslips עבה בתחתית הצנצנת.
  4. נער בעדינות את המכולות עם coverslips במשך 6-8 שעות בטמפרטורת החדר על הסט מסלולית שאכר לא יותר מ 185 סל"ד.
  5. עבודה במנדף, בזהירות למזוג את החומצה ועושה פי התקנות המקומיות. יש לשטוף coverslips פעם עם מים טהורים רקמת התרבות בכיתה, ולאחר מכן להוסיף 75-100 מ"ל מים למיכל. Coverslips ניתן לשטוף מספר פעמים אם המים הופך עכור. נער בעדינות בטמפרטורת החדר במשך הלילה על הסט מסלולית שאכר על סל"ד יותר מ 185 לא.
  6. חזור על רצף לעיל של חומצה חנקתית / תרבות כיתה רקמות מים בכל יום עבור סכום כולל של 3 ימים.
  7. למזוג האחרוןרקמת התרבות כיתה מים ולהוסיף אצטון מספיק בקושי לכסות את coverslips.
  8. לערות זה אצטון להיפטר כראוי.
  9. העברת coverslips אל צלחת פטרי 150 מ"מ זכוכית. הוסף אצטון מספיק בקושי לכסות את coverslips. ודא coverslips נמצאים בשכבה אחת בצלחת.
  10. אפשר אצטון להתאדות לילה במנדף.
  11. אופים בתנור coverslips ייבוש ב 180 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות לעקר.

3. הכנת Coverslips עבור תרבות

  1. יום לפני החיתוך, להוסיף 1 כוס coverslip (מוכן כמתואר לעיל) על כן כל אחד לצלחת 24 התרבות גם רקמות באמצעות טכניקה סטרילית. הוסף 200 μl של פתרון פולי-D-ליזין סטרילית (100 מ"ג / מ"ל ​​ב -0.5 מ 'טריס חיץ, pH 8) זה טוב לשמור את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. יום לנתיחה, ולא באופן אידיאלי לפני תחילת לנתיחה, לשאוב את הפתרון פולי-D-ליזין מבאר כל ולשטוף כל אחד גם 5 פעמיםבמים רקמות תרבות סטרילית כיתה.
  3. הוסף 200 μl גלוקוז נמוכה DMEM לצלחת כל החנות ב 37 ° C חממה. כ 1 שעה לפני התאים ציפוי, הסר גלוקוז נמוכה DMEM ולהוסיף 250 μl בינוני C2 בכל טוב. צלחות החנות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 עד תאים מוכנים להיות מצופה.

4. ביתור ובידוד של גנגליון צוואר הרחם מעולה

  1. תרבויות ניתק של נוירונים אוהדים מוכנים בדרך כלל על ידי ניתוק של הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) קוצרים טרום לידתי (יום עובריים 19-21) גורי עכברים כי יש מתאי גליה פחות. עם זאת, באותו פרוטוקול זה יכול לשמש בהצלחה עם הראשונים לאחר הלידה (1 עד 3 ימים) גורי חולדות או עכברים גורים הלידה.
  2. להרדים חולדה להריון באמצעות שאיפת CO 2. לגלח את הבטן ולשטוף את העור עם אתנול 70%. הסר את קרני הרחם בתנאים סטריליים ולמקם את קרני הרחם על צלחת פטרי סטרילית 150 מ"מ. להמנעפגיעה במעיים או לאיברים פנימיים אחרים של הסכר במהלך לנתיחה.
  3. מניחים צלחת פטרי עם גורים על גבי מחבת של קרח כדי להרדים את הגורים עובריים. לנתח את העוברים ללא קרן הרחם קרום מי השפיר. חותכים את חוט השדרה של כל הגור לאורך קו האמצע מתחת לכתף להרדים את הגורים. זה גם קוטעת את הווריד הנבוב, אשר מפחית דימום מעורק הצוואר במהלך דיסקציה של SCG. גזור פעם אחת ללא קרן הרחם, עוברים מקום ב בינוני סטרילית של ליבוביץ L-15 (או כל מדיום אוויר שנאגרו) השלימו עם פניצילין וסטרפטומיצין.
  4. מניחים את העוברים על גבם על צלחת פטרי 150 מ"מ חצי מלא Sylgard. שימוש במחטים סטריליות 20 מד, להצמיד את החזה ואת הראש, בעדינות hyperextending הצוואר, המאפשר דיסקציה של SCG.
  5. לעשות חתך לאורך קו האמצע בצוואר ברמה של הבריח לחשוף את בלוטות submandibular. הסרת בלוטות באמצעות מלקחיים עדינים (no. 4 או לא. 5 דומונט) כדי לחשוף את שכבת השריר.
  6. השתמש מלקחיים עדינים לחתוך את השריר sternocleidomastoid ליד עצם הבריח. ואז בעדינות להרים לחרות שרירים omohyoid ליד קנה הנשימה. שריר זה הוא דק מאוד, כך למנוע קיצוץ עמוק מדי, כדי למנוע קריעת העורק הראשי הבסיסית ו SCG. פעם אלה שכבות שרירים מוסרים, העורק הראשי ואת העצב התועה צריך להיות גלוי וברור.
  7. SCG נמצא ממש מתחת הסתעפות של עורק הצוואר. באמצעות מלקחיים עדינים (מס '4, אם בכלל. 5), להקהות לנתח רקמות מן שני הצדדים של עורק הצוואר לחשוף גנגליון. שימוש 2 מלקחיים עדינים, לתפוס את העורק הראשי מעל ומתחת את הקצוות מקורי ואת הזנב של SCG, בהתאמה, כדי להסיר את החלק של עורק הצוואר שוכב מעל SCG כמו גם SCG עצמו. סביר להניח כי גנגליון nodose, הנמצאת לצד SCG בשלב זה של ההתפתחות, גם יוסרו בשלב זה. הגרעינים nodose יכול להיות identifieד על ידי הצורה העגולה שלה העצב מחנק גדול מקרין ממנו. זה נמצא לאורך אחד הענפים של עורק הצוואר. לעומת זאת, SCG הוא שקדיות ושקרים ישירות תחת הסתעפות של עורק הצוואר. הנח את רקמת גזור לתוך צלחת מ"מ סטרילית 35 תרבות המכיל L-15 בינוני ו אנטיביוטיקה. הסר את SCG מ גורים לפני כל התקדמות אל השלבים הבאים.
  8. באמצעות מלקחיים עדינים, בעדינות להפריד SCG מ בעורק הראש וכל ברקמות אחרות שהוצאו במהלך הנתיחה (בעיקר העצב התועה ו nodose גנגליון). השתמש מלקחיים עדינים להסיר את הקפסולה מן הגרעינים. זו מקטינה באופן משמעותי את מספר התאים nonneuronal בתרבות. מעבירים את הגרעינים לצלחת אחרת סטרילי 35 מ"מ המכיל L-15 בינוני.
  9. כדי לנתק SCG, הסר בינוני 15 ליטר ולהחליף collagenase מ"ל 2 (הריכוז הסופי 1 מ"ג / מ"ל) / Dispase (הריכוז הסופי 5 מ"ג / מ"ל) של סידן ומגנזיום ללא פתרון מאוזן של האנק מלח. Incubaטה על 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.
  10. העברת SCG כדי צינור סטרילי 15 חרוטי מ"ל צנטריפוגות ולהביא את נפח עד 10 מ"ל עם L-15 השלימו עם BSA (בריכוז הסופי 1-2 מ"ג / מ"ל). סרכזת ב X 200 גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. מחק supernatant ולשטוף שוב עם L-15 השלימו עם BSA.
  11. לאחר שטיפה 2, להסיר את כל L-15 ו resuspend הגרעינים מ"ל 2 ~ בינוני C2. Triturate את התאים באמצעות אש מלוטש המעוקל בקצהו פיפטה, ודא פיפטה מצופה BSA/L15 לפני טחינה דקה כדי למזער דבק התאים זכוכית. Triturate 3-4 פעמים בעדינות. תנו את גושים גדולים להתיישב לרגע על 1 ולהעביר את ההשעיה התא צינור מ"ל 15 חרוטי. הוסף עוד מדיה C2 ל SCG הנותר triturate. לאחר להניח את גושי להתיישב, להעביר את ההשעיה התא מפני טחינה דקה 2 לזה שנאסף לאחר טחינה דקה 1. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד הגרעינים הם בעיקר ניתק. Discard כל גושים שנותר לאחר טחינה דקה 4.
  12. עבור תאים הסתייגותם מן החול אחד הגורים חולדה (בדרך כלל 12-16 גורים), מביא את סך היקף בינוני ההשעיה התא 8-10 מ"ל על ידי הוספת תוספת בינוני C2. Resuspend בעדינות את התאים בעזרת פיפטה ולהסיר aliquot קטן כדי לקבוע את צפיפות התאים. להתאים את עוצמת הקול של השעיה תא להשיג פי 2 צפיפות התאים הרצוי בתרבות, ולאחר מכן, להיות בטוח כדי לשמור על התאים ההשעיה, 250 מ"ל aliquot של השעיה לכל תא היטב. לימודי morphometric של צמיחה הדנדריטים, אנחנו בדרך כלל תאים על צלחת צפיפות נמוכה (~ 5 x 10 4 תאים לכל טוב) ב 24 צלחות גם.
  13. המעבדה שלנו דוגר תרבויות SCG ב הייבוש זכוכית ולא ישירות CO 2 באינקובטור. אנו עושים זאת בגלל אוהדים נוירונים שגודלו בינוני סרום ללא ביצועים טובים יותר עם ​​מעט יותר ריכוז CO 2 (כ 6.5%). בנוסף אנחנו לא משתמשים באנטיביוטיקה Oהתקשורת ur מאז זה מעכב תוצאה neurite ותרבויות שמירה ב הייבוש נראה למזער את התפשטות זיהום אם זה מתפתח משנה של תרבויות. באמצעות מערכת זו, אנו באופן קבוע לשמור על תרבויות SCG עד 8 שבועות. מצופה פעם אחת, תרבויות SCG מונחות על צלחת פורצלן תא ייבוש ב הייבוש זכוכית המכילים מים סטריליים בתחתית. כ 120 מ"ל של CO 2 מוזרק לתוך תא ייבוש לפני איטום אותו בחוזקה ומיקום תא ייבוש כולו לתוך מערכת חממה 35.5 ° C.

5. הזנה ותחזוקה של תרבויות

  1. תרבויות ניזונים בדרך כלל 3 פעמים בשבוע, עם חילופי 1 התקשורת המתרחשים במשך 24 שעות לאחר ציפוי. בעזרת פיפטה המעוקל בקצהו סטרילית, בעדינות למשוך כמחצית התקשורת בכל טוב. בעזרת פיפטה נקייה סטרילי המעוקל בקצהו, להחליף את נפח בינוני להסיר עם C2 טרי.
  2. כדי למנוע אי - תאים עצביים מתרבות, סוכן אנטי mitotic CYTosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, ריכוז מיקרומטר הסופית 1-2) מוסיפים בדרך כלל עד בינוני התרבות ב 1 Media Exchange (למשל, 24 שעות לאחר ציפוי) למשך 48 שעות. זה ריכוז של ARA-C הוא בדרך כלל מספיק כדי להסיר את כל התאים שאינם נוירונים. אם טיפול נוסף ARA-C יש צורך, מומלץ כי אלה לעשות כל האכלה אחרים כדי למזער את ההשפעות הרעילות על הנוירונים.

6. גרימת צמיחה הדנדריטים עם Matrigel או BMP-7

  1. כדי לגרום לצמיחה הדנדריטים, Matrigel או BMP-7 נוסף לתרבויות לאחר שאינם נוירונים בתאי נמחקו ו ARA-C רמות התרבויות מופחתים באופן משמעותי. בדרך כלל, אנו מוסיפים Matrigel או BMP-7 עד בינוני ביום 5 במבחנה, אך הצמיחה הדנדריטים יכול להיגרם על ידי Matrigel או BMP-7 נוסף בכל נקודת זמן במבחנה. Matrigel או BMP-7 נוסף בינוני C2 ותרבויות ניזונים כפי שתואר לעיל.
  2. Matrigel BMP ו-Induced הצמיחה הדנדריטים הזמןוריכוז תלוי. עבור אפקטים מרבית, Matrigel מתווסף C2 בריכוז הסופי של 50-75 מיקרוגרם / מ"ל; BMP-7 נוסף בינוני C2 בריכוז הסופי של 50 ng / mL. ריכוזים Matrigel של יותר מ 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​או BMP-7 בריכוז העולה על 100 ng / mL כבר ציין לגרום לרעילות עצבית. תהליכים דנדריטים (כפי שנקבע על ידי קריטריונים מורפולוגיים) לעין כ 48 שעות לאחר החשיפה הראשונית Matrigel או BMP-7 בריכוזים יעילים מרבית. כדי לגרום לצמיחה הדנדריטים חזקים, תרבויות ניזונים עם BMP-7 המכיל בינוני על כל האכלה. תוצאות מקבילות התקבלו באמצעות BMPs 2, 4, 5 ו - 6 בריכוזים דומים 20,21.

7. ניתוח Immunocytochemical של צמיחה BMP-7-induced הדנדריטים

  1. כאשר במידה הרצויה של arborization הדנדריטים הושגה, תרבויות קבועים באמצעות paraformaldehyde 4% במאגר M 0.1 פוספט. קיבעון הטובה ביותר היאchieved ידי החלפת מחצית בינונית היטב עם paraformaldehyde 4% ולחזור על פעולה זו 3-5 פעמים במשך 10-15 דקות.
  2. יש לשטוף תרבויות על ידי החלפת מחצית paraformaldehyde 4% עם מלח, פוספטים שנאגרו (PBS) ולחזור על פעולה זו שלוש פעמים מעל 10 - 15 דקות.
  3. הסר את כל PBS ולהוסיף 200 טריטון 0.1% μl X-100 ב PBS היטב כל 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי permeabilize התאים.
  4. הסר פתרון טריטון ידי השאיפה ולהוסיף 200 μl לכל גם הפתרון למאגר חוסם (PBS השלימו עם BSA 3-5% ו בסרום עזים 1%). דגירה של 20-30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הסר חוצץ חסימת ומוסיפים את הנוגדן העיקרי, microtubule הקשורים חלבון-2 (MAP2) מדולל ב 1:2000 - 1:5000 בחסימת המאגר. דגירה תרבויות עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
  6. הסר את הפתרון נוגדן ראשוני, לשטוף את התרבויות עם PBS שלוש פעמים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. דגירה התרבויות עם נוגדנים משני מדולל PBS השלימו עם BSA 1% למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
  8. הסר את הפתרון נוגדנים משני ולשטוף את התרבויות עם PBS שלוש פעמים יותר מ 10-15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  9. Coverslips הר שקופיות על זכוכית בצד התא כלפי מטה לירידה של המדיום גובר מימית ב-pH מתאים fluorochrome מתויג כדי נוגדנים משני. שמור את השקופיות בטמפרטורת החדר במשך הלילה כדי לאפשר הרכבה בינונית יבש. שקופיות לאחסן 4 ° C עד הדמיה.
  10. אפשר השקופיות כדי לאזן את טמפרטורת החדר לפני הדמיה. לרכוש תמונות ניאון באמצעות מיקרוסקופ שלב לעומת זאת מצויד epifluorescence. בדרך כלל, ארבור הדנדריטים של כל תא עצב אחד יכול ליפול בפח באמצעות המטרה 20X ומסננים המתאימים.

8. נציג תוצאות

נוירונים אוהדים הסתייגותם מן SCG של RA הלידהTS וגדלה בהעדר מתאי גליה בסרום ו ganglionic שלא להאריך MAP2 תהליכים immunopositive (איור 1), אלא בדרך כלל רק להרחיב את תהליך axonal אחת 14,15. חשיפה BMP-7 (איור 1) או Matrigel גורם להיווצרות של תהליכים רבים העונים על קריטריונים מורפולוגיים, ביוכימית ופונקציונלית של דנדריטים 17,18. פעילות דנדריט, קידום של אחד Matrigel או BMP-7 הוא ריכוז זמן תלויה 17,18,20. צמיחת הדנדריטים מקסימלי הוא ציין באמצעות ריכוזים של Matrigel בין 50 ל 75 מיקרוגרם / מ"ל ​​או BMP-7 בין 30 ל 100 ng / ml, וחצי מקסימלי תופעות נצפות בדרך כלל ב-BMP-7 ריכוזים של ~ 2 ng / mL. עם זאת, שינויים משמעותיים לצמיחה הדנדריטים ניתן לאתר עם BMP-7 ריכוז נמוך כמו 300 pg / ml. בתגובה הדנדריטים או כדי Matrigel או BMP-7 הוא איטי יחסית, עם <50% מכלל הנוירונים יוצרים תהליך 2 בתוך 24 שעות לאחר חשיפה או דנדריט-P romoting הסוכן. עם זאת, בתוך 3 ימים לאחר החשיפה הראשונית-7 BMP, כמעט את כל הנוירונים להגיב Matrigel יעיל מקסימאלי או BMP-7 ריכוזים. מספר דנדריטים לכל הנוירונים ממשיכה לגדול עם חשיפה ממושכת של BMP-7, כאשר עיקר השינוי מתרחש במהלך 10 הימים הראשונים של הטיפול. לאחר 4 שבועות, BMP-7-שטופלו נוירונים יש בדרך כלל 6-8 דנדריטים העיקריים התערוכה משני סניפים, הדנדריטים שלישוני וכן הרביעון אפילו 17. עלייה זו מתרחשת ארבור הדנדריטים בהעדר שינוי משמעותי בצמיחה axonal, ותגובות דומות דנדריטים ניתן שהושרו באמצעות ריכוזים דומים של 2 BMPs, 4, 5 או 6 20,21. צמיחת הדנדריטים ניתן גם שהושרו על ידי שיתוף culturing נוירונים אוהדים עם אנדוגניים מתאי גליה ganglionic 15,22, עם זאת, בתגובה הדנדריטים הוא איטי באופן משמעותי בתנאים אלה.

. Jpg "/>
באיור 1. BMP-7 מקדם צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים. ללא תאים עצביים הושמטו SCG תרבויות על ידי טיפול אנטי mitotic לתחילת 48 שעות ביום 2 במבחנה. החל ביום 5 במבחנה, תרבויות טופלו בינוני או שליטה (א) או בינוני השלימו עם BMP-7 ב 50 ng / ml (ב '). ביום 11 במבחנה (לאחר 5 ימים של טיפול BMP), תרבויות היו immunostained עם MAB נגד MAP2, חלבון המצוי בעיקר דנדריטים somata העצבית. כפי שניתן לראות photomicrographs הקרינה נציג, הנוירונים שגדלו בתנאים מבוקרים, חסר דנדריטים כפי שבא לידי ביטוי חוסר MAP-2 דנדריטים תהליכים immunopositive (); לעומת זאת, נוירונים חשופים BMP-7 (ב) יש בדרך כלל כמה קוני MAP-2 immunopositive דנדריטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרונות של מודל זה הם: (א) תרבויות מורכבות של אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים אוהדים חסרי סוגי תאים אחרים 17,23 (ב) גורם הגדילה הדרישות של נוירונים הם אוהדים מבוססת היטב, אשר מאפשר את השימוש בינוני מוגדר, וכן מגוון של כלי התקשורת מוגדרים, מצעים לעבוד היטב לגידול ושמירה על נוירונים אוהדים 23 (ג) הנוירונים בתרביות אלה מגיבים באופן אחיד לפעילות דנדריט, קידום של Matrigel, BMP-7 ו BMPs אחרים של DPP ו 60A subfamilies 17,18,20,21, ו (ד) Matrigel או BMP-Induced דנדריט היווצרות מתרחשת בהיעדר שינויים הישרדות התא או צמיחה axonal 17,18. מודל זה מאפשר שליטה ניסיוני של צמיחה כאשר הדנדריטים מופעלת, אשר מאפשרים לקבל אוכלוסיות מסונכרנים של נוירונים בשלבים שונים של צמיחה הדנדריטים, למשל, מיד לפני היווצרות של דנדריטים, במהלך dendr העיקריitogenesis (היווצרות ראשונית של דנדריטים ראשוניים) ובמהלך בשלבים מאוחרים יותר של ההתבגרות הדנדריטים. המגבלות המשמעותיות ביותר של המודל כוללים את כמויות מוגבלות של RNA וחלבון זמינים לנתיחה אופייני המלטה אחת, מה שעשוי להגביל מחקרים ביוכימיים, ויש קושי לתמרן ביטוי גנים. ההתקדמות טכניקות לביטוי cDNA ב ראשוניים בתרביות תאים עצביים הם במהירות להתגבר על חיסרון זה האחרון. ישנם פרסומים שדיווחו על יישום מוצלח של שומנים בדם מבוססי מערכות האספקה, nucleofection, ו וקטורים adenoviral לנוירונים בתרבית אוהדים. את יעילות transfection דיווחו נמוכים יחסית (בדרך כלל נע בין 10-20% עם lipofection או nucleofection ועד 30-50% עם זיהום ויראלי), אשר מספקת עבור נקודות קצה המבוססים על ניתוחים תאים בודדים, כגון ניתוחים מורפולוגיים, אבל יכול להיות בעייתי עבור נקודות קצה ביוכימיים רבים.

גורמים thaלא יכול להפריע לצמיחה BMP-Induced הדנדריטים בנוירונים בתרבית אוהדים לכלול את culturing נוירונים בצפיפות תאים גבוהה מאוד, כולל סרום בתקשורת ובתרבות. בעוד הסיבה צפיפות התאים גבוהה פוחתת הפעילות דנדריט, קידום של BMPs אינו ידוע, סביר להניח כי הנסיוב פוחתת פעילות זו משום BMPs לאגד בשקיקה את החלבונים בדם. מעניין לציין, סרום עצמו יש פעילות חלשה דנדריט, קידום בנוירונים אוהדים מתורבתים 24, ונתונים ראשוניים שלנו עולה כי פעילות זו מתווכת על ידי BMPs, אשר נמצאים רוב אם לא כל סרה מסחרי. BMPs גם נוכח Matrigel, וסביר לתווך פעילות דנדריט-בקידום שלו. הגורם השלישי שיכול להשפיע על פעילות דנדריט, קידום של BMPs מטפל אחסון לא נכון של BMPs. אין לאחסן פתרונות ה BMP מניות בריכוז של פחות מ -0.1 מ"ג / מ"ל. חשוב לא לתת מניות BMP או פתרונות שעובדים להיות מאוד בסיסי ומומלץ buffers נהגו לדלל פתרונות המניות יש pH של 4.5 ± 0.05. מערבבים את כל פתרונות במרץ לפני aliquoting אבל לא כל כך בתוקף, כי פתרונות הקצף, ורק להשתמש צינורות פוליפרופילן כי BMPs נוטים לדבוק פלסטיק אחרים. אין לאחסן aliquots ב מקפיאים בעלי תכונה הפשרה אוטומטית, כי רכיבה על אופניים של טמפרטורות מספיק כדי להרוס את פעילות BMP-7. מומלץ מאוד כי BMP פתרונות לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס, כי ההקפאה, ההפשרה להיות ממוזער (לא להקפיא, להפשיר יותר מ 2-3 פעמים). אמצעי זהירות דומים יש להשתמש בטיפול Matrigel. כמו כן, מומלץ Matrigel להיות מופשר לאט 4 ° C. Matrigel לא לגרום לצמיחה הדנדריטים כאשר נעשה שימוש כדי מצעים precoat לפני נוירונים ציפוי, היא יעילה רק כאשר הוסיף בינוני תרבות שהוקמו בתרביות תאים עצביים 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מן המכון הלאומי לבריאות (מענקים R21 ו R01 NS45037 ES014901).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Bellco Glass 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco Glass 1273-50003
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools 11252-30 11241-30
20-gauge needles BD Biosciences 305176
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415
Collagenase Worthington Biochemical 4176 1 mg/ml
Dispase Roche Group 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM Low glucose Invitrogen 11885
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609
NGF Harlan Laboratories 5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765
Cytosine arabinoside Sigma-Aldrich C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Molecular Probes, Life Technologies P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. , Harvard University Press. (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Tags

מדעי המוח גיליון 61 עצם המוךפו"גנטי שהולך חלבונים (BMPs) Matrigel דנדריט dendritogenesis המורפוגנזה העצבית הנוירונים אוהדים
גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P.… More

Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter