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Medicine

산만 Osteogenesis, 또는 임계 크기의 결함의 치유는 Intramembranous 골화을 평가하기위한 Rigidly 안정 골절 만들기

doi: 10.3791/3552 Published: April 11, 2012

Summary

이 문서는 수정된 Ilizarov 외부의 fixators의 적용을 기반으로 긴 뼈 골절을 안정화하는 방법을 설명합니다

Abstract

골격 수리 모드를 평가하는 것은 골절을 치료하는 임상적으로 사용되는 치료법을 개발하기 위해 필수적입니다. 기계적 안정성이 뼈 부상 치유에 큰 역할을한다. 최악의 경우에는 기계적인 불안정성은의 지연이나 노동 조합에 속하지 않은 인간으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 운동은 또한 치유 과정을 자극 수 있습니다. 파괴 뼈 끝이 안정화 모션 연골 형태를 가지고 있고,이 연골이 서서히 endochondral 골화의 발달 과정의 요점의 반복을 통해 뼈로 대체됩니다 골절합니다. 뼈가 골절이 rigidly 안정화되면 반대로, 뼈가 intramembranous 골화 통해 직접 형성하고 있습니다. 임상적으로 두 endochondral 및 intramembranous 골화 동시에 발생합니다. 효과적으로 처리 조사관은 Bonnarens 사에 의해 설명된대로 골절 뼈 골수의 운하에 핀을 삽입 복제합니다. rotatio을 허용하면서이 실험 방법은 우수한 측면 안정성을 제공합니다nal 불안정이 지속합니다. 그러나 이러한 두 개의 프로세스를 조절 메커니즘에 대한 우리의 이해도 실험적으로 이러한 프로세스를 각각 분리하여 향상될 수 있습니다. 우리는 회전과 수평 안정화를 제공 안정화 프로토콜을 개발했습니다. 이 모델에서는 intramembranous 골화가 관찰되고 치유 전용 모드이며, 치유의 매개 변수는 치유 10의 생리적 매개 변수를 변경 후 bioactive 분자 8,9의 신청 후 5-7 유전자 변형 생쥐의 다양한 변종,,,간에 비교할 수 산만 osteogenesis 12 이후 안정화 11 금액이나 시간을 수정 후 노동 조합에 속하지 않은 13 생성 후, 또는 임계 크기의 결함 생성 후. 여기서는 생쥐의 tibial 골절 치료와 산만 osteogenesis 공부를 위해 수정된 Ilizarov의 fixators을 적용하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

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모든 절차는 UCSF 기관 동물 케어의 승인 및위원회를 사용하여 국가 지침을 준수했다.

1. 수술에 앞서 Fixators의 작성

  1. 안정 파괴를 만들기 전에 한 맞춤 설계 외부 고정 장치를 조립해야합니다. 맞춤 디자인 외부 고정 프레임은 세 스테인리스 # 0 / 56 스레드 ​​막대, 8 # 56분의 2 육각 너트, 17 일치하는 볼트 (중소 부품 주식 회사, 마이애미 호수, FL 3)에 의해 안정화이 알루미늄 고리 구성되어.
  2. 두 알루미늄 고리가 파괴 당 필요합니다. 반지는 # 56분의 2 육각 너트 (작은 부품 주식 회사, 마이애미 호수, FL)과 일치하는 볼트의 적절한 구멍에 4를 조립하려면, 이들은 느슨하게 유지됩니다. 이것은 근위 반지 될 것입니다. 말초 반지 3 볼트와 너트 조립하려면 다시 완전히 조여하지 않습니다.

2. 마취, 파괴 창조, 그리고 Fixator 신청

  1. 쥐 (연령, 성별, 그리고 몸무게는 50mg/ml 케타민을, 0.5의 intraperitoneal 주입하여 anesthetized) 사용자가되어 결정됩니다 MG / ML Medetomidine (0.03 ML / 마우스).
  2. 생쥐의 눈에 눈 윤활제를 적용하고 절차를 수행하는 동안 눈을 보호하기 위해 자신의 머리에 걸쳐 테이프 조각을 넣으십시오.
  3. 동물이 절차의 나머지를위한 손난로에 배치됩니다.
  4. 고정시키다 넷 0.25 mm 멸균 곤충 핀 (Anticorro : 파인 과학 도구, 포스터 시티, CA)를 사용하여 왼쪽 경골의 근위 및 말초 metaphyses Dremel 도구에 핀을 부착하고 뼈를 통해 그들을 드릴로.
  5. 핀은 지향 경골의 긴​​ 축에 직각, 그리고 서로 90 °입니다. 최소한 10 근위 및 말초 핀 사이의 음.
  6. 핀을 향해 안쪽으로 향하게 견과류와 근위 핀 위의 첫 번째 고리를 둡니다. 알루미늄 링 내에서 중앙 위치에 경골을 지키는 고리에 핀을 고정합니다.
  7. 디 아래에있는 두 번째 반지를 배치stal 가시는 예전과 육각 너트를 사용하여 고리에 핀을 고정하십시오. 말초 fixator로 네 번째 너트 볼트 조합을 추가합니다.
  8. 해당 장치와 함께 벤딩 세 지점에서 가로 파괴를 만듭니다. 우리는 Bonnarens 및 Einhorn 4 중력 시스템을 사용합니다. 블록에 걸쳐 경골의 posterolateral 표면을 거두길 드롭 암 따라 미리 정해진 높이로 중량을 올리고 무게를 떨어뜨려 그것이 연락처 무딘 골절을 생산하는 경골의 anterolateral 측면을 말씀.에게 높이는 무게는 경골의 독점적 단일 골절을 보장하기 위해 마우스의 각 변형에 대해 결정하는 욕구에서 제외됩니다.
  9. 골절은 X-레이에 의​​해 확인된다.
  10. 골절을 확인한 후, 세 스테인리스 # 0 / 56 스레드 봉 고리에 붙어있다. 말초 월말부터 시작하면 매를 삽입하고 막대를 확보 말초 링을 향해 너트에 실을 꿰다. 그 다음 막대로 다른 견과류를 넣어, 근위 반지는이 N 위에 앉을 것이다UT. 두 개의 고리가 동등한 거리에서 개최되며 핀을을하지 않아서 있는지 확인하십시오. 삼분의 일 너트로 막대에 근위 링을 고정합니다.
  11. 진통제에 대한 buprenorphine의 피하 주사 (1.0 밀리그램 / kg)은 수술 후 즉시 부여되며, 필요에 따라 동물이 고통과 주어진 buprenorphine에 대해 감시합니다.
  12. 마취는 Atipamezole를 관리하여 반대하고 있으며, 그들이 반응하고 ambulating 때까지 동물 모니터링하고 있습니다.

3. 산만 Osteogenesis (참조 : 12,13)를

수용이 절차를 수정하려면 산만 osteogenesis은 간단합니다. 고리는 스레드 봉에​​ 의해 위치에 개최되며, 장소에 막대를 들고 너트를 설정하여 고리가 분리되어 이동이 가능합니다.

  1. 지연 :이 모델을 사용하여 표준 산만 osteogenesis 내용 fixators가 경골에 놓여진 5 일의 잠복기 동안 혼자 남겨.
  2. 산만 : 혼란의 osteogenesis는 안정 막대 ¼ 차례 (0.25 ㎜) 매일 칠일에 너트를 회전하여 수행할 수 있습니다.
  3. 성숙 : 나폴레옹 브리지는 10 일까지 관찰하고 완전한 통합은 혼란 완료 후 27일에 의해 관찰된다.

4. 임계 크기의 결함의 생성

이전 다음 수정을 설명한대로 중요한 크기의 결함을 만들려면 외부 fixators이 적용됩니다.

  1. 절차를 시작하기 전에 피부가 70 % 에탄올로 세척한다.
  2. fixators는 결함을 만드는 완전히 이전에 적용됩니다.
  3. 마우스 그러면 중간 경골을 시각화하기 위해 해부 현미경으로 배치되고, 절개 (5~7mm)이 메스에 # 10 칼날로 이루어집니다.
  4. 근육이 부드럽게 가로와 경골의 중간 diaphysis을 폭로 구분합니다.
  5. 뼈 3mm 세그먼트 그런 다음 중간 diaphysis 사용하는 가위에서 제거됩니다. t를 사용그는 가위 지점, 뼈가 서서히 잘라 냈다되고 뼈 조각이 필요한 경우 집게로 제거됩니다. 케어는 큰 기계적 힘으로 경골를 생기죠 피하기 위해 가위 팁으로 연결됩니다.
  6. 이들은 치유를 촉진있을 수 있기 때문에 더 뼈 조각은 없습니다 않도록 외과 사이트를 검사합니다.
  7. 경골의 무딘 끝을 주위 근육을 교체하십시오.
  8. 6-0 Polyamine의 Monofilament로부터 2-3 봉합과 피부에 절개를 닫습니다.
  9. 마취가 반전되고 동물 감시 고통과 이전에 설명된대로 진통제를 제공.

5. 대표 결과

제대로 적용하면 외부 fixators 뛰어난 감소 (Figs. 1, 2)과 폐쇄 골절 tibial보다 엄격한 안정성을 제공합니다. 그러나, 경우에 불충 분한 감소 (뼈 종료 또는 여러 골절 사이에 명확한 및 대형 격차가 있습니다 (그림 3 발생 (그림 4)를 통해 치료하는이 방법을 사용하여 안정. 골절이 안정화되지 않은 경우 반대로, 대형 연골에 굳은살이 파괴 격차 (그림 5)에서 형성되며, 이것은 intramembranous 골화 과정을 통해 뼈로 대체됩니다.

그림 1
그림 1. tibial 골절을 안정화하는 데 사용되는 외부 고정 장치를 설명 Radiographs. 방사선 사진은 잘 정렬된 뼈 세그먼트 (화살촉)를 보여주는 골절 후 촬영.

그림 2
그림은 2. fixator 후 마우스의 이미지가 적용되었습니다.

그림 3
그림 3. 방사선 사진에서 F 이후 이동racture는 고르지과 조각난 뼈 세그먼트 (화살촉)를 보여줍니다.

그림 4
그림 4. 안정 골절 intramembranous 골화 통해 치유. 안정 파괴의 Trichrome 염색법은 파괴 사이트에서 몇 가지 새로운 뼈 (B)를 보여줍니다. 스케일 막대 = 500 μm의.

그림 5
그림 5. 비 안정화 골절은 endochondral 골화 통해 치유. 비 안정 파괴의 Trichrome 염색법은 (b)는 파괴 사이트에서 연골 (C)와 뼈를 보여줍니다. 스케일 막대 = 500 μm의.

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Discussion

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본즈는 기계적 안정성 (14에서 검토)에 따라 서로 다른 두 modalities에 의해 치료. 골절의 두 끝을 다리를 놓으려고 뼈로 대체됩니다 파괴 격차에 불안정 큰 연골 템플릿 양식을 떠날 때. Proximally 및 distally 휴식 시간에, 뼈가 골막과 endosteum 이내 intramembranous 골화 직접 형성하고 있습니다. 대조적으로의 안정 골절의 치유가 intramembranous 골화 3를 통해 독점적으로 발생합니다. 그러나,이 두 프로세스간에 스위치를 조절하는 특정 메커니즘은 알 수 있습니다. 기계적 환경에 대한 반응으로 줄기 세포의 운명이 유전적으로 통제되고 변경될 수있다는 증거가있다. Mmp9가 파괴 수리 5시 줄기 세포의 운명 결정에 관여되는 제안 안정 골절의 파괴 사이트에 Mmp9 연골 양식이 결여 생쥐합니다. 연골은 또한 뼈 morphogenetic 단백질면 안정 골절에 형성하도록 유도하실 수 있습니다(BMP) 신호 전달 경로가 파괴 수리 8,9 동안 활성화됩니다. 이러한 줄기 세포의 운명 결정이 부상 11 후 처음 몇 일 동안 만들어진 때문에 이러한 결론은 치유의 초기 단계 동안 딱딱한 안정화를 제공하는 그리기 위해서 것은 중요하다.

올바르게 적용 외부 고정, 우리의 방법은 골절 치료 도중 intramembranous 골화을 평가하기 위해 뼈를 안정화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 방법은 고속 충돌에서 발생하는 다른 사지 부상과 함께 골절을 만듭니다. 반대로, intramembranous 골화을 평가하는 데 사용되는 드릴 홀 모델은 환자의 충격을 반영하지 않을 수 있습니다. 또한, 여기에 설명된 메서드가 닫혀, 오픈 부상과 관련된 합병증은 성과 혼란 해석 않도록. 안정화를위한 또 다른 일반적인 방법은 (예 : 4) 붕괴하기 전에 intramedullary 핀 배치를 사용합니다. 이 기술은 널리 사용되는, 그리고 일의 배치된다전자 핀 간단하고 효율적이다. 이 방법은 수평 안정화를 생산하고 있지만 그것은 회전 안정성을 제공하지 않습니다. 결과 부상은 3 시에 안정화없이는 달성될 수 endochondral 골화 통해 주로 치료해 준다. 도금 고정도 생쥐 15 파괴 안정화를 달성하기 위해 사용되었습니다. 다음은 개방형 골절이 생성되고 osteotomy가 된 후 특별히 고안된 내부 fixators는 뼈에 붙어있다. 우리의 접근 방식과 마찬가지로 내부 고정 방법은 안정성을 제공하며 치유가 intramembranous 골화 통해 발생합니다. 우리는 중대한 합병증, 핀 요로 감염, 또는이 절차와 관련된 공동 morbidities 기타 사항을 준수하지 않으며, 동물 쉽게 새장 주위를 이동할 수 있습니다. 주요 단점은이 방법, 그것이 절차를 완료하는 데 걸리는 시간 및 절차를 수행하는 방법은 두 개인의 팀을위한 요건에 능숙하게되는 데 걸리는 시간의 길이에 있습니다. 나생쥐에 유전자하거나 physiologic 조작과 N 조합이 아닌 안정 골절 치료에 안정화 비교하는 것은 골절 치료 5시 줄기 세포의 운명을 조절하는 메커니즘에 상당한 통찰력을 제공하며, 또한 우리를 제공하면서 산만의 조사 osteogenesis 14 수있었습니다 비 노조 13 모델입니다.

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Disclosures

우리는 공개 할게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 NIAMS에서 R01-AR053645에 의해 재정 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25mm insect pin Fine Science Tools 26000-25 Blacked Anodized Steel, 0.25mm rod diameter, 4cm length
Stainless Steel Hex Nut Small Parts, Inc. #2-56 1/8" length, 56 threads per inch
Stainless Steel Hex Nut Small Parts, Inc. #0-80 1/8" length, 80 threads per inch
Stainless Steel Machine Screw Small Parts, Inc. #0-80 1/8" length, 80 threads per inch
Stainless Steel Machine Cut Threaded Rod Small Parts, Inc. #0-80 6" length, 80 threads per inch
18-8 Stainless Steel Head Machine Screw McMaster-Carr 2-56 Threads, 3/6" length
External Fixation Device Machine shop Custom-designed

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References

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Yu, Y. y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, III, T. Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects. J. Vis. Exp. (62), e3552, doi:10.3791/3552 (2012).More

Yu, Y. y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, III, T. Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects. J. Vis. Exp. (62), e3552, doi:10.3791/3552 (2012).

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