Summary
Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het stabiliseren botbreuken, gebaseerd op de toepassing van gemodificeerde Ilizarov externe fixators
Abstract
Het beoordelen van vormen van het skelet reparatie is essentieel voor het ontwikkelen van therapieën om klinisch worden gebruikt om breuken te behandelen. Mechanische stabiliteit speelt een grote rol in de genezing van het bot verwondingen. In het worst-case scenario mechanische instabiliteit kan leiden tot vertraagde of non-union bij de mens. Kunnen echter beweging ook stimuleren het genezingsproces. In breuken die beweging kraakbeen vormen moeten de fractuur uiteinden van de botten te stabiliseren, en dit kraakbeen wordt geleidelijk vervangen door bot door herhaling van het ontwikkelingsproces van endochondrale ossificatie. Als daarentegen een botbreuk is stijf gestabiliseerd bot vormt direct via intramembraneuze ossificatie. Klinisch, zowel endochondrale en intramembraneuze ossificatie gelijktijdig plaatsvinden. Om effectief te kunnen repliceren dit proces onderzoekers een pin in te voegen in de medullaire kanaal van het gebroken bot zoals beschreven door Bonnarens 4. Deze experimentele methode zorgt voor een uitstekende zijdelingse stabiliteit terwijl rotatiointerne instabiliteit blijven bestaan. Echter, ons begrip van de mechanismen die deze twee verschillende processen te reguleren ook worden versterkt door experimenteel isoleren van elk van deze processen. Wij hebben een stabilisatie protocol rotatie en zijdelingse stabilisatie biedt. In dit model intramembraneuze ossificatie is de enige manier van heling die wordt waargenomen, en genezing parameters kunnen worden vergeleken tussen de verschillende stammen van genetisch gemodificeerde muizen 5-7, na toepassing van bioactieve moleculen 8,9, na het aanpassen van fysiologische parameters van genezing 10, na het wijzigen van de hoeveelheid of de tijd van stabilisatie 11 na distractie osteogenesis 12 na vorming van een niet-eenheid 13 of na vorming van een kritische afwijking grootte. Hier hebben we laten zien hoe de gewijzigde Ilizarov fixators van toepassing voor het bestuderen van tibia fractuur genezing en afleiding osteogenese bij muizen.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite en te voldoen aan nationale richtlijnen.
1. Voorbereiding van Bevestigingsklemmen voorafgaand aan de operatie
- Voordat u gestabiliseerde breuk, moet men in elkaar te zetten de aangepaste ontwerp externe fixatie apparaat. De speciaal ontworpen externe fixatie frames bestond uit twee aluminium ringen gestabiliseerd door drie roestvrij staal # 0/56 draadstangen, 8 # 2/56 zeshoekige moeren, bouten en 17 matching (Small Part Inc, Miami Lakes, FL 3).
- Twee aluminium ringen nodig per breuk. Om een ring monteren 4 # 2/56 zeshoekige moeren (klein deel Inc, Miami Lakes, FL) en bijpassende bouten in de juiste gaten, moeten deze los blijft. Dit zal het proximale ring. Om de distale ring monteren 3 moeren en bouten, mag weer niet volledig vast.
2. Anesthesie, Fracture Schepping, en fixator Application
- Muizen (leeftijd, geslacht, en het lichaamgewicht bepaald door de gebruiker) worden verdoofd door intraperitoneale injectie van 50mg/ml Ketamine, 0,5 mg / ml Medetomidine (0,03 ml / muis).
- Breng het oog smeermiddel voor de ogen van de muizen en plaats een stuk tape over hun hoofd om hun ogen te beschermen tijdens de procedure.
- Het dier wordt geplaatst op een verwarmingselement voor de rest van de procedure.
- Transfix de proximale en distale metafyse van de linker scheenbeen met behulp van vier 0,25 mm steriele insecten pennen (Anticorro: Fine Science Tool, Foster City, CA) door het aanbrengen van de pennen op een Dremel gereedschap en boren ze door het bot.
- Pennen loodrecht op de lengteas van het scheenbeen en 90 ° met elkaar. Ten minste 10 mm tussen de proximale en distale pennen.
- Plaats de eerste ring boven de proximale pennen met de moeren naar binnen gericht, in de richting van de pinnen. Zet de pennen om de ring houden van de tibia centraal gepositioneerd binnen de aluminium ring.
- Plaats de tweede ring onder de diStal pinnen en zet de pennen om de ring met behulp van de zeshoekige moeren als voorheen. Voeg de vierde moer-bout combinatie om de distale fixator.
- Maken de dwarse breuk van driepuntsbuigsterkte met een geschikte inrichting. We maken gebruik van de ernst systeem van Bonnarens en Einhorn 4. Laat de posterolaterale oppervlak van het scheenbeen over de blokken, trekken het gewicht van een vooraf bepaalde hoogte langs de daling van de arm en laat het gewicht, zodat het contact maakt met de anterolaterale aspect van de tibia aan de stompe breuk te produceren. De hoogte van het gewicht is gedaald van te worden bepaald voor elke stam van de muis tot een breuk uitsluitend van het scheenbeen te garanderen.
- Fracture wordt bevestigd door X-ray.
- Na bevestiging van de breuk, worden drie roestvrij staal # 0/56 draadstangen bevestigd aan de ringen. Vanaf het distale uiteinde plaatsen van de staaf en draad een moer op de distale ring om de staaf vast te zetten. Dan nog een moer gezet op de stang, zal de proximale ring zitten op de top van deze nut. Zorg ervoor dat de twee ringen zal worden gehouden op gelijke afstand en worden niet overbelasting van de pinnen. Zet de proximale ring de staafjes met een derde noot.
- Subcutane injecties van buprenorfine (1,0 mg / kg) voor pijnstilling gegeven worden onmiddellijk na de operatie en de dieren worden gecontroleerd op pijn en gegeven buprenorfine als nodig is.
- Anesthesie wordt omgekeerd door het toedienen van Atipamezol, en de dieren worden gecontroleerd tot ze reageren en ambulating.
3. Afleiding Osteogenesis (zie ook: 12,13)
Om deze procedure te wijzigen om tegemoet afleiding osteogenesis is eenvoudig. De ringen zijn plaats gehouden door draadstangen, en door de moeren die de staven in plaats van de ringen elkaar kunnen worden verplaatst.
- Wachttijd: Voor standaard distractie osteogenese met behulp van dit model is de fixators worden geplaatst op het scheenbeen en het met rust gelaten voor een latentie periode van 5 dagen.
- Afleiding: Afleiding osteogenesis kan worden uitgevoerd door de moeren op het stabiliserende stangen kwartslag (0,25 mm) per dag 7 dagen.
- Rijping: Bony overbrugging wordt waargenomen door de 10 dagen en de volledige consolidatie wordt waargenomen door de 27 dagen na de voltooiing van afleiding.
4. Oprichting van een Critical Sized Defect
Een kritische grootte defect maken externe fixators toegepast zoals eerder beschreven met de volgende modificaties.
- Alvorens te beginnen met de procedure van de huid wordt gereinigd met 70% ethanol.
- De fixators zijn volledig voor toepassing op het maken van het defect.
- De muis is plaats dan onder de microscoop om het ontleden van de mediale tibia te visualiseren, en een incisie (5-7 mm) is gemaakt met een # 10 blad op een scalpel.
- De spier wordt voorzichtig doorsneden en gescheiden naar het midden van de diafyse van de tibia bloot te leggen.
- Een 3 mm segment van het bot verwijderd uit het midden diaphyse met een schaar. Met thij punt van de schaar, is het bot geknipt langzaam weg en botfragmenten worden verwijderd met een pincet, indien nodig. Voorzichtigheid moet worden betracht met de toppen van de schaar om te voorkomen dat het verplaatsen van de tibia met een grote mechanische kracht.
- Onderzoek de operatiewond om ervoor te zorgen dat er geen botfragmenten, omdat deze zou kunnen bevorderen genezing.
- Vervang de spieren rond de stompe uiteinden van de tibia.
- Sluit de incisie van de huid met 2-3 hechtingen van 6-0 Polyamine Monofilament.
- Anesthesie omgekeerd en worden de dieren gecontroleerd pijn gegeven analgetica zoals eerder beschreven.
5. Representatieve resultaten
Bij juiste toegepast externe fixators voorzien stijver stabiliteit van de gesloten tibiale breuk uitstekende vermindering (Fig. 1, 2). In sommige gevallen onvoldoende verlaging (een duidelijke en grote afstand tussen botuiteinden of meerdere breuken optreden (Fig. 3 (afb. 4). Wanneer daarentegen de breuk niet gestabiliseerd grote kraakbeen callus is gevormd in de breuk spleet (Fig. 5), en dit vervangen door bot door het proces van intramembraneuze botvorming.
Figuur 1. Röntgenfoto's ter illustratie van een externe fixatie apparaat dat wordt gebruikt om tibiale fractuur te stabiliseren. Röntgenfoto genomen na breuk met een goed afgestemd op het bot segmenten (pijlpunt).
Figuur 2. Beeld van een muizen na de fixator is aangebracht.
Figuur 3. Röntgenfoto genomen na fracture toont uitgelijnd en gefragmenteerde bot-segmenten (pijlpunt).
Figuur 4. Gestabiliseerde fractuur geneest via intramembraneuze ossificatie. Trichroom kleuring van gestabiliseerde breuk toont enkele nieuw bot (b) bij breuk site. Schaal bar = 500 pm.
Figuur 5. Niet-gestabiliseerde fractuur geneest via endochondrale ossificatie. Trichroom kleuring van niet-gestabiliseerde breuk vertoont kraakbeen (c) en bot (b) bij breuk. Schaal bar = 500 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bones helen door twee verschillende modaliteiten afhankelijk van de mechanische stabiliteit (beoordeeld in: 14). Wanneer instabiele grote kraakbeen template vormen nog in de breuk spleet die wordt vervangen door bot aan de beide einden van gebroken botten overbruggen. Proximaal en distaal van de breuk, bot vormt direct aan intramembraneuze verbening in het periost en endosteum. In tegenstelling, in stabiele fracturen genezing gebeurt uitsluitend via intramembraneuze ossificatie 3. Echter, de specifieke mechanismen die de overgang tussen deze twee processen te reguleren zijn niet bekend. Er zijn aanwijzingen dat stamcellen lot in reactie op de mechanische omgeving genetisch wordt geregeld en kan worden gewijzigd. In muizen die MMP9 kraakbeen vormen missen in plaats van de breuk van stabiele breuken wat erop wijst dat MMP9 betrokken is bij stamcelonderzoek beslissingen over het lot tijdens de breuk te herstellen 5. Kraakbeen kan ook worden geïnduceerd te vormen in een stabiele breuken of the Bone morfogenetisch proteïne(BMP) signaalweg wordt geactiveerd tijdens de breuk te herstellen 8,9. Om deze conclusies te trekken die stijve stabilisatie tijdens de vroege stadia van genezing is belangrijk, omdat deze stamcellen beslissingen over het lot zijn gemaakt tijdens de eerste paar dagen na letsel 11.
Onze methode van externe fixatie, indien correct toegepast kan worden gebruikt om het bot te stabiliseren intramembraneuze ossificatie beoordelen tijdens fractuurgenezing. Onze methode zorgt voor een breuk, samen met andere ledematen gewonden bij een hoge snelheid impact. Daarentegen kan boorgat-modellen die worden gebruikt om intramembraneuze ossificatie beoordelen niet overeen met trauma bij patiënten. Verder is de beschreven methode is gesloten, zodat complicaties een open wond niet verwarren interpretatie van de resultaten. Een andere veel voorkomende methode voor de stabilisatie maakt gebruik van plaatsing van een intramedullaire pin voorafgaand aan de breuk (bijv. 4). Deze techniek wordt algemeen toegepast en plaatsing van the pin is eenvoudig en efficiënt. Hoewel deze aanpak resulteert in laterale stabilisatie is niet in rotatie stabiliteit. De daaruit voortvloeiende schade geneest voornamelijk via endochondrale ossificatie die kan zonder stabilisatie worden bereikt op alle 3. Plated fixatie is ook gebruikt om de breuk stabilisatie bij muizen 15 te bereiken. Hierbij wordt een open breuk wordt gemaakt en speciaal interne fixators zijn aan het bot na osteotomie wordt. Net als bij onze aanpak van de interne fixatie methode zorgt voor stabiliteit en genezing vindt plaats via intramembraneuze ossificatie. We hoeven niet in acht belangrijke complicaties, pin-infecties of andere co-morbiditeit in verband met deze procedure, en de dieren in staat zijn om gemakkelijk te bewegen hun kooien. De belangrijkste nadelen zijn in de lengte van de tijd die nodig is om bekwaam te worden op deze methode, de tijd die nodig is om de procedure, en de eis voor teams van twee personen om de procedure uit te voeren. Ikn combinatie met genetische of fysiologische manipulaties aan de muizen, het vergelijken van gestabiliseerde niet-gestabiliseerde fractuur genezing geeft veel inzicht in de mechanismen die voortkomen lot van de cel reguleren tijdens de fractuurgenezing 5, en heeft het mogelijk gemaakt een onderzoek van afleiding osteogenesis 14, terwijl ook het verstrekken van ons een model van non-union 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door R01-AR053645 van NIAMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25mm insect pin | Fine Science Tools | 26000-25 | Blacked Anodized Steel, 0.25mm rod diameter, 4cm length |
| Stainless Steel Hex Nut | Small Parts, Inc. | #2-56 | 1/8" length, 56 threads per inch |
| Stainless Steel Hex Nut | Small Parts, Inc. | #0-80 | 1/8" length, 80 threads per inch |
| Stainless Steel Machine Screw | Small Parts, Inc. | #0-80 | 1/8" length, 80 threads per inch |
| Stainless Steel Machine Cut Threaded Rod | Small Parts, Inc. | #0-80 | 6" length, 80 threads per inch |
| 18-8 Stainless Steel Head Machine Screw | McMaster-Carr | 2-56 Threads, 3/6" length | |
| External Fixation Device | Machine shop | Custom-designed |
References
- Ilizarov, G. A., Lediaev, V. I., Shitin, V. P. The course of compact bone reparative regeneration in distraction osteosynthesis under different conditions of bone fragment fixation (experimental study). Eksperimentalnaia Khirurgiia i Anesteziologiia. 14, 3-12 (1969).
- Ilizarov, G. A., Deviatov, A. A. Surgical elongation of the leg. Ortopediia Travmatologiia i Protezirovanie. 32, (1971).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J. Orthop. Res. 20, 1091-1098 (2002).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal. J. Orthop. Res. 2, 97-101 (1984).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Lange, J. Action of IL-1beta during fracture healing. J. Orthop. Res. 28, 778-784 (2010).
- Xing, Z. Multiple roles for CCR2 during fracture healing. Dis. Model Mech. 3, 451-458 (2010).
- Lu, C. Recombinant human bone morphogenetic protein-7 enhances fracture healing in an ischemic environment. J. Orthop. Res. , (2009).
- Yu, Y. Y., Lieu, S., Lu, C., Colnot, C. Bone morphogenetic protein 2 stimulates endochondral ossification by regulating periosteal cell fate during bone repair. Bone. 47, 65-73 (2010).
- Lu, C., Miclau, T., Hu, D., Marcucio, R. S. Ischemia leads to delayed union during fracture healing: a mouse model. J. Orthop. Res. 25, 51-61 (2007).
- Miclau, T. Effects of delayed stabilization on fracture healing. J. Orthop. Res. 25, 1552-1558 (2007).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16, 636-642 (1998).
- Choi, P., Ogilvie, C., Thompson, Z., Miclau, T., Helms, J. A. Cellular and molecular characterization of a murine non-union model. J. Orthop. Res. 22, 1100-1107 (2004).
- Buckwalter, J. A., Marsh, E. T., J, L. Rockwood and Green's fractures in adults. Heckman, J. D., Bucholz, R. W. , Lippincott Williams & Wilkins. 245-271 (2001).
- Garcia, P. The LockingMouseNail-A New Implant for Standardized Stable Osteosynthesis in Mice. J. Surg. Res. , (2009).
