Summary
हम हड्डी morphogenetic प्रोटीन 7 (बीएमपी -7) या Matrigel का उपयोग करने के लिए चुनिंदा प्राथमिक सहानुभूति न्यूरॉन्स प्रसवकालीन चूहों के बेहतर ग्रीवा ganglia (एससीजी) से अलग में वृक्ष के समान विकास को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Protocol
1. संस्कृति मध्यम की तैयारी (C2 मध्यम)
- निम्नलिखित जोड़ने के लिए, सूचीबद्ध क्रम में एक बाँझ, डिस्पोजेबल 500 मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी:
राशि घटक अंतिम एकाग्रता 190 मिलीग्राम DMEM (कम ग्लूकोज) N / A 10 मिलीलीटर फैटी एसिड मुक्त BSA (DMEM में 20mg/ml) 50 / μg मिलीलीटर 2.8 मिलीग्राम एल-Glutamine 1.4 मिमी 4 मिली इंसुलिन / / transferrin सेलेनियम (100x) 10 μg / मिलीलीटर इंसुलिन 5.5 / μg मिलीलीटर transferrin 38.7 एनएम सेलेनियम 0.4 मिलीग्राम NGF (125 μg / एमएल) 100 एनजी / मिली 200 मिलीलीटर एफ 12 हैम N / A - धीरे टी भंवरओ मिश्रण और 17 x 100 बाँझ तस्वीर टोपी ट्यूब में ट्यूब प्रति अशेष भाजक 10 मिली.
- स्टोर -80 में डिग्री सेल्सियस
- महत्वपूर्ण नोट:
- NGF तुरंत उपयोग करने से पहले पिघलना.
- NGF स्टॉक समाधान aliquoting करने से पहले precoat प्रोटीन के साथ टिशू कल्चर प्लास्टिक सीरम वैज्ञानिक pipet की आंतरिक दीवारों को कम करने के लिए NGF की प्लास्टिक से चिपके हुए. सबसे आसान तरीका DMEM बीएसए कई बार युक्त मिश्रण विंदुक है. NGF ट्यूब DMEM मिश्रण के साथ कई बार कुल्ला.
- F-12 पिछले जोड़ें क्योंकि मुक्त सिस्टीन इंसुलिन में डाइसल्फ़ाइड बांड को अस्थिर कर सकते हैं.
- खंडों में 10 से अधिक मिलीग्राम स्थिर नहीं है क्योंकि Capo 4 क्रिस्टल फार्म कर सकते हैं
- क्या सी 2 अधिक से अधिक 2 बार के माध्यम नहीं फ्रीज पिघलना.
2. ग्लास Coverslips की तैयारी
- हमने पाया है कि केवल ठीक जर्मन कांच coverslips के इस प्रोटोकॉल में लगातार काम (सिफारिश स्रोत और सूची संख्या के लिए 1 तालिका देखें).
- 300 मिलीलीटर कांच की बोतलें नमूना polytetrafluoroethylene (PTFE या Teflon) ढक्कन liners के (फिशर # 09-911-765 सूची) के साथ 70% की नाइट्रिक एसिड के 75-100 मिलीग्राम जोड़ें.
- दस्ताने पहने हुए, ड्रॉप एक नाइट्रिक एसिड के समाधान में से एक coverslips. अधिक नहीं 2-3 से coverslips जार के तल पर एक मोटी परत बनाने पर्याप्त coverslips जोड़ें.
- धीरे से अधिक 185 आरपीएम के लिए कंटेनर एक कक्षीय प्रकार के बरतन सेट पर कमरे के तापमान पर 6-8 घंटे के लिए coverslips साथ हिला.
- धूआं हुड में कार्य करना, ध्यान से एसिड छानना और स्थानीय नियमों के अनुसार निपटाने. Coverslips अति शुद्ध ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी के साथ एक बार कुल्ला, तो कंटेनर 75-100 मिलीलीटर पानी जोड़ें. Coverslips कई बार rinsed होना हो सकता है अगर पानी बादल बन जाता है. धीरे से कोई 185 से अधिक rpm के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन सेट पर रात भर कमरे के तापमान पर हिला.
- 3 दिन के एक कुल के लिए नाइट्रिक एसिड / टिशू कल्चर ग्रेड दैनिक पानी के ऊपर अनुक्रम दोहराएँ.
- अंतिम पसानाटिशू कल्चर ग्रेड पानी और पर्याप्त एसीटोन जोड़ने के लिए मुश्किल coverslips कवर.
- इस एसीटोन छानना और ठीक से निपटाने.
- एक 150 मिमी कांच पेट्री डिश coverslips स्थानांतरण. मुश्किल coverslips कवर पर्याप्त एसीटोन जोड़ें. सुनिश्चित करें coverslips पकवान में एक परत में हैं.
- एसीटोन रातोंरात धूआं हुड में लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देते हैं.
- बाँझ बनाना करने के लिए 1.5 घंटे के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर सुखाने ओवन में सेंकना coverslips.
3. संस्कृति के लिए Coverslips की तैयारी
- विच्छेदन से पहले दिन, एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति बाँझ तकनीक का उपयोग कर प्लेट की हर अच्छी तरह से 1 गिलास coverslip तैयार के रूप में ऊपर वर्णित है. प्रत्येक अच्छी तरह से बाँझ समाधान पाली-D-lysine (100 / 0.5 एम Tris बफर, 8 पीएच में मिलीग्राम मिलीग्राम) के 200 μl जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्लेट की दुकान.
- विच्छेदन के दिन, और आदर्श विच्छेदन शुरू करने से पहले, एक अच्छी तरह से पाली - डी - lysine के समाधान महाप्राण (व्यंजन) और एक अच्छी तरह से 5 बार धो लोसाथ बाँझ ग्रेड ऊतक संस्कृति पानी.
- प्रत्येक और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली की दुकान के लिए 200 μl कम ग्लूकोज DMEM जोड़ें. लगभग 1 घंटे चढ़ाना कोशिकाओं से पहले, कम ग्लूकोज DMEM हटाने और 250 μl सी 2 मध्यम जोड़ने के प्रति अच्छी तरह से. पर में 37 स्टोर प्लेट डिग्री सेल्सियस 5 के तहत% सीओ 2 तक कोशिकाओं को चढ़ाया बनने के लिए तैयार हैं.
4. सुपीरियर सरवाइकल नाड़ीग्रन्थि के विच्छेदन और अलगाव
- सहानुभूति न्यूरॉन्स की अलग संस्कृतियों आम तौर पर बेहतर ग्रीवा ganglia के पृथक्करण (एससीजी) जन्म के पूर्व से काटा (भ्रूण दिन 19-21) चूहा पिल्ले द्वारा तैयार कर रहे हैं क्योंकि वहाँ कम glial कोशिकाओं रहे हैं. हालांकि, यह एक ही प्रोटोकॉल जल्दी प्रसव के बाद (1 से 3 दिन पुराना) चूहा पिल्ले या प्रसवकालीन माउस पिल्ले के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है.
- सीओ 2 साँस लेना के माध्यम से गर्भवती चूहा Euthanize के. पेट दाढ़ी और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा को धोने. बाँझ शर्तों के तहत गर्भाशय सींग निकालें और एक बाँझ 150 मिमी पेट्री डिश में गर्भाशय सींग जगह. से बचेंविच्छेदन के दौरान बांध की आंतों या अन्य आंतरिक अंगों को नुकसान पहुँचाए.
- भ्रूण पिल्ले चतनाशून्य करना बर्फ की एक पैन पर पिल्ले के साथ पेट्री डिश रखें. गर्भाशय सींग और एमनियोटिक झिल्ली की मुक्त भ्रूण काटना. कंधे के नीचे midline के साथ एक पिल्ला की रीढ़ की हड्डी कट पिल्ले euthanize. यह भी severs रग Cava, जो एससीजी की विच्छेदन के दौरान मन्या धमनी से खून बह रहा है कम कर देता है. एक बार गर्भाशय सींग का मुफ्त dissected, एक बाँझ लेबोविट्ज़ एल 15 (या किसी भी मध्यम हवा के बफर) मध्यम पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में जगह भ्रूण.
- उनकी पीठ पर एक 150 मिमी पेट्री डिश Sylgard साथ में आधा भरा पर भ्रूण रखें. बाँझ 20 गेज सुई का प्रयोग, छाती और सिर पिन, धीरे से गर्दन, जो एससीजी के विच्छेदन की सुविधा hyperextending.
- Clavicles अवअधोहनुज ग्रंथियों प्रकट स्तर पर गर्दन के साथ midline चीरा. ठीक (संदंश का उपयोग ग्रंथियों निकालें पताओ. 4 या नहीं. Dumont 5) मांसपेशियों की परत को बेनकाब करने के लिए.
- संदंश का प्रयोग करें ठीक करने के लिए इस हंसली पास sternocleidomastoid मांसपेशी कटौती. फिर धीरे से उठा और omohyoid मांसपेशी ट्रेकिआ के लिए अगले काटकर अलग कर देना. यह मांसपेशी बहुत पतली है, तो भी गहराई से काटने के लिए अंतर्निहित मन्या धमनी फाड़ और एससीजी से बचने से बचने के. एक बार इन मांसपेशियों परतों को हटा रहे हैं, मन्या धमनी और vagus तंत्रिका स्पष्ट रूप से दिखाई होना चाहिए.
- एससीजी मन्या धमनी के विभाजन के ठीक नीचे स्थित है. ठीक संदंश (नंबर 4 या कोई 5) का प्रयोग, ऊतक दूर मन्या धमनी की दोनों पक्षों से नाड़ीग्रन्थि बेनकाब काटना कुंद. 2 ठीक संदंश का प्रयोग, मन्या धमनी बस ऊपर समझ और नीचे एससीजी की विजय - स्तम्भ और दुम का समाप्त होता है, क्रमशः, मन्या धमनी की एससीजी ऊपर पड़ी खंड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खुद एससीजी निकालने. यह संभावना है कि इस कदम पर ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि है, जो विकास के इस स्तर पर एससीजी के साथ झूठ भी हटाया जाएगा. ग्रंथिल ganglia identifie हो सकता हैइसके गोल आकार और बड़े vagal से पेश तंत्रिका के द्वारा चाहते हैं. यह एक मन्या धमनी की शाखाओं के साथ स्थित है. इसके विपरीत, एससीजी आकार बादाम है और मन्या धमनी के बंटवारे के तहत सीधे झूठ. एक बाँझ 35 मिमी एल 15 मध्यम और एंटीबायोटिक दवाओं युक्त संस्कृति पकवान में विच्छेदित ऊतक रखें. अगले कदम के लिए प्रगति से पहले सभी पिल्ले से के एससीजी निकालें.
- ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे मन्या धमनी और किसी भी अन्य ऊतकों को हटाया से विच्छेदन (विशेष रूप से vagus तंत्रिका और ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि) के दौरान एससीजी अलग. ठीक संदंश ganglia से कैप्सूल हटाने का उपयोग करें. यह बहुत संस्कृति में nonneuronal कोशिकाओं की संख्या कम कर देता है. एक और बाँझ 35 मिमी एल 15 मध्यम युक्त पकवान ganglia स्थानांतरण.
- एससीजी अलग कर देना, एल -15 मध्यम हटाने और 2 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल) Collagenase / कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त हांक संतुलित नमक समाधान में Dispase (अंतिम एकाग्रता 5 मिलीग्राम / एमएल) के साथ बदलें. Incuba37 ° C पर 40 मिनट के लिए ते.
- एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब एससीजी स्थानांतरण और मात्रा BSA (अंतिम एकाग्रता 1-2 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पूरक L-15 के साथ 10 मिलीलीटर तक लाने के. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और BSA साथ पूरक L-15 के साथ एक बार धोना.
- दूसरे धोने के बाद, सभी एल 15 को हटा दें और सी 2 मध्यम ~ 2 मिलीलीटर में ganglia resuspend. एक आग पॉलिश तुला टिप विंदुक का उपयोग कोशिकाओं महीन चुर्ण बनाना, सुनिश्चित करें कि पिपेट BSA/L15 साथ लेपित है पहले विचूर्णन कोशिकाओं के गिलास से चिपके हुए कम से कम कर सकते हैं. धीरे 3-4 बार महीन चुर्ण बनाना. बड़े clumps के बारे में 1 मिनट के लिए व्यवस्थित और एक 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण. शेष एससीजी अधिक C2 मीडिया जोड़ें और महीन चुर्ण बनाना. दे clumps को बसने के बाद, दूसरे विचूर्णन से पहले विचूर्णन के बाद एकत्र की है कि सेल निलंबन हस्तांतरण. इस प्रक्रिया को कई बार दोहराएँ जब तक ganglia ज्यादातर अलग हैं. डीचौथे विचूर्णन के बाद किसी भी शेष clumps iscard.
- चूहा पिल्ले (आम तौर पर 12-16 पिल्ले) के एक कूड़े से अलग कोशिकाओं के लिए, अतिरिक्त सी 2 मध्यम जोड़कर 8-10 मिलीग्राम सेल निलंबन में मध्यम की कुल मात्रा लाने के लिए. धीरे एक विंदुक का उपयोग कोशिकाओं resuspend और सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए एक छोटे से अशेष भाजक को हटा दें. सेल निलंबन की मात्रा समायोजित करने के लिए सेल संस्कृति में वांछित घनत्व 2x प्राप्त करने के लिए, और फिर,, अशेष भाजक सेल निलंबन के 250 मिलीग्राम प्रति अच्छी तरह से निलंबन में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा. वृक्ष के समान विकास के morphometric अध्ययन के लिए, हम आम तौर पर कम घनत्व पर थाली (~ एक्स 10 4 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से 5) 24 अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं.
- हमारे कांच desiccators बजाय सीधे सीओ 2 इनक्यूबेटर में एससीजी प्रयोगशाला संस्कृतियों incubates. हम ऐसा करते हैं क्योंकि सहानुभूति सीरम मुक्त मध्यम में हो न्यूरॉन्स एक से थोड़ा अधिक सीओ 2 एकाग्रता (लगभग 6.5%) के साथ बेहतर प्रदर्शन. इसके अलावा हम ओ में एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग नहीं करतेउर मीडिया के बाद से यह neurite परिणाम और desiccators में संस्कृतियों को बनाए रखने रोकता संदूषण के प्रसार के लिए कम से कम अगर यह संस्कृतियों का एक सबसेट में विकसित करने के लिए लगता है. इस प्रणाली का उपयोग करना, हम नियमित रूप से 8 सप्ताह के लिए एससीजी संस्कृतियों को बनाए रखने. एक बार चढ़ाया, एससीजी संस्कृतियों गिलास नीचे में बाँझ पानी युक्त desiccators में चीनी मिट्टी के बरतन desiccator थाली पर रखा जाता है. सीओ 2 के लगभग 120 मिलीलीटर desiccator में इंजेक्ट किया जाता है पूर्व में 35.5 डिग्री सेल्सियस के लिए सील बंद और एक मशीन सेट में पूरे desiccator रखने के लिए
5. दूध पिलाने की और संस्कृति का रखरखाव
- संस्कृतियों आम तौर पर 3 बार एक सप्ताह पहले मीडिया विनिमय चढ़ाना के बाद 24 घंटे घटनेवाला के साथ, तंग आ चुके हैं. एक बाँझ तुला टिप विंदुक का प्रयोग, धीरे से अच्छी तरह से प्रति मीडिया के बारे में आधा वापस ले लें. एक साफ बाँझ तुला टिप विंदुक का प्रयोग, ताजा C2 के साथ हटा मध्यम की मात्रा की जगह.
- संस्कृति से गैर neuronal कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, विरोधी mitotic एजेंट CYTosine डी arabinofuranoside (ए आर ए सी, अंतिम 1-2 एकाग्रता माइक्रोन) आम तौर पर पहले मीडिया विनिमय में संस्कृति के 48 घंटे के लिए (जैसे, चढ़ाना के बाद 24 घंटे) मध्यम करने के लिए जोड़ा जाता है. ए आर ए सी का यह एकाग्रता आमतौर पर सभी गैर neuronal कोशिकाओं को दूर करने के लिए पर्याप्त है. यदि अतिरिक्त उपचार ए आर ए सी की आवश्यकता है, यह सिफारिश की है कि इन हर दूसरे खिला न्यूरॉन्स पर विषाक्त प्रभाव को कम किया जाना है.
6. Matrigel या BMP-7 के साथ वृक्ष के समान विकास उत्प्रेरण
- वृक्ष के समान विकास को प्रेरित करने के लिए, Matrigel या BMP-7 संस्कृतियों के लिए जोड़ा जाता है के बाद गैर neuronal कोशिकाओं का सफाया कर दिया गया है और संस्कृतियों में ए आर ए सी के स्तर में काफी कम कर रहे हैं. आमतौर पर, हम इन विट्रो में 5 दिन माध्यम Matrigel या BMP-7 जोड़ने के लिए, लेकिन वृक्ष के समान विकास Matrigel या बीएमपी -7 इन विट्रो में किसी भी समय बिंदु पर जोड़ा द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. Matrigel या BMP-7 C2 के माध्यम से जोड़ा जाता है और संस्कृतियों के रूप में ऊपर वर्णित है तंग आ चुके हैं.
- Matrigel और BMP प्रेरित वृक्ष के समान वृद्धि समय हैऔर एकाग्रता पर निर्भर है. अधिक से अधिक प्रभाव के लिए, Matrigel सी 2 50-75 μg / एमएल के अंतिम एकाग्रता में जोड़ा जाता है, बीएमपी -7 50 एनजी / मिली की एक अंतिम एकाग्रता पर C2 के माध्यम से जोड़ा जाता है. 100 से अधिक μg / एमएल या BMP-7 100 से अधिक सांद्रता के Matrigel सांद्रता एनजी / एमएल के neuronal विषाक्तता के कारण का उल्लेख किया गया है. वृक्ष के समान प्रक्रियाओं (के रूप में रूपात्मक मापदंड से निर्धारित) Matrigel या BMP-7 के लिए प्रारंभिक निवेश से ज़्यादा से ज़्यादा प्रभावी मात्रा में लगभग 48 घंटे के बाद स्पष्ट हो गया है. मजबूत वृक्ष के समान विकास को प्रेरित करने के लिए, संस्कृतियों हर खिला बीएमपी -7 में मध्यम युक्त के साथ तंग आ चुके हैं. बराबर परिणाम तुलनीय 20,21 सांद्रता में 2 BMPs, 4, 5 और 6 का उपयोग करने प्राप्त किया गया है.
7. बीएमपी 7 प्रेरित वृक्ष के समान विकास के immunocytochemical विश्लेषण
- जब वृक्ष के समान द्रुमायण की वांछित हद तक हासिल किया गया है, संस्कृतियों 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 4% paraformaldehyde का उपयोग कर तय कर रहे हैं. सबसे अच्छा निर्धारण एक4% paraformaldehyde के साथ अच्छी तरह से आधा मध्यम जगह है और इस कदम को 10-15 मिनट में 3-5 बार दोहरा द्वारा chieved.
- 15 मिनट फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ 1/2 4% paraformaldehyde की जगह है और इस कदम के 10 से अधिक तीन बार दोहरा द्वारा संस्कृतियों कुल्ला.
- सभी पीबीएस निकालें और एक अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize के लिए 200 μl 0.1% पीबीएस में X-100 ट्राइटन.
- आकांक्षा द्वारा ट्राइटन समाधान निकालें और 200 प्रति अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान बफर (पीबीएस 3-5% BSA और 1% बकरी सीरम के साथ पूरक) μl जोड़ें. कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए सेते हैं.
- अवरुद्ध बफर निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी, microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) 1:2000 में पतला जोड़ने अवरुद्ध बफर में 1:5000. कमरे के तापमान या 4 बजे रात डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए संस्कृतियों को सेते हैं
- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें, कमरे के तापमान पर पीबीएस तीन बार के साथ संस्कृतियों 15 मिनट पर धो.
- माध्यमिक पीबीएस में पतला एंटीबॉडी के साथ संस्कृतियों सेते हैं अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए 1% BSA के साथ पूरक.
- माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और पीबीएस अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट से अधिक तीन बार के साथ संस्कृतियों धोने.
- कांच पर माउंट coverslips के सेल ओर स्लाइड नीचे जलीय बढ़ते मध्यम की एक बूंद में माध्यमिक एंटीबॉडी टैग fluorochrome के लिए उचित पीएच. कमरे के तापमान पर स्लाइड रात भर रखने के लिए बढ़ते मध्यम शुष्क करते हैं. 4 में स्टोर स्लाइड ° C इमेजिंग तक.
- स्लाइड इमेजिंग से पहले कमरे के अस्थायी संतुलित करना करने के लिए अनुमति देते हैं. मोल फ्लोरोसेंट चरण विपरीत epifluorescence के लिए सुसज्जित खुर्दबीन छवियों का उपयोग कर. आमतौर पर, एक न्यूरॉन के पूरे वृक्ष के समान कुंज एक में 20X उद्देश्य और उचित फिल्टर का उपयोग कर कब्जा किया जा सकता है.
8. प्रतिनिधि परिणाम
सहानुभूति प्रसवकालीन आर ए के एससीजी से अलग न्यूरॉन्सटीएस और सीरम और ganglionic glial कोशिकाओं के अभाव में हो MAP2 immunopositive प्रक्रियाओं (चित्रा 1) का विस्तार करने में विफल है, बल्कि, आम तौर पर केवल एक ही axonal 14,15 प्रक्रिया का विस्तार. बीएमपी 7 (चित्र 1) या Matrigel एक्सपोजर कई प्रक्रियाओं है कि 17,18 dendrites के रूपात्मक, जैव रासायनिक और कार्यात्मक मानदंडों को पूरा करने के गठन को प्रेरित करता है. या तो Matrigel या BMP-7 की गतिविधि dendrite को बढ़ावा देने के एकाग्रता और 17,18,20 समय पर निर्भर है. अधिक से अधिक वृक्ष के समान विकास के बीच 50 और 75 μg / एमएल या BMP-7 30 और 100 के बीच एनजी / एमएल, और आधे से अधिक से अधिक प्रभाव आम तौर पर बीएमपी सात ~ 2 एनजी / एमएल की सांद्रता में मनाया जाता है Matrigel की सांद्रता का उपयोग कर मनाया जाता है. हालांकि, वृक्ष के समान विकास में महत्वपूर्ण परिवर्तन बीएमपी -7 300 स्नातकोत्तर / एमएल के रूप में कम के रूप में सांद्रता के साथ पता लगाया जा सकता है. या तो Matrigel या BMP-7 वृक्ष के समान प्रतिक्रिया अपेक्षाकृत धीमी <न्यूरॉन्स की 50% या तो dendrite पी प्रदर्शन के बाद 24 घंटे के भीतर दूसरी प्रक्रिया के गठन के साथ, एजेंट romoting. हालांकि, प्रारंभिक बीएमपी 7 जोखिम के बाद 3 दिन के भीतर, लगभग सभी न्यूरॉन्स ज़्यादा से ज़्यादा प्रभावी Matrigel या बीएमपी -7 की सांद्रता का जवाब. न्यूरॉन्स प्रति dendrites के संख्या बीएमपी -7 निरंतर प्रदर्शन के साथ वृद्धि हुई है, उपचार के पहले 10 दिनों के दौरान होने वाली परिवर्तन के अधिकांश के साथ जारी है. 4 सप्ताह के बाद, बीएमपी 7 इलाज न्यूरॉन्स आम तौर पर 6-8 प्राथमिक dendrites कि माध्यमिक, तृतीयक और चतुर्धातुक भी वृक्ष के समान शाखाओं 17 एक्ज़िबिट है. वृक्ष के समान कुंज में यह वृद्धि axonal विकास में कोई महत्वपूर्ण बदलाव के अभाव में होता है, और तुलनीय वृक्ष के समान प्रतिक्रिया 2 BMPs, 4, 5 या 6 20,21 के समान सांद्रता का उपयोग हासिल किया जा सकता है. वृक्ष के समान विकास भी अंतर्जात ganglionic glial कोशिकाओं 15,22 के साथ सह संवर्धन सहानुभूति न्यूरॉन्स द्वारा हासिल किया जा सकता है, तथापि, वृक्ष के समान प्रतिक्रिया इन परिस्थितियों में काफी धीमी है.
. Jpg />
चित्रा 1 बीएमपी -7 सुसंस्कृत सहानुभूति न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान विकास को बढ़ावा देता है. गैर neuronal कोशिकाओं इन विट्रो में 48 दिन 2 घंटे शुरुआत के लिए विरोधी mitotic के साथ इलाज के द्वारा संस्कृतियों एससीजी से सफाया कर रहे थे. इन विट्रो में 5 दिन की शुरुआत, संस्कृतियों या तो नियंत्रण (ए) 50 एनजी / एमएल (बी) पर मध्यम या मध्यम बीएमपी -7 के साथ पूरक के साथ इलाज किया गया. इन विट्रो (बीएमपी उपचार के 5 दिनों के बाद) में 11 दिन पर, के संस्कृतियों मैब के साथ MAP2 के खिलाफ immunostained किया गया, एक प्रोटीन dendrites और neuronal somata है में मुख्य रूप से पाया गया. जैसा प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति photomicrographs में दिखाया गया, नियंत्रण की शर्तों के तहत हो न्यूरॉन्स dendrites के रूप में में एमएपी-2 immunopositive प्रक्रियाओं dendrites की कमी (ए) के द्वारा evidenced की कमी है, इसके विपरीत में, न्यूरॉन्स बीएमपी -7 उजागर करने के लिए (बी) आम तौर पर कई पतला एमएपी-2 immunopositive, dendrites.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस मॉडल के लाभ में शामिल हैं: (क) संस्कृतियों सहानुभूति अन्य सेल 17,23 प्रकार के विहीन न्यूरॉन्स की एक समरूप जनसंख्या के शामिल हैं, (ख) सहानुभूति न्यूरॉन्स की वृद्धि कारक आवश्यकताओं को अच्छी तरह से स्थापित है, जो के उपयोग की अनुमति देता है मध्यम परिभाषित है, और परिभाषित मीडिया की एक किस्म है, और substrates बढ़ रही है और सहानुभूति न्यूरॉन्स को बनाए रखने 23 के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, (ग) इन संस्कृतियों में न्यूरॉन्स Matrigel, BMP-7 और DPP की अन्य BMPs गतिविधि dendrite बढ़ावा देने के लिए समान रूप से जवाब और 60A से 17,18,20,21 subfamilies, और (घ) Matrigel या dendrite बीएमपी प्रेरित गठन सेल अस्तित्व या axonal 17,18 विकास में परिवर्तन के अभाव में होता है. इस मॉडल की अनुमति देता है जब वृक्ष के समान विकास शुरू हो रहा है की प्रयोगात्मक नियंत्रण है, जो यह वृक्ष के समान विकास, उदाहरण के अलग चरणों में न्यूरॉन्स की आबादी सिंक्रनाइज़ प्राप्त करने के लिए संभव बनाते हैं, dendrites के तुरंत प्राथमिक dendr के दौरान गठन, पूर्ववर्ती(प्राथमिक dendrites के प्रारंभिक गठन) itogenesis और वृक्ष के समान परिपक्वता के बाद के चरणों के दौरान. मॉडल का सबसे महत्वपूर्ण सीमाओं शाही सेना और एक लिटिर, जो जैव रासायनिक अध्ययन को सीमित कर सकते हैं और जीन की अभिव्यक्ति से छेड़छाड़ करने में कुछ कठिनाई का एक विशिष्ट विच्छेदन से उपलब्ध प्रोटीन की सीमित मात्रा में शामिल हैं. प्राथमिक neuronal सेल संस्कृतियों में सीडीएनए व्यक्त करने के लिए तकनीक में हाल के अग्रिमों तेजी बाद इस नुकसान पर काबू पाने रहे हैं. लिपिड आधारित वितरण प्रणाली, nucleofection, और सुसंस्कृत सहानुभूति न्यूरॉन्स को adenoviral वैक्टर के सफल आवेदन रिपोर्टिंग प्रकाशन कर रहे हैं. रिपोर्ट अभिकर्मक क्षमता अपेक्षाकृत कम (आमतौर पर lipofection nucleofection या वायरल संक्रमण के साथ और ऊपर से 30-50% के साथ 10-20% से लेकर), जो रूपात्मक विश्लेषण के रूप में व्यक्तिगत कक्ष का विश्लेषण करती है, पर आधारित endpoints के लिए पर्याप्त है, लेकिन हो सकता है कई जैव रासायनिक endpoints के लिए समस्याग्रस्त है.
कारकों थाबीएमपी प्रेरित सुसंस्कृत सहानुभूति न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान विकास के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं एक बहुत ही उच्च घनत्व सेल में संवर्धन न्यूरॉन्स और संस्कृति मीडिया में सीरम सहित शामिल हैं. कारण यह है कि उच्च घनत्व सेल dendrite BMPs नहीं जाना जाता है की गतिविधि को बढ़ावा देने के attenuates हालांकि, यह संभावना है कि सीरम इस गतिविधि attenuates क्योंकि BMPs उत्सुकतापूर्वक सीरम प्रोटीन के लिए बाध्य है. दिलचस्प है, खुद सीरम सुसंस्कृत सहानुभूति 24 न्यूरॉन्स में कमजोर गतिविधि dendrite को बढ़ावा देने है, और हमारे प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि इस गतिविधि BMPs है, जो सबसे अगर नहीं सभी वाणिज्यिक सीरा मौजूद हैं द्वारा मध्यस्थता है. BMPs Matrigel में भी मौजूद हैं, होने की संभावना है और अपनी गतिविधि को बढ़ावा देने के dendrite मध्यस्थता. एक तीसरा कारक है कि BMPs की गतिविधि dendrite बढ़ावा देने को प्रभावित कर सकता अनुचित हैंडलिंग और BMPs का भंडारण है. कम से कम 0.1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर बीएमपी स्टॉक समाधान की दुकान मत करो. यह महत्वपूर्ण है बीएमपी शेयर या काम कर रहे समाधान बहुत ही बुनियादी बनने के लिए नहीं है और हम कि buf की सिफारिशस्टॉक समाधान को कमजोर करने के लिए इस्तेमाल किया फर्स 4.5 के पीएच ± 0.05 है. सभी समाधान सख्ती aliquoting से पहले लेकिन मिश्रण नहीं इतनी सख्ती कि फोम समाधान, और केवल polypropylene के ट्यूबों का उपयोग करें क्योंकि BMPs अन्य प्लास्टिक के लिए छड़ी करते हैं. की दुकान है क्योंकि तापमान की साइकिल बीएमपी -7 की गतिविधि को नष्ट करने के लिए पर्याप्त नहीं है कि एक स्वत: defrost सुविधा फ्रीजर में aliquots. यह अनुशंसा की जाती है कि बीएमपी समाधान -80 में संग्रहीत किया जा डिग्री सेल्सियस और कि फ्रीज कम से कम किया जा विगलन (हम अधिक से अधिक 2-3 बार स्थिर नहीं गल नहीं है). इसी तरह की सावधानियों Matrigel से निपटने में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, यह अनुशंसा की जाती है कि Matrigel धीरे धीरे 4 में से thawed जा डिग्री सेल्सियस Matrigel वृक्ष के समान विकास को प्रेरित नहीं जब precoat substrates के लिए चढ़ाना न्यूरॉन्स के लिए पहले प्रयोग किया जाता है, यह केवल प्रभावी जब स्थापित neuronal सेल 18 संस्कृतियों के संस्कृति के माध्यम से जोड़ा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (अनुदान NS45037 R21 और R01 ES014901) से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco Glass | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco Glass | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | GIBCO, by Life Technologies | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche Group | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Laboratories | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Molecular Probes, Life Technologies | P7481 |
References
- Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. , Harvard University Press. (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
