Skapa Stelt Stabiliserade Frakturer för bedömning intramembranös Ossifikation, distraktion Osteogenesis eller Läkning av kritiska Sized Defekter

Summary

Den här artikeln beskriver en metod för stabilisering av långa benfrakturer som är baserad på tillämpningen av modifierade Ilizarov externa fixators

Abstract

Bedöma sätt att skelettet reparation är nödvändig för att utveckla behandlingar som skall användas kliniskt för att behandla frakturer. Mekanisk stabilitet spelar en stor roll vid läkning av benskador. I värsta scenariot mekanisk instabilitet kan leda till försenad eller icke-union hos människor. Emellertid kan rörelsen stimulerar också läkningsprocessen. I frakturer som har blanketter rörelse brosk för att stabilisera ändarna fraktur ben, och detta brosk gradvis ersätts av ben genom Upprepande av utvecklingsprocessen av endokondral benbildning. Om däremot en benfraktur är stelt stabiliserad ben bildar direkt via intramembranös benbildning. Kliniskt både endokondral och intramembranös ossifikation sker samtidigt. För att effektivt replikera detta förfarande undersökare in en nål i den medullära kanalen hos det brutna benet som beskrivits av Bonnarens ^4. Denna experimentella metod ger utmärkt stabilitet i sidled samtidigt som rotational instabilitet att bestå. Emellertid kan vår förståelse av de mekanismer som reglerar dessa två distinkta processer även förbättras genom experimentellt isolera var och en av dessa processer. Vi har utvecklat en stabilisering protokoll som ger roterande och laterala stabilisering. I denna modell är intramembranös benbildning det enda sättet att healing som observeras och helande parametrar kan jämföras mellan olika stammar av genetiskt modifierade möss ^5-7, efter applicering av bioaktiva molekyler ^8,9, efter att förändra fysiologiska parametrar av healing ^10, När du har ändrat mängden eller tidpunkten för stabilisering ^11, efter distraktion osteogenes ^12, efter skapandet av en icke-unionen ^13, eller efter att skapa en kritisk storlek defekt. Här visar vi hur man tillämpa modifierade Ilizarov fixators för att studera tibiala frakturläkning och distraktion osteogenes i möss.

Protocol

Alla förfaranden har godkänts av UCSF Institutional Animal Care and Use Committee och överensstämmer med nationella riktlinjer.

1. Beredning av fixturer Innan operation

1. Innan du skapar stabiliserats fraktur, måste man montera anpassade-design yttre fixeringsanordning. De skräddarsydda externa fixering ramar bestod av två aluminium ringar stabiliserade av tre rostfritt stål # 0/56 gängade stavar, 8 # 2/56 hexagonala nötter, och 17 matchning bultar (Small Part Inc., Miami Lakes, FL ^3).
2. Två aluminiumringar behövs per fraktur. Till en ring montera 4 # 2/56 sexkantsmuttrarna (liten del Inc., Miami Lakes, FL) och matchande skruvar in i lämpliga hål, bör dessa vara löst. Detta kommer att vara den proximala ringen. Till den distala ringen monterar 3 skruvar och muttrar, inte återigen inte åt helt.

2. Anestesi, Fraktur skapelsen och fixationen Application

1. Möss (ålder, kön, och kroppvikt bestäms av användaren) är bedövades genom intraperitoneal injektion av Ketamin 50mg/ml, 0,5 mg / ml Medetomidin (0,03 ml / mus).
2. Applicera ögat smörjmedel till ögonen på mössen och placera en bit tejp över huvudet för att skydda ögonen under förfarandet.
3. Djuret placeras på en värmedyna under återstoden av proceduren.
4. Genomborra de proximala och distala metafysen i den vänstra skenbenet med hjälp av fyra 0,25 mm sterila insektsceller tapparna Anticorro: Fine Science verktyget, Foster City, CA) genom att fästa stiften till en Dremel verktyget och borrning dem genom benet.
5. Stiften är orienterade vinkelrätt mot den långa axeln av skenbenet och 90 ° mot varandra. Åtminstone 10 mm mellan de proximala och distala stiften.
6. Placera den första ringen över den proximala stiften med muttrarna vända inåt mot stiften. Fästa stiften till ringen hålla skenbenet placerad centralt inuti aluminiumring.
7. Placera den andra ringen under diStal stift och fästa stiften till ringen med användning av de sexkantiga muttrar som tidigare. Lägg den fjärde mutter-bult kombination för att den distala fixationen.
8. Skapa den tvärgående fraktur genom tre-punkt-böjning med en lämplig anordning. Vi använder allvaret systemet Bonnarens och Einhorn ^4. Vila posterolateral ytan av skenbenet över blocken, höja vikten till en förutbestämd höjd längs drop armen och släppa vikten så att den kommer i kontakt med anterolateralt av skenbenet för att producera den trubbiga frakturen. Höjden vikten släpps från behov som skall fastställas för varje stam av mus för att säkerställa en fraktur enbart av skenbenet.
9. Fraktur bekräftas av X-ray.
10. Efter bekräftelse brottet är tre rostfria # 0/56 gängstänger fäst ringarna. Med början från den distala änden in stången och trä en mutter på den distala ringen för att fästa staven. Lägg sedan en mutter på stången, kommer den proximala ringen sitta på toppen av denna nUT. Se till att de två ringarna kommer att hållas på samma avstånd och inte anstränga stiften. Fäst den proximala ringen stavarna med en tredje mutter.
11. Subkutana injektioner av buprenorfin (1,0 mg / kg) för analgesi ges omedelbart efter kirurgi och djuren övervakas under smärta och viss buprenorfin efter behov.
12. Anestesi reverseras genom administrering Atipamezol, och djur övervakas tills de är lyhörda och ambulerande.

3. Distraktion Osteogenesis (se även: ^12,13)

Att ändra detta förfarande för att rymma distraktion osteogenes är enkel. Ringarna hålles i läge medelst gängade stänger, och genom att vrida muttrarna som håller stavarna i stället ringarna kan förflyttas isär.

1. Latency: För standard distraktion osteogenesis använda denna modell fixators placeras på skenbenet och lämnade ensamma under en latensperiod av 5 dagar.
2. Distraktion: Distraktion osteogenesis kan utföras genom att vrida muttrarna på de stabiliserande stavarna ¼ varv (0,25 mm) varje dag 7 dagar.
3. Mognad: Bony överbrygga observeras med 10 dagar och fullständig konsolidering följs av 27 dagar efter avslutad distraktion.

4. Skapande av en kritisk Sized defekt

Att skapa en kritisk storlek defekt de externa fixators tillämpas som tidigare beskrivits med följande modifieringar.

1. Innan du börjar proceduren huden rengörs med 70% etanol.
2. De fixators tillämpas helt innan att skapa felet.
3. Musen placeras därefter under dissekerande mikroskop för att visualisera den mediala skenbenet, och en incision (5-7 mm) är gjord med en # 10 blad på en skalpell.
4. Muskeln försiktigt transekterades och separeras för att exponera mitten diafys hos tibia.
5. En 3 mm segment av ben avlägsnas sedan från mitten-diafys med sax. Användning av than punkt av saxen, är benet klippt långsamt bort och benfragment avlägsnas med pincett vid behov. Försiktighet bör iakttagas med spetsarna på en sax för att undvika förskjutning av tibia med en stor mekanisk styrka.
6. Undersöka den kirurgiska platsen för att säkerställa att det inte finns några benfragment, eftersom dessa skulle kunna främja läkning.
7. Ersätta muskel runt den trubbiga ändar skenbenet.
8. Stänga snittet i huden med 2-3 suturer av 6-0 Polyamin monofilament.
9. Anestesi reverseras och djuren övervakas för sveda och ges analgetika som tidigare beskrivits.

5. Representativa resultat

När det tillämpas korrekt, de externa fixators ger styvare stabilitet i det slutna tibialfraktur med utmärkt minskning (fig 1, 2). I vissa fall otillräckligt minskning (en självklar och stor skillnad mellan benändarna eller multipla frakturer förekommer (Fig. 3 (Fig. 4). I motsats, om frakturen inte stabiliseras ett stort brosk kallus bildas i frakturen gapet (fig. 5), och detta ersätts av ben genom processen intramembranös benbildning.

Figur 1. Röntgenbilder illustrerar en extern fixeringsanordning som används för att stabilisera tibialfraktur. Röntgenbild togs efter frakturen som visar en väl inriktade bensegment (pilspets).

Figur 2. Bild på en mus efter att fixeringsorganet har tillämpats.

Figur 3. Röntgenbild tas efter fracture visar fel och fragmenterade ben segment (pilspets).

Figur 4. Stabiliserad fraktur läker via intramembranös benbildning. Trikrom-färgning av stabiliserad fraktur visar några nya benet (b) vid frakturstället. Skalstreck = 500 ^ m.

Figur 5. Icke-stabiliserad frakturer läker via endokondral benbildning. Trikrom-färgning av icke-stabiliserad fraktur visar brosk (c) och ben (b) vid frakturstället. Skalstreck = 500 ^ m.

Discussion

Bones läka av två olika metoder beroende på mekanisk stabilitet (över ^14). Då lämnade instabila ett stort former brosk mall i frakturen gap som ersätts av ben för att överbrygga de två ändarna av brutet ben. Proximalt och distalt till paus, bildar ben direkt intramembranös benbildning i benhinnan och endosteum. I motsats sker i stabil frakturer healing uteslutande via intramembranös benbildning ^3. Men de särskilda mekanismer som reglerar övergången mellan dessa två processer är okända. Det finns bevis för att stamcellen ödet som svar på den mekaniska miljön kontrolleras genetiskt och kan ändras. Hos möss som saknar MMP9 brosk former i frakturen av stabila frakturer tyder på att MMP9 är inblandad i öde stamceller beslut under frakturläkning ^5. Brosk kan också induceras för att bilda stabila i frakturer om benmorfogenetiskt protein(BMP) signalväg aktiveras under frakturläkning ^8,9. För att dra dessa slutsatser ger stel stabilisering under de tidiga stadierna av healing är viktigt eftersom dessa stamceller öde fattas under de första dagarna efter skada ^11.

Vår metod för yttre fixering, när den appliceras korrekt kan användas för att stabilisera benet för att bedöma intramembranös benbildning under frakturläkning. Vår metod skapar en fraktur tillsammans med andra lem som inträffar i en höghastighetsstötar. Däremot kan borra hål modeller som används för att bedöma intramembranös benbildning speglar inte trauma hos patienter. Vidare är här beskrivna metoden stängd, så komplikationer associerade med en öppen skada inte påverka bedömning av resultaten. En annan vanlig metod för stabilisering använder placering av en intramedullär pin före fraktur (t ex ^4). Denna teknik används allmänt, och placeringen av: ee stift är enkel och effektiv. Även om detta tillvägagångssätt ger lateral stabilisering det inte ger för roterande stabilitet. Den skada läker främst via endokondral benbildning som kan uppnås utan stabilisering på alla ^3. Pläterad fixering har också använts för att uppnå stabilisering fraktur hos möss ^15. Här en öppen fraktur skapas och särskilt utformade interna fixators är fästa benet efter en osteotomi görs. I likhet med vår strategi den interna Fixeringsmetod ger stabilitet och läkning sker via intramembranös benbildning. Vi följer inte betydande komplikationer, PIN-infektioner eller andra komorbiditet i samband med detta förfarande, och djuren kan röra sig sina burar lätt. De största nackdelarna är den tid det tar att bli skickliga på detta sätt, den tid det tar för att avsluta förfarandet, och kravet på grupper om två individer för att utföra förfarandet. Jagn kombination med genetiska eller fysiologiska manipulationer för att mössen, att jämföra stabiliserad icke-stabiliserad frakturläkning ger stor insikt i de mekanismer som reglerar öde stamceller under frakturläkning ⁵ och har gjort en undersökning av distraktion osteogenesis ¹⁴ och samtidigt ge oss en modell av icke-unionen ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25mm insect pin	Fine Science Tools	26000-25	Blacked Anodized Steel, 0.25mm rod diameter, 4cm length
Stainless Steel Hex Nut	Small Parts, Inc.	#2-56	1/8" length, 56 threads per inch
Stainless Steel Hex Nut	Small Parts, Inc.	#0-80	1/8" length, 80 threads per inch
Stainless Steel Machine Screw	Small Parts, Inc.	#0-80	1/8" length, 80 threads per inch
Stainless Steel Machine Cut Threaded Rod	Small Parts, Inc.	#0-80	6" length, 80 threads per inch
18-8 Stainless Steel Head Machine Screw	McMaster-Carr		2-56 Threads, 3/6" length
External Fixation Device	Machine shop	Custom-designed