Summary
Microbubble بوساطة انقطاع الموجات فوق الصوتية وركزت على حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) هي تقنية واعدة لغير الغازية لتقديم الأدوية المستهدفة في الدماغ
Abstract
تركز الموجات فوق الصوتية (الفتح) تعطيل حاجز الدم في الدماغ (ب ب ب) هو أسلوب التحقيق على نحو متزايد للتحايل على 1-5 BBB. بى بى بى هو عقبة كبيرة أمام العلاجات الدوائية من اضطرابات في الدماغ كما أنه يحد من مرور الجزيئات من الأوعية الدموية إلى أنسجة المخ لجزيئات تقل ما يقرب من 500 دا في حجم 6. الفتح تعطل BBB التي يسببها (BBBD) هي مؤقتة وقابلة للانتكاس (4) ويحتوي على ميزة على المواد الكيميائية وسيلة للتحريض من قبل BBBD كونها محلية إلى حد كبير. الفتح بفعل BBBD يوفر وسيلة للتحقيق في الآثار المترتبة على مجموعة واسعة من العوامل العلاجية على الدماغ، والذي لن يكون إلا التسليم للأنسجة في تركيز كاف. في حين أن مجموعة واسعة من المعلمات بالموجات فوق الصوتية أثبتت نجاحها في تعطيل BBB 2،5،7، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة في إجراء تجارب للتأكد من التعطيل الناجح مع استهداف دقيقة. هذا protocالخطوط العريضة رأ كيفية تحقيق التصوير بالرنين المغناطيسي موجهة الفتح بفعل BBBD في نموذج الفئران، مع التركيز على إعداد الحيوان حرجة وخطوات التعامل مع microbubble التجربة.
Protocol
1. الموجات فوق الصوتية والتصوير بالرنين المغناطيسي الإعداد
تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المتوافقة مع ثلاثة محاور نظام الموجات فوق الصوتية وركزت في هذه الدراسة (الفتح الآلات، وشركة، تورنتو، أونتاريو، كندا). واستخدمت اثنين من محولات الطاقة بالموجات فوق الصوتية المختلفة: 1 في منزل شيد 551.5 كيلو هرتز كرويا التي تركز على محول (دائرة نصف قطرها من انحناء = 60 ملم، القطر الخارجي = 75 ملم، القطر الداخلي = 20 ملم)، و1،503 ميغاهيرتز، و 8 في القطاع مع مجموعة متكاملة PZT مائي (Imasonic شركة، Voray سور L'Orgnon، فرنسا) مدفوعة كما محول واحد كرويا عنصر ركز (الجبهة الوطنية = 0.8، فتحة = 10 سم). تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المتوافقة مع PVDF المتلقي 8 لتسجيل انبعاثات الصوتية عندما تم استخدام محول 551،5 كيلو هرتز. إذا تم استخدام معدات مختلفة، وفيما يلي المقترح:
- اختيار المناسب، محول بالموجات فوق الصوتية معايرة مع تواتر مركز في نطاق ميغاهيرتز ميغاهيرتز 0.25 -1.5 وطائرة من طراز اف رقم (دائرة نصف قطرها من انحناء / فتحة) من 1 أو أقل.
- وضع فاي حمام ماءlled مع، degassed الماء الدافئ دي المتأينة، على السرير لتي 1.5 أو التصوير بالرنين المغناطيسي 3 تي. يجب على حمام مائي لديها لوحة الأعلى التي يمكن أن تعقد هذه الحيوانات. تركيب محول بالموجات فوق الصوتية في خزان على التصوير بالرنين المغناطيسي المتوافقة مع مرحلة وضع ثلاثة محاور أو نظام 9، التي تواجه سطح الماء.
- تشغيل كابل محول للمعدات الموجات فوق الصوتية من خلال لوحة القيادة الاختراق.
- توليد إشارة القيادة محول باستخدام مولد وظيفة والسلطة مكبر للصوت. استخدام دائرة خارجية مطابقة للتقليل من قوة تنعكس الكهربائية.
- معرفة طول محول التنسيق، ووضع محول التركيز على سطح الماء ويصوتن سطح الماء لتوليد نافورة ماء وضوحا. خطوات 1.6 و 1.7 تصف كيفية تسجيل التركيز باستخدام نافورة ماء ولدت. وهناك طريقة أكثر دقة لتحديد مكان والتركيز، والذي ينطوي على sonicating حرارة امتصاص الجل والتصوير وارتفاع درجة الحرارة الناتجة في التركيز مع التصوير بالرنين المغناطيسي، ويمكن العثور عليها في 9 </ سوب>.
- في تحديد موقع التركيز باستخدام علامة من شأنها أن تكون مرئية على صور الرنين المغناطيسي. ويمكن القيام بذلك باستخدام لوحة مع وجود ثقب مركز الذي سوف يملأ بالماء عند وضعه على التركيز. وسوف الثقب مملوءة بالماء تكون مرئية على التصوير بالرنين المغناطيسي وسوف توفر إحداثيات محورية في طائرتين، في حين يمكن تحديد الإحداثيات في الاتجاه المحوري للمحول من سطح الماء.
- باستخدام تسلسل وكالايزر 3-طائرة، صورة علامة التركيز وتسجيل الموقع من التركيز في تنسيق نظام التصوير بالرنين المغناطيسي.
- لمراقبة الانبعاثات الصوتية، والإعداد لإجراء 8 هيدروفونات MR-المتوافقة التي يتم استخدام جهاز الكشف عن التجويف السلبي (PCD) في حمام مائي تستهدف التركيز محول، أو استخدام محول مع مائي متكامل.
- تشغيل الكابلات PCD إلى بطاقة نطاق هذا هو سريع بما فيه الكفاية لالتقاط رشقات نارية من ما يصل الى 10 مللي في PRFs لتصل إلى 2 هرتز (على سبيل المثال ATS460، AlazarTech، بوانت كلير، كيبيك، كندا). يجب أن ترتكز على الكابلات penetration لوحة أو درع الترددات اللاسلكية للحد من الضوضاء.
2. حيوان التحضير
- تخدير الحيوانات باستخدام الغاز isofluorane. منذ isofluorane له تأثير على تعطيل BBB 10، ينبغي أن تؤخذ هذه الحيوانات قبالة الغاز 10 دقيقة قبل بدء التجربة. مرهم مكان تشحيم العين في كل عين في بداية التخدير لحماية القرنية من الجفاف أو إصابة أخرى.
- استخدام الحلاقة الكهربائية حلق الفراء من أعلى رأس الحيوان والرقبة، ثم إزالة الفراء المتبقية باستخدام كريم مزيل الشعر (مثل نير، الكنيسة وشركاه دوايت، برينستون، نيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية)، وشطف فروة الرأس بالماء والصابون المعتدل و المياه.
- إعداد الذيل مع betadine فرك الجلد يتبعه غسل bridine. إجراء wipedown نهائي مع الكحول من أجل تصور السياق الذيل.
- ادخال قسطرة قياس 22 مع 3 في اتجاه ومحبس في الوريد الذيل والاحمرار مع خليط الهيبارين / ملحي (33 يو / مل) لمنع تشكيل جلطةفي القسطرة.
- تسليم مواد التخدير عن طريق الحقن (40-50 مغ / كغ من الكيتامين، 10 ملغ / كلغ زيلازين) عن طريق الحقن العضلي، وإزالة الحيوان من isofluorane.
- وضع مستلق تخدير الحيوان على الموجات فوق الصوتية نظام تحديد المواقع مع أعلى الرأس الاتصال بالحمام المائي من خلال ثقب في لوحة قمة (Fig.1). هلام ربما تطبق كمية صغيرة من الموجات فوق الصوتية إلى أعلى رأس الحيوان إلى تقليل فرصة airbubbles المحاصرين.
- شريط الساقين لنظام تحديد المواقع. ويمكن عقد الرأس في مكان إما باستخدام شريط لدغة، إن وجدت، أو شريط وضعت بحزم عبر الذقن.
- تغطية الحيوان بمنشفة وتوزيع بطانية المياه من أجل الحفاظ عليه دافئا.
3. اختيار الهدف
الحصول على خط الأساس المحوري T 2-T 1 الموزون والمرجحة صور الرنين المغناطيسي للدماغ. إذا باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي وتي 1،5 مخصصة رئيس الحجم لفائف سطح RF-استقبال، ومناسبة SCقد تكون المعلمات 1:
T 2 الموزون: FSE، TE = 60 مللي، TR = 2000 مللي
T 1 المرجحة: FSE، TE = 10 مللي، TR = 500 مللي- تحديد الهدف من T-2 المرجح بالاشعة، وتجنب البطينين وخط الوسط في الدماغ، وتحديد عمق منتصف الدماغ.
- نقل التركيز محول إلى موقع الهدف.
4. Microbubble التحضير
وتستخدم microbubbles Definity (Lantheus التصوير الطبي، MA، الولايات المتحدة) من قبل عدة مجموعات لFUS بوساطة microbubble الناجمة BBBD 2،5،7. ويمكن الاطلاع على جرعات مناسبة للأنواع الأخرى microbubble في الأدب 11،12.
- تفعيل microbubbles Definity ورسم ببطء حجم صغير إلى حقنة 1 مل باستخدام إبرة قياس 18.
- إزالة الهواء المحبوس من الحقنة بلطف عن طريق تحريك المكبس ذهابا وإيابا. لا تنصت على حقنة وهذا يمكن أن تكسر الفقاعات.
- تمييع Definity في العادي المالحة في نسبة 10:01 المالحة إلى Definty عن طريق حقن ببطء حجم المطلوب من Definity إلى حقنة من المياه المالحة. إذا استخدم تسليم التسريب، يمكن أن يكون أبعد Definity الواحد، إلى 50:1 أو 100:1.
- عكس بلطف المحقنة إلى مزيج دقيق من Definity والمالحة حتى يتحقق حتى ظهور. قد انعكاس لطيف من الحقنة مباشرة قبل الحقن يكون من الضروري أيضا إذا فقاعات بدأت تطفو من التعليق.
- حساب حجم الجرعة المطلوبة على أساس 0،02 مل / كجم من Definity، أو 0.2 مل / كغ من الحل (في تخفيف 10:01).
5. الموجات فوق الصوتية التسليم
- تعيين المعلمات صوتنة، وذلك باستخدام منخفضة رشقات نارية دورة العمل، وليس sonications موجة مستمرة. المعلمات صوتنة المناسبة عند 0.5 ميغاهيرتز هي 0،23 ميغاباسكال في ضغط الموضع، و 10 مللي رشقات نارية في PRF هرتز 1، 2 دقيقة. مجموع صوتنة وقت. بنحو 1.5 ميغاهيرتز المناسب في الموقع الضغوط تقع حول 0،45-،5 ميغاباسكال.
- تأكد من أن يقترن لا يزال رأس الحيوان للماء.
- حقن microbubbles ببطء في ذيل قسطرة الوريد وتدفق المياه المالحة مع 0.5 مل العادية. بدء صوتنة في وقت واحد مع بداية الحقن.
6. التصوير بالرنين المغناطيسي لتقييم نتائج المعالجة
- بعد صوتنة، حقن عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي (على سبيل المثال 0.2 مل / كغ Omniscan، وجنرال الكتريك للرعاية الصحية) عن طريق قسطرة الوريد الذيل يتبعه تدفق 0.5 مل المالحة.
- نفذ تي 1-مرجح التصوير حتى في ذروة المقابل قد مرت. وسوف المواقع صوتنة التي تعطلت بنجاح إظهار أكبر زيادة من الأنسجة المحيطة.
- أداء T-2 مرجح التصوير للتحقق من وذمة. إشارة عالية في مواقع صوتنة يدل على وذمة.
7. ممثلالنتائج
ويمكن عوامل التباين التصوير بالرنين المغناطيسي تسليمها بنجاح من خلال BBB باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة وتعميم microbubbles. ويبين الشكل 2 قبل نموذجية وبعد الفتح تي 1-W الصور. الرقم 2B يظهر تباين محسن (م) تي 1-W صورة مع فتحات التنسيق متميزة في أربعة مواقع sonicated. مواقع صوتنة 1 و 2 إظهار تعزيز مشرق خاصة. ويمكن أيضا في Fig.3 المواقع 1 و 2 أن ينظر لتتوافق مع T-2 ث إشارة عالية، مشيرا إلى وذمة.
مدى يمكن أن تي 2-W وذمة في بعض الأحيان يكون أكثر سهولة في تصور شرائح سهمي. ويبين الشكل 4 CE-T 1-W و T-2 ث شرائح سهمي من خلال مواقع صوتنة 1 و 3. وذمة مرئيا في الموقع 1 ولكن لا مكان 3.
قد التحليل الطيفي من القبض على بيانات الانبعاثات الصوتية (Fig.5) تظهر انبعاثات متناسق و / أو دون / فائقة انبعاثات التوافقي عندما التجويف مستقر يحدث. هارمونيمكن أن تنشأ أيضا ICS من الأنسجة غير linearities، في حين أن انبعاثات الفرعية وultraharmonic يمكن أن يحدث فقط نتيجة لنشاط فقاعة 14. قد عند ارتفاع الضغوط أيضا من انبعاثات النطاق العريض مشيرا إلى التجويف بالقصور الذاتي يمكن الكشف عنها. لكن ارتبطت هذه مع كميات أكبر من خلايا الدم الحمراء extravasations وmicrodamage من sonications بدون التجويف بالقصور الذاتي 11.
استخدام ترددات أعلى صوتنة النتائج في فتحات أكثر محلية نظرا لحجم أصغر بقعة الوصل. ويبين الشكل 6 يمكن أن تستخدم ترددات أعلى لإنشاء مناطق أصغر من الافتتاح. وهذا يسمح التحقيق في الآثار منتصف المخ مع التقليل من الآثار القريبة من الجمجمة.
الشكل 1. الإعداد التجريبية.
الشكل 2. قبل (يسار) وآخر (يمين) 1-T علاج دبليو صورا لدماغ فأر تبين زيادة في مواقع صوتنة الأربعة.
الشكل 3. قبل (يسار) وآخر (يمين) 2-T علاج دبليو صورا لدماغ الفئران (حيوان نفس Fig.2) تظهر T-2 ث وذمة في مواقع صوتنة 1 و 2.
الشكل 4. آخر العلاج سهمي تي 1-W (يسار) وT-2 ث (يمين) وصور من الدماغ الفئران نفسه كما التين. 2 و 3. افتتاح الموقع في 1 (يسار) يرتبط T-2 ث وذمة (يمين). 3 الموقع يظهر الافتتاح (يسار) ولكن لا T-2 ث وذمة. 
الشكل 5. الطيف الترددي من البيانات التي تم التقاطها خلال دفعة واحدة مللي 10 في 551،5 كيلو هرتز. تواتر الأساسية و (0)، فضلا عن التوافقيات (2 و 0) وشبه / ultraharmonics (0.5 و 0، 1،5 و 0) مرئية.
الشكل 6. آخر العلاج CE-T-1 ث محوري (يسار) والسهمي (يمين) صور من الدماغ الفئران sonicated في أربعة مواقع في 1،503 ميغاهرتز. وينظر الى فتحات BBB في هذا التردد لتكون أكثر محلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اعداد الحيوانات وmicrobubbles هي الجوانب الأكثر أهمية من هذا الإجراء. يجب أن يكون الشعر على رأس الحيوان إزالتها تماما لتفادي التخفيف من شعاع الموجات فوق الصوتية. يمكن أن تعطل BBB تحت مخدر isofluorane، ومع ذلك، فإنه يصبح أكثر صعوبة لتحقيق افتتاح متسقة.
وينبغي دائما microbubbles يمكن التعامل معها بحذر وقياس صغير، يجب استخدام الإبر قطرها كبير عند وضع، وذلك لتجنب كسر لهم. وبالمثل، ينبغي أن تستخدم القسطرة أصغر قياس والتي يمكن استخدامها بشكل معقول في هذا السياق ذيل (ينصح 22 مقياس). إذا كان مطلوبا أو أصغر قسطرة لتحقيق وضع ملائم في هذا السياق فلا بد من اتخاذ المزيد من الحيطة خلال حقن microbubble. وينبغي دائما على حقن microbubble يتم ببطء.
وينبغي دائما sonications وضع الاندفاع استخدامها. إذا تم استخدام sonications موجة مستمرة سوف microbubbles لا تجديد وليس في الأوعية الدموية في التركيز ومحول BBBD يمكن تحقيقه. إذا CE-T-1 ث الصور بعد العلاج لا تظهر انقطاع، ويمكن تكرار العلاج التحقق من أن يتم تجاوز مستوى المياه حتى أن رئيس الحيوانات في المياه وعدم وجود فقاعات الهواء المحتبسة على سطح الجلد .
ترددات أعلى تقديم أفضل التوطين في نماذج حيوانية صغيرة ولكنها تتطلب ارتفاع في ضغط الموقع للحث على فتح. من المهم أيضا النظر في ذلك الخسائر الناجمة عن الجمجمة هي أعلى في ارتفاع ضغط، ويجب أخذها في الاعتبار عند تقدير لضغوط في الموقع. في انتقال 0.5 ميغاهيرتز من خلال جمجمة فأر ما يقرب من 73٪ 8، ولكن تنخفض إلى ما يقرب من 50٪ 15 بنحو 1.5 ميغاهيرتز. ويمكن الافتراض أن يكون تخفيف أرستها 5 م -1 ميغاهيرتز -1 في أنسجة المخ 4. تتلاءم بشكل أفضل ترددات أعلى للعمل في نماذج حيوانية صغيرة ولكنها أقل سريريا ذات الصلة.
خيمة "> هذا النهج التصوير بالرنين المغناطيسي موجهة يوفر مزايا أكثر من التقنيات الموجهة بالأمواج فوق الصوتية عن طريق السماح للدقيقة للغاية استهداف فضلا عن العلاج تقييم النتائج على الفور بعد العلاج.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ك. Hynynen وشوبرا ر هم المؤسسين من آلات الفتح، وشركة آر شوبرا، Waspe ألف وHynynen K. يمتلكون أسهما في آلات الفتح، وشركة ك. Hynynen يتلقى دعما من شركة البحوث الفتح، والصكوك
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر شونا Rideout-جروس وغارسيس الكسندرا لمساعدتهم مع رعاية الحيوان، وبينغ وو للحصول على المساعدة التقنية لها. وقدم الدعم لهذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت أي منحة. EB003268، وبرنامج كراسي البحث كندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Animal Focused Ultrasound System | FUS Instruments, Inc. | RK-100 | |
| Definity | Lantheus Medical Imaging | ||
| Omniscan | GE Healthcare |
References
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11719-11723 (2006).
- Jordão, J. F., Ayala-Grosso, C. A., Markham, K., Huang, Y., Chopra, R., McLaurin, J., Hynynen, K., Aubert, I. Antibodies targeted to the brain with image-guided focused ultrasound reduces amyloid-beta plaque load in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 5 (5), e10549-e10549 (2010).
- Liu, H. -L., Hua, M. -Y., Chen, P. -Y., Chu, P. -C., Pan, C. -H., Yang, H. -W., Huang, C. -Y., Wang, J. -J., Yen, T. -C., Wei, K. -C. Blood-brain barrier disruption with focused ultrasound enhances delivery of chemotherapeutic drugs for glioblastoma treatment. Radiology. 255, 415-425 (2010).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Choi, J. J., Wang, S., Tung, Y. -S., Morrison, B., Konofagou, E. E. Molecules of various pharmacologically-relevant sizes can cross the ultrasound-induced blood-brain barrier opening in vivo. Ultrasound Med. Biol. 36, 58-67 (2010).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound Med. Biol. 35, 1298-1308 (2009).
- O'Reilly, M. A., Hynynen, K. A PVDF receiver for ultrasound monitoring of transcranial focused ultrasound therapy. IEEE Trans. Biomed. Eng. 57, 2286-2294 (2010).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Med. Phys. 36, 1867-1874 (2009).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-Brain Barrier Disruption and Vascular Damage Induced by Ultrasound Bursts Combined with Microbubbles can be Influenced by Choice of Anesthesia Protocol. Ultrasound Med. Biol. , (2011).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Yang, F. -Y., Liu, S. -H., Ho, F. -M., Chang, C. -H. Effect of ultrasound contrast agent dose on the duration of focused-ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. J. Acoust. Soc. Am. 126, 3344-3349 (2009).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound Med. Biol. 34, 834-840 (2008).
- Neppiras, E. A. Acoustic Cavitation. Physics Reports (Review Section of Physics Letters). 61, 159-251 (1980).
- O'Reilly, M. A., Huang, Y., Hynynen, K. The impact of standing wave effects on transcranial focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier in a rat model. Phys. Med. Biol. 55, 5251-5267 (2010).
