Summary
Bu seçici perinatal sıçan üstün servikal gangliya (SCG) ayrışmış primer sempatik nöronlar, dendritik büyümesini teşvik etmek için kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7) veya Matrigel kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Dendritik çardak şekli bir nöron 1-3 alabilirsiniz toplam sinaptik girdi belirler ve türleri ve bu girişlere 4-6 dağılımı etkiler. Dendritik büyüme ve plastisite Altered desen deneysel modellerde 7 bozulmuş nörodavranışsal fonksiyonu ile ilişkilidir ve nörogelişimsel bozukluklar 8-10 ve nörodejeneratif hastalıkların 11-13 hem de görülen klinik belirtiler katkıda düşünülmektedir. Bu gözlemler kesin dendritik morfoloji düzenleyen fonksiyonel öneminin altını ve dendritik büyümesini kontrol mekanizmalarının belirlenmesi sadece normal gelişimi sırasında nasıl düzenlendiği sinirsel bağlantıda anlayışını ileriye değil, aynı zamanda çeşitli nörolojik hastalıklar için yeni tedavi stratejileri üzerinde fikir verir olabileceğini düşündürmektedir.
Dendritik büyüme Mekanik çalışmalar büyük ölçüde durumu o tarafından kolaylaşırdınöronlar deneysel onlar kendi vivo nüsha ile kıyaslanabilir bir dendritik çardak detaylandırmak hangi birine dendritler uzatmak değil bir devlet değişimi yapılmasına olanak fa modeli sistemi. Perinatal kemirgenler üstün servikal gangliya (SCG) ayrışmış sempatik nöronların primer kültürlerinde böyle bir model oluşturacaktır. Serum ve ganglionik gliyal hücreleri yokluğunda tanımlandığı besiyerine zaman, sempatik nöronlar akson olan tek bir süreç uzanır ve bu durum unipolar kültürü 14,15 in ay hafta sürer. Bununla birlikte, kültür ortamına ya kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7) veya 16,17 Matrigel 18 ilavesiyle dendritler için morfolojik, biyokimyasal ve fonksiyonel kriterlerini karşılamak birden çok işlem genişletmek için, bu nöronlar tetikler. Sempatik perinatal kemirgen SCG ayrışmış nöronlar ve tanımlanmış koşullar altında yetiştirilen nöronların 19 homojen bir nüfus vardırMatrigel, BMP-7 ve decapentaplegic (DPP) ve 60A alt familyaya 17,18,20,21 diğer BMP ve dendrit terfili aktivite düzgün cevap verdiğini. Önemli olarak, Matrigel-ve BMP indüklenen dendrit oluşumu hayatta hücre büyümesi ya akson 17,18 değişiklik olmaksızın ortaya çıkar.
Burada, biz onlar Matrigel veya BMP seçici dendrit destekleyici aktivite duyarlı böylece perinatal sıçanların SCG türetilen sempatik nöronların ayrışmış kültürleri nasıl ayarlanacağını açıklar.
Protocol
1. Kültür ortamının hazırlanması (C2 ortamı)
- Steril, tek kullanımlık 500 ml Erlenmeyer şişesine, listelenen sırada, aşağıdakileri ekleyin:
Miktar Bileşen Nihai konsantrasyon 190 ml DMEM (düşük glukoz) N / A 10 ml yağ asidi serbest BSA (DMEM 20mg/ml) 50 mcg / ml 2.8 ml L-Glutamine 1.4 mM 4 ml insülin / transferrin / selenyum (100x) 10 ug / ml insülin 5.5 ug / ml transferrin 38.7 nM selenyum 0.4 ml NGF (125 ug / ml) 100 ng / ml 200 ml Ham F-12 N / A - Yavaşça t Swirl17 x 100 steril ek kap tüplerde tüp başına o mix ve tablet 10 ml.
- -80 At ° C'nin
- Önemli notlar:
- Kullanımı hemen önce NGF çözülmesini sağlayın.
- NGF stok solüsyon aliquoting önce, astar öncesi protein ile doku kültürü plastik serolojik pipet iç duvarları plastik NGF yapışmasını en aza indirmek için. Kolay yaklaşım BSA ihtiva eden birkaç kez DMEM karışımı Pipeti etmektir. DMEM karışımı ile NGF tüpü birkaç kez çalkalayın.
- Ücretsiz sistein insülin disülfür bağları istikrarsızlaştırmak olabilir, çünkü F-12 son ekleyin.
- Capo 4 kristaller oluşabilir, çünkü cilt olarak daha büyük 10 ml Dondurmayın
- 2 kat daha fazla C2 orta donma-çözülme etmeyin.
2. Cam lameller hazırlanması
- Biz sadece ince Alman cam lamelleri (önerilen kaynak ve katalog numarası için bkz Tablo 1) Bu protokolde sürekli çalışmak bulduk.
- Politetrafloroetilen (PTFE veya Teflon) kapak gömlekleri (Fisher katalog # 09-911-765) ile 300 ml cam şişe numune için% 70 nitrik asit 75-100 ml ekleyin.
- Eldiven, damla, nitrik asit çözeltisinin içine tek tek lamelleri. Kavanozun dibinde üzerinde hiçbir 2-3 lamelleri daha kalın bir katman yaratmak için yeterli lamelleri ekleyin.
- Yavaşça fazla 185 den rpm orbital çalkalayıcı sette oda sıcaklığında 6-8 saat lamelleri ile kaplar sallayın.
- Bir çeker ocak çalışarak, dikkatle asit boşaltacaktır ve yerel düzenlemelere göre atın. Ultra saf doku kültürü dereceli su ile bir kez lamelleri durulayın, daha sonra konteyner 75-100 ml su ekleyin. Su bulanık hale gelirse lameller birden çok kez durulanmalıdır olabilir. Yavaşça en fazla 185 rpm orbital çalkalayıcı sette gece boyunca oda sıcaklığında sallayın.
- 3 gün toplam nitrik asit / günlük doku kültürü dereceli su üstünde tekrarlayın.
- Nihai boşaltacaktırdoku kültürü dereceli su ve zorlukla lamelleri kapsayacak kadar aseton ekleyin.
- Bu aseton boşaltacaktır ve düzgün atmayın.
- 150 mm cam petri için lamelleri aktarın. Ancak lamelleri kapsayacak kadar aseton ekleyin. Lamelleri çanak tek bir katmanda olduğundan emin olun.
- Aseton bir çeker ocak gecede buharlaşmasına izin verin.
- Sterilize etmek için 1.5 saat boyunca 180 ° C'de bir kurutma fırında lamelleri.
3. Kültür lameller hazırlanması
- Diseksiyon bir gün önce, steril bir teknik kullanılarak, bir 24 gözlü doku kültürü plakası, her sıra için 1 cam coverslip (yukarıda anlatıldığı gibi hazırlanan) ilave edilir. Her oyuğa steril bir poli-D-lizin solüsyonu (0.5 M Tris tampon pH 8 içinde 100 mg / ml), 200 ul ekleyin ve 4 ° C'da gece boyunca levha depolamak.
- Diseksiyon gün ve ideal diseksiyon başlamadan önce, her bir kuyudan poli-D-lizin çözüm aspire ve her iyi 5 kez yıkayınsteril doku kültürü dereceli su ile.
- ° C inkübatör 37 her plaka ve mağaza için 200 ul düşük glukoz DMEM ekleyin. Kaplama hücreleri önce yaklaşık 1 saat, düşük glukoz DMEM kaldırmak ve 250 ul C2 orta başına da ekleyin. 37 Mağaza plakaları ° C'de% 5 CO 2 altındaki hücreleri kaplı olmalıdır hazır olana kadar.
4. Diseksiyon ve Üstün Servikal ganglion İzolasyonu
- Daha az gliyal hücreleri vardır, çünkü sempatik nöronlar ayrışmış kültürler, genellikle prenatal hasat üstün servikal gangliya çözülmesi (SCG) (embriyonik günde 19-21) sıçan yavru ile hazırlanır. Ancak bu aynı protokolü erken postnatal (1 ila 3 gün önce) sıçan yavrularına veya perinatal fare yavruları başarıyla kullanılabilir.
- CO 2 inhalasyon yoluyla gebe sıçan Euthanize. Karın Tıraş ve% 70 etanol ile cildinizi yıkayın. Steril şartlarda laparotomi çıkarın ve steril bir 150 mm Petri kabındaki laparotomi yerleştirin. ÖnlemekDiseksiyon sırasında bağırsak veya barajın diğer iç organların zarar.
- Embriyonik yavrular uyutmak için bir buz kabı üzerine yavrular ile Petri yerleştirin. Uterin boynuz ve amniyon zarının serbest embriyolar parçalara ayır. Yavrular euthanize için omuz altında orta hat boyunca her yavru, omuriliğin kesin. Bu aynı zamanda SCG diseksiyonu sırasında karotid arterden kanama azaltır vena kava, keserse. Bir kez penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş steril bir Leibovitz L-15 orta (veya herhangi bir hava tamponlu ortama) yer embriyolar, uterin horn serbest kesilmiştir.
- 150 mm petri Sylgard ile yarım dolu sırtlarını üzerinde embriyo yerleştirin. Steril 20 gauge iğneler kullanarak, hafifçe SCG diseksiyonu kolaylaştırır boyun, hyperextending, göğüs ve kafa pin.
- Submandibular bezleri ortaya çıkarmak için clavicles seviyesinde boyun orta hattan bir kesik boyunca edin. Ince forseps (kullanarak bezleri çıkarın no. 4 ya da hiç. 5 Dumont) kas tabakası açığa çıkarmak.
- Klavikula yakın sternokleidomastoid kası kesmek için ince forseps kullanın. Sonra yavaşça kaldırın ve trakea yanında omohyoid kas sarın. Bu kas çok ince, bu nedenle altta yatan karotis arter yırtılma ve SCG önlemek için çok derin kesme kaçının. Bu kas tabakaları yok olduktan sonra, karotis arter ve vagus siniri açıkça görünür olmalıdır.
- SCG sadece karotis arter bifurkasyon altında yatıyor. Ince forseps (no. 4 veya 5 no.) Kullanarak, ganglion açığa karotis arter her iki uzak doku diseke künt. 2 ince forseps kullanılarak, yukarıda SCG uzanan karotid arterinin bölümü olarak kendisini SCG kaldırmak için, sırası ile, hemen yukarıda karotid arteri kavramak ve aşağıda SCG arasında rostral ve kuyruk uçları. Bu gelişme bu aşamada SCG boyunca uzanır boğumlu ganglion, aynı zamanda bu aşamada kaldırılacak olması muhtemeldir. Boğumlu ganglion identifie olabilirYuvarlak şekli ve çıkıntı büyük vagal sinir tarafından d. Bu karotis arter dallarından biri boyunca uzanır. Bunun aksine, SCG badem şeklindedir ve karotid arterinin çatallaşma doğrudan altına alır. L-15 orta ve antibiyotik içeren steril 35 mm'lik kültür kabına disseke doku yerleştirin. Sonraki adımlara ilerleyen önce tüm yavrular gelen SCG çıkarın.
- Ince forseps kullanarak hafifçe diseksiyon (özellikle vagus siniri ve boğumlu ganglion) sırasında karotis arter ve kaldırılan diğer dokulardan SCG ayırın. Gangliondan kapsül kaldırmak için ince pens kullanın. Bu büyük ölçüde kültüründe nöron dışı hücre sayısı azalır. L-15 orta içeren başka bir steril 35 mm çanak ganglionlarda aktarın.
- SCG ayırmak için, L-15 orta kaldırmak ve kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hank'in dengeli tuz çözeltisi içinde 2 ml Kollajenaz (nihai konsantrasyon: 1 mg / ml) / Dispase (nihai konsantrasyonu 5 mg / ml) ile değiştirir. Inkübasyon40 dakika boyunca 37 ° C'de te.
- 15 ml steril bir konik bir santrifüj tüpüne aktarılır ve SCG BSA (nihai konsantrasyon 1-2 mg / ml) ile takviye L-15 ile 10 ml hacim getirmek. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 200 x g'de santrifüje. Süpernatant atın ve BSA ile takviye L-15 ile bir kez daha yıkayın.
- İkinci yıkamadan sonra, tüm L-15 kaldırmak ve C2 orta ~ 2 ml gangliya tekrar süspansiyon. Bir yangın cilalı bükük ucu pipet ile hücreleri öğütmek, triturasyonun cam hücre yapışmasını en aza indirmek için önce pipetle BSA/L15 kaplı olduğundan emin olun. Hafifçe 3-4 kez çiğnemek. Büyük topaklar yaklaşık 1 dakika boyunca çözmek ve bir 15 ml konik tüpe hücre süspansiyonu aktarmak izin. Kalan SCG daha C2 medya ekleyin ve çiğnemek. Topaklar yerleşmek verildikten sonra, ikinci triturasyonun gelen birinci triturasyonun sonra toplanmıştır olduğu üzere hücre süspansiyonu transfer. Ganglia çoğunlukla uzaklaşılmış, kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. DDördüncü triturasyonun sonra kalan topaklar iscard.
- Sıçan yavrusu (tipik olarak 12-16 PUP) bir altlık ayrışmış hücreleri için, ek bir C2 ortamı eklenerek 8-10 ml hücre süspansiyonu olarak orta toplam hacme getirmek. Hafifçe bir pipet kullanılarak tekrar süspansiyon hücreleri ve hücre yoğunluğu belirlemek için, küçük bir alikotu kaldırın. Süspansiyon, hücre süspansiyonu alikotu 250 ml başına ayrıca hücreleri korumak için emin olmak, daha sonra arzu edilen kültür hücre yoğunluğu elde 2X, ve hücre süspansiyonu hacmini ayarlamak. Dendritik büyüme morfometrik çalışmalar için, 24 kuyucuğu düşük yoğunluklu biz genellikle plak hücreleri (kisi iyi ~ 5 x 10 4 hücreli).
- Bizim laboratuvar cam Desiccators yerine doğrudan CO 2 inkübatörde SCG kültürleri kuluçkaya. Serumsuz ortamda yetişen sempatik nöronlar biraz daha yüksek CO2 konsantrasyonu (yaklaşık% 6.5) daha iyi performans için bu yapılmaktadır. Ayrıca biz o antibiyotik kullanmayınur medya bunu akson uzantısı ve Desiccators sürdürme kültürlerini inhibe çünkü kültürlerin bir alt kümesi olarak geliştiğinde kontaminasyon yayılmasını en aza indirmek gibi görünüyor. Bu sistemi kullanarak, rutin kadar 8 hafta için SCG kültürleri korumak. Bir kez kaplama, SCG kültürleri alt steril su içeren cam Desiccators içinde porselen desikatöre plaka üzerine yerleştirilir. CO 2 yaklaşık 120 ml 35.5 ° C için kapalı mühürleme ve inkübatör seti içine tüm desikatöre vermeden önce desikatöre enjekte edilir
5.. Beslenme ve Kültürleri Bakım
- Kültürler, genellikle ilk medya değişimi ile kaplanmış 24 saat sonra meydana gelen, haftada 3 gün beslenir. Steril bir bent-ucu pipet kullanarak, hafifçe çukur başına medyanın yaklaşık yarısını çekebilirsiniz. Temiz steril bükük ucu pipet kullanarak, taze C2 ile kaldırıldı orta hacimli değiştirin.
- Kültürden nöronal olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için, mitotik ajan, anti-CYTosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, nihai konsantrasyon 1-2 uM), genellikle 48 saat boyunca ilk medya değişimi de kültür ortamı (örneğin, 24 saat sonra kaplama) ilave edilir. ARA-C, bu konsantrasyon, genellikle olmayan tüm nöronal hücreleri çıkarmak için yeterli olur. Ek ARA-C tedavi gerekiyorsa, bu nöronlar üzerine toksik etkileri en aza indirmek için her besleme yapılması tavsiye edilir.
6. Matrigel veya BMP-7 ile Dendritik Büyüme indükleyen
- Dendritik büyümesini teşvik etmek için, non-nöronal hücrelerde elimine edildikten sonra ya da Matrigel BMP-7 kültürler eklenir ve kültürde ARA-C seviyeleri önemli ölçüde azalır. Tipik olarak, bu in vitro 5. günde orta Matrigel veya BMP-7 ekleme, fakat dendritik büyümesi, in vitro bir zaman noktasında eklendi Matrigel veya BMP-7 tarafından indüklenen edilebilir. Matrigel veya BMP-7 C2 ortamına ilave edilir ve yukarıda açıklandığı gibi kültürler beslenir.
- Matrigel ve BMP-indüklenen dendritik büyüme zamanıve konsantrasyon bağımlı. Maksimal etkisi için, Matrigel 50-75 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyon C2 ilave edilir; BMP-7 50 ng / ml' lik nihai bir konsantrasyon C2 besiyerine eklenir. Den daha büyük 100 ug / ml veya 100 den büyük BMP-7 konsantrasyonlarının Matrigel konsantrasyonları ng / ml nöronal toksisite neden olduğu bildirilmiştir. Dendritik süreçler (gibi morfolojik kriterlere göre belirlenir) yaklaşık 48 saat maksimum etkili konsantrasyonlarda Matrigel veya BMP-7 için ilk maruz kaldıktan sonra belirgin hale gelir. Sağlam dendritik büyümesini teşvik etmek için, kültürler BMP-7 her besleme azından orta içeren ile beslenir. Eşdeğer sonuçlar benzer konsantrasyonlarda 20,21 azından BMP'ler 2, 4, 5 ve 6 kullanılarak elde edilmiştir.
7. BMP-7-kaynaklı dendritik Büyüme İmmünositokimyasal Analizi
- Dendritik arborization of istenen ölçüde elde edildikten sonra, kültür 0.1 M fosfat tampon içinde% 4 paraformaldehit ile sabitlenir. En iyi fiksasyon bir% 4 paraformaldehit iyi yarısı orta yerine ve 10-15 dakika da bu işlem 3-5 defa tekrarlayarak chieved.
- 15 dakika - fosfat tamponlu salin (PBS) ile yarım% 4 paraformaldehit değiştirilmesi ve 10 üzerinde bu adımı üç kez tekrarlayarak kültürleri durulayın.
- Tüm PBS kaldırmak ve hücreler geçirgenliği, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, her sıra için 200 ul% 0.1 Triton X-PBS ile 100 ekleyin.
- Aspirasyon Triton çözüm çıkarın ve 200 ul başına iyi engelleme tampon solüsyonu (PBS% 3-5 BSA ve% 1 keçi serumu) ekleyin. Oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe.
- Engelleme tamponu çıkarın ve 1:2000 oranında sulandırılmış primer antikor, mikrotübül ilişkili protein-2 (map2) ekleyin - tampon engelleme 1:5000. 4 de bir gece boyunca oda sıcaklığında ya da ° C'de 1 saat boyunca inkübe kültürler
- Primer antikor çözeltisi kaldır, oda sıcaklığında 15 dakika zarfında üç kere PBS ile kültür yıkanır.
- PBS ile seyreltilerek sekonder antikor ile birlikte inkübe kültürler karanlık oda sıcaklığında 1-2 saat için% 1 BSA ile desteklenmiş.
- Sekonder antikor çözümü çıkartın ve karanlık oda sıcaklığında 10-15 dakika içinde üç kez PBS ile kültürler yıkayın.
- Cam hakkında Mount lamelleri sekonder antikor tagged florokrom için uygun pH sulu montaj orta bir damla hücre tarafı aşağı kayar. Montaj orta kuruması için oda sıcaklığında bir gece slaytları tutun. 4 saklayınız slayt görüntüleme kadar ° C.
- Slayt görüntüleme önce oda sıcaklığına denge sağlaması için bekletin. Epifloresans için donanımlı bir faz-kontrast mikroskopta floresan resim al. Tipik olarak, tek bir nöronun tamamı dendritik çardak bir 20X objektif ve uygun filtreler kullanılarak yakalanabilir.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Perinatal ra SCG ayrışmış sempatik nöronlarts ve serum ve ganglionik gliyal hücreleri ve yokluğunda büyüme map2 immünopozitif süreçler (Şekil 1) uzatmak için başarısız değil, daha ziyade, tipik olarak, sadece tek bir sürecin akson 14,15 uzanır. BMP-7 (Şekil 1) ya da Matrigel maruz kalma dendritler 17,18 arasında, morfolojik biyokimyasal ve fonksiyonel kriterlere uygun sayıda süreçlerin oluşumu indüklemektedir. Matrigel veya BMP-7 birinin dendrit destekleyici aktivite konsantrasyonu ve zaman bağımlı 17,18,20 olduğunu. Maksimal dendritik büyüme 50 ve 75 mg / ml veya BMP-7 30 ve 100 arasında ng / ml ve yarı maksimal etkileri genellikle ~ 2 ng / ml, BMP-7 konsantrasyonlarda gözlenir arasındaki Matrigel konsantrasyonları kullanılarak görülmektedir. Ancak, dendritik büyüme önemli değişiklikler 300 pg / ml kadar düşük BMP-7 konsantrasyonları ile tespit edilebilir. Matrigel veya BMP-7 birine dendritik yanıt <nöronların% 50 dendrit-p ya maruz kaldıktan sonra 24 saat içinde ikinci bir sürecin oluşturulması ile, nispeten yavaş ajan romoting. Ancak, ilk BMP-7 maruz kaldıktan sonra 3 gün içerisinde, hemen hemen bütün nöronlar maksimum etkili Matrigel veya BMP-7 konsantrasyonları yanıt. Nöron başına Dentritlerin sayısı tedavinin ilk 10 gün içinde meydana gelen değişim çoğu, BMP-7 sürekli maruz kalma ile birlikte artmaya devam ediyor. 4 hafta sonra, BMP-7 ile tedavi edilen nöronların tipik olarak 17 ikincil, üçüncül ve hatta dörtlü dendritik dalları sergilemek 6-8 birincil dendrit vardır. Dendritik çardak bu artış, aksonal büyüme önemli bir değişiklik olmadığı ortaya çıkar ve karşılaştırılabilir dendritik yanıtları BMPs 2, 4, 5 veya 6 20,21 benzer konsantrasyonları kullanılarak elde edebilir. Dendritik büyüme de endojen ganglionik gliyal hücreleri 15,22 ile eş-kültürleme sempatik nöronlar tarafından ortaya çıkarılan olan, ancak, dendritik tepkisi, bu şartlar altında önemli derecede daha yavaştır.
. Jpg "/>
Şekil 1. BMP-7 kültürlü sempatik nöronlar dendritik büyümeyi destekler. Non-nöronal hücrelerin in vitro 2. günde 48 saat başında anti-mitotik tedavisi ile kültürler SCG çıkartılmıştır. In vitro 5. gününde başlayarak, kültürlerin 50 ng / ml (B) BMP-7 ile desteklenmiş ya denetim orta (A) ya da orta ile tedavi edildi. In vitro (BMP tedavi 5 gün sonra) günde 11, kültürler map2 karşı mAb ile boyama yapıldı, bir protein öncelikle dendrit ve nöronal somata bulundu. Gibi floresan temsil fotomikrografı de gösterildiği gibi, kontrol koşullar altında yetiştirilen nöronlar MAP-2 immünopozitif süreçler dendritlerin eksikliği (A) tarafından kanıtlandığı gibi, dendritler yoktur; aksine, nöronlar (B) tipik olarak birkaç şevli MAP-2 immünopozitif sahip BMP-7 maruz dendritler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu model avantajları şunlardır: (a) kültürler, diğer hücre tipleri 17,23 yoksun sempatik nöronlar, homojen bir nüfusu oluşur, (b) simpatetik nöronlar büyüme faktörü gereksinimleri kullanımına olanak sağlamaktadır ki, iyi kurulmuş bulunmaktadır tanımlanan orta ve tanımlanan çeşitli medya ve yüzeyler 23 büyüyen ve sempatik nöronlar sürdürmek için iyi çalışır; (c) Bu kültürlerinde nöronlar Matrigel, BMP-7 ve DPP diğer BMP ve dendrit terfili aktivite düzgün cevap ve 60A 17,18,20,21 alt familyaya ve (d) Matrigel-veya BMP indüklenen dendrit oluşumu hayatta hücre büyümesi ya akson 17,18 değişiklik olmaksızın ortaya çıkar. Bu model hemen primer dendr sırasında, dendritlerin oluşumu öncesindeki, dendritik büyümesi, örneğin ayrı bir aşamada nöronların senkronize popülasyonlarının elde etmek mümkün hale dendritik büyüme tetiklendiğinde deneysel kontrolü, olanakitogenesis (birincil dendritler ilk oluşumu) ve dendritik olgunlaşma sonraki aşamalarında. Modelinin en önemli kısıtlamaları RNA ve biyokimyasal çalışmaları sınırlayabilir tek bir kumu, ve gen ifadesi manipüle bazı zorluk tipik bir Diseksiyon temin protein sınırlı miktarda içerir. Primer nöronal hücre kültürlerinde cDNA ifade tekniklerindeki son gelişmeler hızla bu ikinci dezavantajı üstesinden edilir. Lipid tabanlı dağıtım sistemleri, nucleofection ve kültürlü sempatik nöronlar adenoviral vektörlerin başarılı bir uygulama bildiren yayınlar vardır. Bildirilen transfeksiyon verimliliği gibi morfolojik analizler gibi bireysel hücre analizleri, temel noktaları için yeterli olan, (tipik olarak% 10-20 arası viral enfeksiyon ile lipofection veya nucleofection ve yukarı% 30-50 ile değişen) nispeten düşük, ama olabilir birçok biyokimyasal noktalar için sorunlu.
Faktörler that kültüre sempatik nöronlar BMP indüklenen dendritik büyümesi ile karışabilir kültürleme çok yüksek bir hücre yoğunluğu nöronları ve kültür ortamı içerisinde serum dahil bulunmaktadır. Yüksek hücre yoğunluğu BMP bilinmemektedir ve dendrit terfili aktivitesi zayıflar sebebi iken, BMP heyecanla serum proteinlerine bağlanarak, çünkü serum bu etkinliği zayıflar olasıdır. İlginçtir, kendisi serum kültürlü sempatik nöronlar 24 zayıf dendrit destekleyici aktivite vardır ve bizim ön veriler bu etkinliği çok olmasa bile tüm ticari sera mevcut BMP, aracılık ettiğini göstermektedir. BMP Matrigel de mevcut olduğu ve büyük olasılıkla onun dendrit terfili aracılık faaliyeti. BMP ve dendrit terfili etkinliği etkileyebilecek bir üçüncü faktör BMP yanlış taşıma ve depolama olduğunu. Den az 0.1 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda BMP stok çözeltileri saklamayın. Bu BMP stok veya çalışma çözümleri çok temel olmaya izin önemlidir ve biz o buf tavsiyestok çözümler sulandırmak için kullanılan fers 4.5 pH ± 0.05 var. Aliquoting önce gayretle tüm çözümler karıştırın ama öylesine güçlü ki çözüm köpük, BMP ve diğer plastikler için sopa eğilimindedir çünkü sadece polipropilen tüpler kullanın. Sıcaklıklar bisiklet BMP-7 aktivitesini yok yeterlidir, çünkü bir otomatik buz çözme özelliği var dondurucularda alikotları saklamayın. Kuvvetle BMP çözümler -80 saklanabilir tavsiye edilir ° C ve donma-çözülme (biz fazla 2-3 kez dondurma-cozundurmeden) en aza indirilebilir. Benzer önlemler Matrigel ele kullanılmalıdır. Ayrıca, bu Matrigel yavaş 4 azından çözülmüş edilmesi tavsiye edilir ° C. Önceden kaplanmış nöronlara astar öncesi substratlar için kullanıldığı zaman Matrigel dendritik büyümesini teşvik olmaz; kurulduğu nöronal hücre kültürleri 18 kültür ortamına ilave edildiği zaman, sadece etkili olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe NS45037 R21 ve R01 ES014901) fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco Glass | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco Glass | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | GIBCO, by Life Technologies | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche Group | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Laboratories | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Molecular Probes, Life Technologies | P7481 |
References
- Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. , Harvard University Press. (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
