MR-veiledet Forstyrrelse av blod-hjerne-barrieren ved hjelp Transkraniell fokusert ultralyd i en rotte Model

Summary

Mikrobobleutskillere-mediert fokusert ultralyd forstyrrelse av blod-hjerne barrieren (BBB) ​​er en lovende teknikk for ikke-invasiv målrettet levering av legemidler i hjernen

Abstract

Fokusert ultralyd (FUS) forstyrrelse av blod-hjerne barrieren (BBB) ​​er en stadig etterforsket teknikk for å omgå BBB ^1-5. BBB er et betydelig hinder for farmasøytiske behandlinger av hjernen lidelser som det begrenser passasje av molekyler fra blodkar i hjernen vev til molekyler mindre enn ca 500 DA i størrelse ^6. FUS indusert BBB avbrudd (BBBD) er midlertidig og reversibel ⁴ og har en fordel over kjemiske midler for å indusere BBBD ved å være svært lokalisert. FUS indusert BBBD gir et middel for å undersøke virkningene av et bredt spekter av terapeutiske agenter på hjernen, noe som ellers ikke ville være leveransen til vevet i tilstrekkelig konsentrasjon. Mens et bredt spekter av ultralyd parametere har vist seg vellykket på å forstyrre BBB ^2,5,7, er det flere kritiske trinn i den eksperimentelle prosedyren for å sikre en vellykket avbrudd med nøyaktig målretting. Dette protocol skisserer hvordan å oppnå MRI-guidede FUS indusert BBBD i en rotte modell, med fokus på kritiske dyret forberedelse og mikrobobleutskillere håndtering trinn i eksperimentet.

Protocol

1. Ultralyd og MR Setup

En MR-kompatible tre akser fokusert ultralyd system ble brukt i denne studien (FUS Instruments, Inc., Toronto, Ontario, Canada). To forskjellige ultralyd transdusere ble brukt: en i-hus bygd 551,5 kHz sfærisk-fokusert svinger (krumningsradius = 60 mm, ytre diameter = 75 mm, innvendig diameter = 20 mm), og en 1,503 MHz, 8-sektoren array med integrert PZT hydrofon (Imasonic Inc., Voray-sur-L'Orgnon, Frankrike) drevet som et enkelt element sfærisk fokusert transducer (Fn = 0,8, blenderåpning = 10 cm). En MR-kompatibel PVDF mottaker ⁸ ble benyttet til å registrere akustiske utslipp når den 551,5 kHz svinger ble brukt. Dersom annet utstyr brukes, er følgende foreslått:

1. Velg en passende, kalibrert ultralyd svinger med et senter frekvens i størrelsesorden 0,25 MHz -1,5 MHz og en F-nummer (krumningsradius / blenderåpning) på 1 eller mindre.
2. Plasser et vannbad filled med varme, avgasset, de-ionisert vann på sengen av en 1,5 T eller 3 T MRI. Vannbadet bør ha en topp-plate som kan holde dyrene. Monter ultralyd transducer i tanken på en MR-kompatibel tre akser posisjonering scene eller system ^9, vendt mot vannflaten.
3. Kjør svingerkabelen til ultralyd kjøring utstyret gjennom en penetrasjon panel.
4. Generer svingeren kjøring signal ved hjelp av en funksjon generator og effektforsterker. Bruk en ekstern matching krets for å minimere den reflekterte elektrisk kraft.
5. Knowing svingeren brennvidde, plasserer svingeren fokus på vannoverflaten og sonicate vannoverflaten for å generere et synlig vannfontene. Trinn 1,6 og 1,7 beskrive hvordan du registrerer fokus bruke den genererte vannfontene. En mer presis metode for å lokalisere fokus, som innebærer sonicating en varme absorberende gel og bildebehandling den resulterende temperaturen høyde i fokus med MR, kan finnes i ^{9 <}/ Sup>.
6. Merk plasseringen av fokus ved hjelp av en markør som vil være synlig på MR-bilder. Dette kan gjøres ved hjelp av en tallerken med et senter hull som blir fylt med vann når den plasseres over fokus. Den vannfylt hull vil være synlig på MR og vil gi fokale koordinater i to plan, mens koordinatsystemet i aksial retning av svingeren kan bestemmes fra vannoverflaten.
7. Ved hjelp av en 3-fly localizer sekvens, bilde fokus markør og lagre plasseringen av fokus i MR koordinatsystem.
8. For å overvåke akustiske utslipp, montere en MR-kompatibel hydrofon ⁸ som brukes som en passiv kavitasjon detektor (PCD) i vannbad rettet mot transduseren fokus, eller bruke en svinger med integrert hydrofon.
9. Kjør PCD kabler til et omfang kort som er tilstrekkelig rask til å fange serier på opptil 10 ms ved PRFs opp til 2 Hz (f.eks ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Quebec, Canada). Kabler må være jordet til penenen panel eller RF skjold for å redusere støy.

2. Animal Forberedelse

1. Anesthetize dyrene bruker isofluorane gass. Siden isofluorane har en effekt på BBB avbrudd ^10, bør dyrene tas av gassen 10 minutter før starten av forsøket. Place okulær smøremiddel salve på hvert øye ved starten av anestesi å beskytte hornhinnen fra uttørking eller annen skade.
2. Bruke en elektrisk barbermaskin barbere pelsen fra toppen av dyrets hode og hals, deretter fjerne gjenværende pelsen med en Hårfjerningskrem (f.eks Nair, Church & Dwight Co, Princeton, NJ, USA) og skyll hodebunnen med mild såpe og vann.
3. Forbered halen med en Betadine hud skrubb etterfølges av en bridine vask. Utfør en endelig wipedown med alkohol for å visualisere halen blodåre.
4. Sett inn en 22 gauge kateter med 3-veis kran inn i halen venen og skyll med en heparin / saltvann blanding (33 U / ml) for å hindre dannelse av blodpropperi kateteret.
5. Lever injiserbare bedøvelse (40-50 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin) via intramuskulær injeksjon, og fjern dyret fra isofluorane.
6. Plasser bedøvet dyret liggende på ultralyd posisjoneringssystemet med toppen av hodet kontakte waterbath gjennom et hull i topp-plate (Fig.1). En liten mengde ultralyd gel kanskje brukt til toppen av dyrets hode for å minimere sjansen for fanget airbubbles.
7. Tape bena til posisjoneringssystem. Hodet kan holdes på plass ved hjelp av enten en matbit bar, hvis tilgjengelig, eller tape plasseres fast over haken.
8. Dekk dyret med et håndkle og sirkulerende vann teppe for å holde den varm.

3. Target Selection

1. Tilegne baseline aksial _T2-vektede og T _1-vektede MR-bilder av hjernen. Hvis du bruker en 1,5 T MR og dedikert head-sized RF-motta overflate coil, egnet fmen parametre kan være:
   
   T ₂ vektet: FSE, TE = 60 ms, TR = 2000 ms
   T ₁ vektet: FSE, TE = 10 ms, TR = 500 ms

2. Velg målet fra T _2-vektede skanninger, unngå ventriklene og hjernen midtlinjen, og velge en mid-hjerne dybde.
3. Flytt svingeren fokus til målplasseringen.

4. Mikrobobleutskillere Forberedelse

Definity mikrobobler (Lantheus Medical Imaging, MA, USA) er brukt av flere grupper for mikrobobleutskillere medierte FUS indusert BBBD ^2,5,7. Passende doser for andre mikrobobleutskillere typer finnes i litteraturen ^11,12.

1. Aktiver Definity mikrobobler og langsomt utarbeide et lite volum i en 1 ml sprøyte med en 18-gauge kanyle.
2. Fjern all luft fra sprøyten ved å forsiktig bevege stempelet frem og tilbake. Ikke trykk på sprøyten da dette kan ødelegge boblene.
3. Fortynn Definity i normal saltvann i forholdet 10:01 saltvann til Definty ved sakte å injisere den nødvendige volumet av Definity inn en sprøyte med saltvann. Hvis en infusjon levering brukes, kan den Definity bli ytterligere utvannet, til 50:1 eller 100:1.
4. Snu forsiktig på sprøyten til grundig blande Definity og saltvann til en enda utseende er oppnådd. Lett inversjon av sprøyten umiddelbart før injeksjon kan også være nødvendig hvis boblene har begynt å flyte ut av suspensjon.
5. Beregn den nødvendige dosen volum basert på 0,02 ml / kg av Definity, eller 0,2 ml / kg av løsningen (ved 10:01 fortynning).

5. Ultralyd Levering

1. Still sonikator parametrene, bruker lave driftssyklus bursts, ikke kontinuerlig bølge sonications. Passende sonikator parametre på 0,5 MHz er 0,23 MPa in situ press, 10 ms brister ved 1 Hz PRF, 2 min. total sonikator tid. På 1,5 MHz hensiktsmessig in situ presset faller rundt 0,45 til 0,5 MPa.

_content "> Passende press på ulike frekvenser kan estimeres ved hjelp av en mekanisk indeks på 0,46 ^13.

2. Kontroller at dyrets hode er fortsatt koblet til vannet.
3. Injiser mikrobobler sakte inn i halen venen kateteret og skyll med 0,5 ml fysiologisk saltvann. Begynn sonikator samtidig med oppstart av injeksjon.

6. MR Evaluering av Behandlingsresultat

1. Etter sonikator, injisere en MR kontrastmiddel (f.eks 0,2 ml / kg Omniscan, GE Healthcare) via halen venen kateteret etterfulgt av en 0,5 mL saltvann flush.
2. Utfør T _1-vektede bildebehandling inntil kontrasten toppen er passert. Sonikator nettsteder som har blitt forstyrret vil vise større forbedring enn det omkringliggende vevet.
3. Utfør T _2-vektede bildebehandling for å se etter ødem. Høy signal på sonikator nettstedene er tegn på ødem.

7. RepresentantResultater

MR kontrastmidler kan være vellykket leveres gjennom BBB med fokusert ultralyd og sirkulerende mikrobobler. Figur 2 viser typisk pre-og post-FUS T _1-w bilder. Figur 2B viser en kontrast (CE) T _1-w bilde med tydelige fokale åpninger i fire sonicated steder. Sonikator steder 1 og 2 viser spesielt lyse ekstrautstyr. I Fig.3 steder 1 og 2 kan også ses å korrespondere med T _2-w høyt signal, som indikerer ødem.

Omfanget av T _2-w ødem kan noen ganger være lettere visualisert på sagittal skiver. Figur 4 viser CE-T _1-w og T _2-w sagittal skiver gjennom sonikator steder 1 og 3. Ødem er synlig på stedet 1, men ikke sted tre.

Spektralanalyse av fanget akustiske utslippsdata (Fig.5) kan vise harmoniske utslipp og / eller underleverandører / ultra harmoniske utslipp når stabil kavitasjon oppstår. Harmonics kan også oppstå fra vev ikke-linearities, mens sub og ultraharmonic utslipp kan bare oppstå som et resultat av boble aktivitet ^14. Ved høyere trykk wideband utslipp indikerer treghet kavitasjon kan også påvises. Men disse har vært forbundet med større mengder av røde blodlegemer extravasations og microdamage enn sonications uten treghet kavitasjon ^11.

Bruk av høyere sonikator frekvenser resulterer i mer lokaliserte åpninger på grunn av den mindre brennvidde spot størrelse. Figur 6 viser at høyere frekvenser kan brukes til å lage mindre regioner i åpningen. Dette gjør etterforskningen av effekter midten av hjernen med færre nær-skull effekter.

Figur 1. Experimental oppsett.

Figur 2. Pre (til venstre) og etter (høyre) behandling T _1-w bilder av en rotte hjerne som viser forbedring på fire sonikator steder.

Figur 3. Pre (til venstre) og etter (høyre) behandling T _2-w bilder av en rotte hjerne (samme dyr som Fig.2) viser T _2-w ødem ved sonikator steder 1 og 2.

Figur 4. Post behandling sagittal T _1-w (venstre) og T _2-w (høyre) bilder fra samme rottehjernen Figs as. 2 og 3. Åpningen på stedet 1 (venstre) korrelerer med T _2-w ødem (til høyre). Beliggenhet 3 viser åpningen (til venstre) men ingen T _2-w ødem.
Figur 5. Frekvensspektrum fra data tatt under en enkelt 10 ms serieopptak på 551,5 kHz. Den grunnleggende frekvensen (f ₀₎ samt harmoniske (2 f ₀₎ og Sub / ultraharmonics (0,5 f _0, 1.5 f ₀₎ er synlige.

Figur 6. Post behandling CE-T _1-w axial (venstre) og sagittal (høyre) bilder fra en rotte hjerne sonicated i fire steder på 1,503 MHz. BBB åpninger på denne frekvensen er sett til å være mer lokalisert.

Discussion

Forberedelse av dyrene og mikrobobler er de mest kritiske aspekter ved denne prosedyren. Pelsen på dyrets hode må helt fjernet for å unngå demping ultralydstrålen. BBB kan bli avbrutt etter isofluorane bedøvelse, men blir det vanskeligere å oppnå konsistent åpning.

Mikrobobler skal alltid behandles med forsiktighet og liten måler, må med stor diameter nåler brukes ved utarbeiding, for å unngå å bryte dem. Likeledes bør den minste måleren kateteret som med rimelighet kan brukes i halen venen være ansatt (22-gauge anbefales). Hvis en mindre kateter er nødvendig for å oppnå riktig plassering i venen så ekstra hensyn må tas under mikrobobleutskillere injeksjon. De mikrobobleutskillere injeksjoner bør alltid skje langsomt.

Burst mode sonications bør alltid benyttes. Hvis kontinuerlig bølge sonications brukes mikrobobler ikke vil fylle inn i skip ved svingeren fokus og BBBD ikke vil bli oppnådd. Dersom CE-T _1-w bilder etter behandling ikke viser avbrudd, kan behandlingen gjentas sjekke at vannivået er toppet opp slik at dyr hode er i vannet og at det ikke er luftbobler som er fanget på hudoverflaten .

Høyere frekvenser gir bedre lokalisering i små dyremodeller, men krever høyere i situ press for å indusere åpning. Det er også viktig å tenke på at tap som følge av skallen er høyere ved høyere trykk og må tas hensyn til ved beregning av in situ press. Ved 0,5 MHz overføring gjennom rotte skallen er ca 73% ^8, men synker til omtrent 50% ¹⁵ på 1,5 MHz. Demping kan antas å være 5 Np m ^-1 MHz ^-1 i hjernevev ^4. Høyere frekvenser er bedre egnet for arbeid i små dyremodeller, men er mindre klinisk relevant.

telt "> Dette MRI-guided tilnærmingen gir fordeler over ultralyd-guidede teknikker ved at svært presis målretting samt behandlingsresultat vurdering umiddelbart etter behandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Animal Focused Ultrasound System	FUS Instruments, Inc.	RK-100
Definity	Lantheus Medical Imaging
Omniscan	GE Healthcare