Summary
The Xpert MTB / RIF-test integrerar prov sanering, handsfree, ombord prov bearbetning, och ultra-känslig hemi-kapslad PCR för samtidig detektion av
Abstract
Tuberkulos (TB) på grund av Mycobacterium tuberculosis (MTB) är fortfarande en viktig folkhälsofråga: infektionen drabbar upp till en tredjedel av världens befolkning 1, och nästan två miljoner människor dödas av TB varje år 2 Allmän tillgång till hög kvalitet. är patient-centrerad behandling för alla tbc-patienter understryks av WHO: s Stop TB strategi. snabb detektion av MTB i luftvägarna prover och läkemedelsbehandling bygger på tillförlitliga tester läkemedelsresistens Resultat 3 är en förutsättning för ett framgångsrikt genomförande av denna strategi. I många delar av världen bygger TB diagnosen fortfarande på okänsliga, dåligt standardiserade metoder sputum mikroskopi. Ineffektiv TB upptäckt och uppkomsten och överföring av läkemedelsresistenta MTB stammar allt äventyrar globala verksamhet tbc kontroll. 2
Effektiv diagnos av pulmonell tuberkulos kräver tillgänglighet - på en global skala - av standardized, lätt att använda och robust diagnostiska verktyg som gör det möjligt att direkt detektion av både MTB komplexa och resistens mot viktiga antibiotika, t.ex. rifampicin (RIF). Det senare resultatet kan tjäna som markör för multiresistent MTB (MDR TB) och har rapporterats i> 95% av de MDR-TB-isolat. 4, 5 Den snabba tillgängligheten av tillförlitliga testresultat är sannolikt att direkt översätta till ljud behandling av patienten beslut som i slutändan kommer att bota den enskilda patienten och bryta den kedja av TB överföring i samhället. 2
Cepheid s (Sunnyvale, CA, USA) Xpert MTB / RIF analys 6, 7 uppfyller de krav som beskrivs ovan på ett anmärkningsvärt sätt. Det är en nukleinsyra-syror förstärkning test för 1) upptäckt av MTB komplex DNA i sputum eller koncentrerade sediment sputum, och 2) påvisande av RIF resistens-associerade mutationer i rpoB genen 8 Den är designad för användning med Cepheid s GeneXpert Dx. systemet: epå integrerar och automatiserar provbearbetning, nukleinsyraamplifiering, och detektion av målsekvenserna med realtids-PCR och omvänt transkriptas PCR. Systemet består av ett instrument, dator, streckkodsläsare och förinstallerad programvara för tester och visa resultat. 9 Det sysselsätter engångsförpackningar Xpert MTB / RIF patroner som håller PCR reagenser och värd för PCR-processen. Eftersom patronerna är sluten, är korskontaminering mellan proven elimineras. 6 Nuvarande Nukleinsyraamplifiering metoder som används för att detektera MTB är komplexa, arbetsintensiva, och tekniskt krävande. The Xpert MTB / RIF analys har potential att ge standardiserade, känslig och mycket specifika diagnostiska tester för både tuberkulos och resistens till allmän-access point-of-vårdmiljöer 3, förutsatt att de kommer att ha råd med det. För att underlätta tillgången, har Stiftelsen för innovativa nya diagnosmetoder (FIND) som förhandlades fram betydandedande prissänkningar. Aktuella FIND-förhandlade priser, tillsammans med listan över länder som är berättigade till de rabatter, finns tillgängliga på webben. 10
Protocol
Standard 2 av de internationella standarderna för tuberkulos Care uppger att alla patienter som misstänks ha pulmonell tuberkulos bör lämna in minst två sputum prover för bakteriologisk undersökning. När det är möjligt bör minst en tidig morgon prov erhållas som sputum in vid denna tidpunkt har den högsta avkastningen. 11 The Xpert MTB / RIF analys kan appliceras på sputum prover eller koncentrerade sediment sputum framställda av inducerad eller expektorerat sputa som är . antingen syrafasta baciller (AFB) cellprov positiv eller negativ 6, 12, 13 Analysen är avsedd för användning med prover från patienter för vilka det finns klinisk misstanke om pulmonell tuberkulos som har: 1) inte fått behandling mot tuberkulos, 2 ) hade <7 dagars behandling, eller 3) inte har fått behandling under de senaste 60 dagarna. Notera att det inte bör användas för att övervaka effekterna av läkemedelsbehandling 7, eftersom bakterie-DNA kan kvarstå efter antimikrobiell behandling.
1. Spottas Sputumprover
Obs: Process endast så många exemplar på en gång, eftersom det finns GeneXpert DX-system moduler för att köra testet!
- Märk varje Xpert MTB / RIF patron med motsvarande provet ID.
- Överföring 1,0 ml spottas sputum till en konisk, med skruvkork med användning av en steril överföringspipett. Alternativt kan hela provet bearbetas i den ursprungliga läcksäker sputum uppsamlingsbehållaren.
- Tillsätt 2,0 ml Xpertti MTB / RIF Prov Reagens (2:1, volym / volym) till expektorerat sputum med användning av en steril överföringspipett.
- Sätt tillbaka locket, och skaka röret kraftigt 10-20 Gånger. Alternativt kan blandningen virvlades (30 sek).
- Tillåta röret att stå upprätt under 5 min vid rumstemperatur.
- Skaka röret kraftigt 10-20 gånger. Alternativt kan du använda en virvel (30 sek).
- Tillåta röret att stå upprätt i ytterligare 10 minuter vid rumstemperatur.
- Inspektera prover: Prover ska kondenseras utan synliga klumpar slem.
2. Koncentrerade Sediment
Obs: Process endast så många exemplar på en gång som det finns GeneXpert DX-system moduler tillgängliga för att köra tester!
- Märk varje Xpert MTB / RIF patron med motsvarande provet ID.
- Överföra 1,5 ml Xpertti MTB / RIF Prov Reagens för en konisk, med skruvkork med användning av en steril överföringspipett.
- Tillsätt minst 0,5 ml koncentrerad sediment Sample reagens som innehåller rör med hjälp av en steril överföringspipett.
- Sätt tillbaka locket och skaka röret vigorously 10-20 gånger. Alternativt kan du använda en virvel (30 sek).
- Tillåta röret att stå upprätt under 5 min vid rumstemperatur.
- Skaka röret kraftigt 10-20 gånger. Alternativt kan du använda en virvel (30 sek).
- Tillåta röret att stå upprätt i ytterligare 10 minuter vid rumstemperatur.
- Inspektera prover: Prover ska kondenseras utan synliga klumpar slem.
3. Fylla på Xpert MTB / RIF Cartridge
Obs: Starta testet inom 30 minuter efter tillsats av provet till patronen!
- Kontrollera etiketterna på Xpert MTB / RIF patronen och provet ID.
- Öppna kassetten locket.
- Använda sterila överföringspipetten förutsatt aspirera den kondenserade prov i överföringspipetten tills menisken är över det minsta märket och överföra provet i den öppna porten på Xpert MTB / RIF patron.
Obs:Dispensera långsamt för att minimera risken för aerosolbildning!
- Stänga kassett locket.
4. Starta testet
Obs: Innan du startar testet, se till att GeneXpert DX-system är utrustad med GX2.1 programvara och Xpert MTB / RIF-analys importeras till mjukvaran 9!
- Slå på datorn och slå sedan på GeneXpert Dx instrumentet.
- På skrivbordet i Windows dubbelklickar du på GeneXpert Dx genvägsikonen.
- Logga in på GeneXpert DX-system programvaran med ditt användarnamn och lösenord.
- I GeneXpert DX-system fönstret klickar du på Skapa Test. Skanna bläckpatron Streckkod visas.
- I Prov-ID rutan skanna eller skriv provet ID.
- Skanna streckkoden på Xpert MTB / RIF patron. Skapa Test visas.
- Klicka på Start Test
- Öppna dörren instrumentet modulen med blinkande grönt ljus, och ladda kassetten.
- Stäng luckan. Testet startar och lampan slutar blinka och förblir konstant grönt. När testet är klart släcks ljuset.
- Vänta tills systemet frigör dörrlåset i slutet av körningen, öppna modulen dörren och ta ut patronen.
- Kassera använda kassetter i lämpliga avfallsbehållare enligt din institutionens standard praxis.
5. Representativa resultat
Varje Xpertti MTB / RIF Patronen innefattar reagens för detektion av Mtb-komplexet och RIF motstånd samt en provbearbetning (SPC) för att styra för adekvat behandling av målbakterien och för att övervaka närvaron av inhibitor (er) i PCR-reaktionen . Sonden Check Control (PCC) verifierar reagens rehydrering, PCR-rör fylla ipatronen, sond integritet, och färgämnet stabilitet. 9 De primers i Xpertti MTB / RIF-analys amplifiera en del av rpoB-genen innehållande 81 baspar "kärna"-region. Fem olika färger fluorogena nukleinsyra hybridiseringsprober, så kallade molekylära fyrar, förhöra hela 81-bp core 14. Varje molekylär ledstjärna var avsedd att vara så specifik att den inte binder till sitt mål om målsekvensen skiljer sig från den vilda typen rpoB Sekvensen av så lite som en enstaka nukleotid-substitution. Eftersom molekylär beacons fluorescens endast när de är bundna till sina mål, dvs vildtyp rpoB sekvens, frånvaron av någon av de fem färgerna i analysen skilja mellan den konserverade vildtypssekvensen och mutationer i kärnan regionen som är förknippade med RIF-resistens. 6
SPC bör vara positiv i ett negativt prov och kan vara negativa eller positiva i ett positivt prov. TestetResultatet kommer att bli "Invalid" om produktresumén inte detekteras i ett negativt test. Före starten av PCR-reaktionen, mäter GeneXpert DX-system fluorescenssignalen från sonderna för att övervaka vulst rehydratisering reaktionsinert röret fyllning, sond integritet och färgämne stabilitet. PCC går om fluorescenssignal från sonderna uppfyller de tilldelade acceptanskriterierna. Resultaten tolkas av GeneXpert DX-system från de uppmätta fluorescerande signaler och inbäddade algoritmer beräkningar och visas i Visa resultat fönstret 9, som anges nedan:
MTB upptäckt: MTB mål-DNA detekteras, båda kontrollerna, SPC och PCC, träffa de tilldelade acceptanskriterierna. Lägre Ct-värdena representerar en högre utgångskoncentration av DNA-templat; högre Ct-värdena representerar en lägre koncentration av DNA-mall. I MTB detekterade resultaten "RIF resistens påvisad" (Figur 1A), "RIF Resistance identifieras inte" ( MTB upptäckt Not: MTB mål-DNA detekteras inte, båda kontrollerna, SPC och PCC, träffa de tilldelade acceptanskriterier (Figur 2). Ogiltig: Närvaro eller frånvaro av MTB inte kan fastställas: SPC inte uppfyller acceptanskriterier, dvs provet inte riktigt har behandlats, eller PCR hämmades (Figur 3). Obs: Upprepa testet med extra exemplar! Fel: En eller flera av de PCC resultaten misslyckade (underkänd). Både MTB och SPC visa inget resultat. Obs: Upprepa testet med extra exemplar! Om PCC passerat (PASS) är felet orsakades av ett system komponentfel. Figur 1: MTB mål-DNA detekteras, båda kontrollerna, SPC och PCC, träffa de tilldelade acceptanskriterierna. Lägre Ct-värden representerar en högre startKoncentrationen av DNA som mall; högre Ct-värdena representerar en lägre koncentration av DNA-mall. I MTB detekterade resultaten "RIF Motstånd identifieras inte" (Figur 1A), "RIF resistens påvisad" (Figur 1B), eller "RIF Resistance obestämd tid" visas på en separat rad. 
. Figur 1A MTB upptäckts, RIF Resistance inte kan påvisas, dvs endast den vilda typen nukleinsyrasekvensen av 81-bp RIF-resistens bestämma region (RRDR) av rpoB-genen fanns 6. Klicka här för att visa en större bild . 
. Figur 1B MTB upptäckts, RIF resistens påvisad. Komplett hoppar av Probe B (pil), som omfattar de positioner från 513 till 517 av R RDR av rpoB-genen. 6 I exemplet visade partiell sekvensering att rpoB genmutation D516V upptäcktes. 8 Klicka här för att visa en större bild . 
Figur 2 MTB mål-DNA påvisades inte,.. Båda kontrollerna, SPC och PCC, träffa de tilldelade acceptanskriterier Klicka här för att visa en större bild . 
. Figur 3 ogiltigt resultat, dvs närvaro eller frånvaro av MTB inte kan fastställas: SPC inte uppfyller acceptanskriterier, eftersom provet inte bearbetas på rätt sätt, eller för att PCR hämmades.3547fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Discussion
The Xpert MTB / RIF analys integrerar prov sanering, handsfree, ombord prov bearbetning, och ultra-känslig hemi-kapslad PCR för samtidig detektion av MTB-och RIF motstånd, antingen i expektorerat sputum eller koncentrerade sediment, i ett enda , lätt att använda systemet. Analysens analytiska detektionsgränsen befanns vara 131 CFU / ml upphostning. Den log-linjära relationen mellan Ct-värden och antalet MTB-celler presenterar stämmer från 10 februari - 10 juli CFU / ml upphostning 6. Som kliniskt relevanta MTB koncentrationer faller alla inom det linjära intervallet av analysen ger analysen semi-kvantitativa beräkningar av den bakteriella belastningen. 7 Analysen kräver endast måttlig laborationer infrastruktur och utbildning. Detektionsgränsen ligger minst två storleksordningar lägre än för konventionell mikroskopi. 6 Specificitet är utmärkt. Vidare, samtidigt påvisande av RIF-resistant MTB är en betydande fördel vid fastställandet av point-of-care test i en tid av läkemedelsresistenta TB. 3
Hittills endast begränsade publicerade data på analysen prestanda för att diagnostisera lung tbc i kliniska inställningar finns 12, 13. The Xpert MTB / RIF analys övergripande kliniska känslighet för att upptäcka MTB i sputum hos patienter med misstänkt pulmonell tbc var 97,6% jämfört med kulturen som referens. Det var resultatet av en prospektiv multicenterstudie som omfattade fem undersökningsområden (Lima, Peru, Baku, Azerbajdzjan, Cape Town & Durban, Sydafrika, Mumbai, Indien) och totalt 1462 patienter. Den totala pre-test sannolikheten för kultur bekräftade-TB i studiepopulationen var 50,7%. Känsligheten var 99,8% för smear-och kultur-positiva fall och 90,2% för smear-negativa, kultur-positiva fall. Bland HIV-positiva patienter med pulmonell tuberkulos, var känslighet MTB / RIF-test 93,9%, jämfört med 98,4% i. HIV-negativa patienter 12 I en miljö med låg TB prevalens, var övergripande avtal för att upptäcka MTB 89% jämfört med kultur, känslighet var 98% för smear-positiva och 72% för smear-negativa prover respektive och specificitet var utmärkt. 13 Det fanns ingen signifikant skillnad i känslighet mellan tester på obehandlat sputum och de på koncentrerade sediment. 12 I samma studie upptäckte MTB / RIF testet korrekt RIF motstånd i 209 av 211 patienter (99,1% känslighet) och i alla 506 patienter med RIF mottaglighet (100% specificitet), då sekvensering resultaten beaktats. 12 Författarna fann att prestanda för både fallet upptäckt, och diskriminering av RIF motstånd var liknande i olika områden, vilket tyder på att resultaten sannolikt kommer att vara allmänt tillämpliga. 12 Dessutom koncentrerade sediment i luftvägarna andra exemplar än sputum, såsom bronko-alveolära sköljning och bronkernal sekret, testades med jämförbar känslighet och specificitet. 13 Uppgifter om analysens prestanda när testar extra-pulmonell tuberkulos växer fram 15.
Global TB-kontroll i akut behov av effektiva verktyg som tillåter snabb diagnos av nya tbc fall och detektion av RIF-resistent MTB i Universal-access point-of-care inställningar. 3 Aktuella Nukleinsyraamplifiering metoder som används för att detektera MTB är komplexa, arbetsintensiva, och tekniskt krävande. The Xpert MTB / RIF analys har potential att ge standardiserade, känslig och mycket specifika diagnostiska tester för både tuberkulos och resistens till dessa inställningar, förutsatt att de kommer att ha råd med det. För att underlätta tillgången, har Stiftelsen för innovativa nya diagnosmetoder (hitta) som förhandlades fram betydande prissänkningar för Xpert MTB / RIF test. Aktuella FIND-förhandlade priser, tillsammans med listan över länder som är berättigade till de rabatter, finns tillgängliga på webben. 10
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna erkänner WJ Looney för noggrant granska manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xpert MTB/RIF test | Cepheid | GXMTB/RIF-10 | |
| Transfer pipettes | Sarstedt Ltd | 86.1172.001 | |
| Conical tubes, 15 ml, 120 x 17 mm, PS | Sarstedt Ltd | 62.553.542 |
References
- Sudre, P., Dam, ten, Chan, G., C,, Kochi, A. Tuberculosis in the present time: a global overview of the tuberculosis situation. World Health Organisation Document WHO/TUB/91. 158, 1-47 (1991).
- World Health Organisation. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing. WHO report 2010. , (2010).
- The global plan to stop TB, 2006-2015. , World Health Organization. Geneva. (2006).
- Morris, S., et al. Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. J. Infect. Dis. 171, 954-960 (1995).
- Traore, H., Fissette, K., Bastian, I., Devleeschouwer, M., Portaels, F. Detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse countries by a commercial line probe assay as aninitial indicator of multidrug resistance. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 4, 481-484 (2000).
- Helb, D., et al. Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand Near-Patient Technology. J. Clin. Microbiol. 48, 229-237 (2010).
- Blakemore, R., et al. Evaluation of the Analytical Performance of the Xpert MTB/RIF. Assay. J. Clin. Microbiol. 48, 2495-2501 (2010).
- Telenti, A., et al. Detection of rifampicin-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Lancet. 341, 647-650 (1993).
- GeneXpert Dx System Operator Manual. , Cepheid Inc. Sunnyvale, CA, USA. (2011).
- Foundation for new innovative diagnostics [Internet]. , Geneva, Switzerland. Available from: http://www.finddiagnostics.org/about/what_we_do/successes/find-negotiated-prices/xpert_mtb_rif.html (2011).
- International Standards for Tuberculosis Care (ISTC). , Tuberculosis Coalition for Technical Assistance. The Hague. (2009).
- Boehme, C. C., et al. Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
- Marlowe, E. M., et al. Evaluation of the Cepheid Xpert MTB/RIF assay for the Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex from Respiratory Specimens. J. Clin. Microbiol. 49, 1621-1623 (2011).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. M., Tyagi, S., Kramer, F. R., Alland, D. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons. J. Clin. Microbiol. 39, 4131-4137 (2001).
- Hillemann, D., Ruesch-Gerdes, S., Boehme, C., Richter, E. Rapid molecular detection of extrapulmonary tuberculosis by automated GeneXpert MTB/RIF system. J. Clin. Microbiol. 49, 1202-1205 (2011).
