Guiada por MRI rompimento da barreira hemato-encefálica utilizando Ultrassom Focalizado transcraniana em um modelo de rato

Summary

Microbolhas mediada ruptura ultra-som focalizado da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​é uma técnica promissora para não-invasivo de entrega de drogas alvo no cérebro

Abstract

Ultra-som concentrado ruptura (FUS) da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​é uma técnica cada vez mais investigada para contornar a ^1-5 BBB. O BBB é um obstáculo significativo para tratamentos farmacêuticas de distúrbios cerebrais em que limita a passagem de moléculas da vasculatura dentro do tecido cerebral a moléculas inferior a cerca de 500 Da em tamanho ^6. FUS induzida perturbação BBB (BBBD) é temporária e reversível ⁴ e tem uma vantagem sobre química meio de induzir BBBD por ser altamente localizado. FUS induzida BBBD proporciona um meio para investigar os efeitos de uma ampla gama de agentes terapêuticos sobre o cérebro, o que não seria de outro modo ser fornecida ao tecido em concentração suficiente. Enquanto uma vasta gama de parâmetros de ultra-som têm sido bem sucedidos de perturbar o BBB ^2,5,7, existem vários passos críticos no procedimento experimental para assegurar o rompimento de sucesso com a segmentação precisas. Este protocolocontornos ol como conseguir guiada por MRI FUS induzidas BBBD em um modelo de rato, com um foco na preparação animal crítica e etapas de manuseio de microbolhas do experimento.

Protocol

1. Ultra-sonografia e ressonância magnética de configuração

Uma ressonância magnética compatível com três eixos do sistema de ultra-som foi utilizado neste estudo (FUS Instruments, Inc., Toronto, Ontario, Canadá). Dois transdutores de ultra-som foram utilizados diferentes: um in-house construído 551,5 kHz transdutor esfericamente focada (raio de curvatura = 60 mm, diâmetro externo = 75 mm, diâmetro interno = 20 mm), e uma MHz 1,503, matriz 8-sector com integrado PZT hidrofone (Imasonic Inc., Voray-sur-L'Orgnon, França) dirigido como um único elemento transdutor esfericamente focado (FN = 0,8, abertura = 10 cm). Uma ressonância magnética compatível com PVDF receptor ⁸ foi utilizado para gravar emissões acústicas quando o transdutor kHz 551,5 foi usado. Se o equipamento for utilizado outro, são sugeridas as seguintes:

1. Seleccionar um adequado, transdutor de ultra-som calibrado com uma frequência central na gama MHz MHz 0,25 -1,5 e um número f-(raio de curvatura / abertura) de 1 ou menos.
2. Coloque um fi banho de águapreencheram com água morna, desgaseificado, água deionizada na cama de um T 1,5 ou 3 T MRI. O banho de água deve ter uma placa de topo, que pode segurar os animais. Montar o transdutor de ultra-som no tanque em uma fase de posicionamento MRI compatível de três eixos ou sistema de ^9, de frente para a superfície da água.
3. Executar o cabo do transdutor para o equipamento de ultra-som de condução através de um painel de penetração.
4. Gerar o sinal de condução do transdutor usando um gerador de função e amplificador de potência. Use um circuito externo de correspondência para minimizar a energia reflectida eléctrica.
5. Sabendo o comprimento focal transdutor, coloque o foco transdutor na superfície da água e sonicar da superfície da água para gerar uma fonte de água visível. Passos 1,6 e 1,7 descrevem como registrar o foco usando a fonte de água gerado. Um método mais preciso para localizar o foco, o qual envolve sonicando um calor de absorção de gel e de imagem a elevação da temperatura resultante no foco com RM, podem ser encontrados em ^{9 <}/ Sup>.
6. Marcar a posição do foco usando um marcador que será visível nas imagens de RM. Isto pode ser feito usando uma placa com um orifício central que vai encher com água quando colocado sobre o foco. O buraco cheio de água será visível, na ressonância magnética e proporcionará coordenadas focais em dois planos, enquanto que a coordenada na direcção axial do transdutor pode ser determinada a partir da superfície da água.
7. Usando uma seqüência localizador 3-plano, a imagem do marcador de foco e registrar a localização do foco no sistema de coordenadas de ressonância magnética.
8. Para monitorizar as emissões acústicas, montar um hidrofone ⁸ MR-compatível que é usado como um detector de cavitação passiva (PCD) no banho de água dirigido para o foco do transdutor, ou utilizar um transdutor com hidrofone integrado.
9. Executar os cabos de PCD para um cartão de escopo que é suficientemente rápida para capturar rajadas de até 10 ms a PRF até 2 Hz (por exemplo, ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Quebec, Canadá). Os cabos devem ser aterrado para a penetração painel ou RF escudo para minimizar o ruído.

2. Preparação dos animais

1. Anestesiar os animais utilizam o gás isoflurano. Uma vez que isofluorano tem um efeito sobre BBB ruptura ^10, os animais devem ser tomadas fora do gás de 10 minutos antes do início da experiência. O local de pomada lubrificante ocular em cada olho, no início da anestesia para proteger a córnea de dessecação ou outras lesões.
2. Usando um barbeador elétrico raspar a pele da parte superior da cabeça do animal e do pescoço, em seguida, remova a pele restante usando um creme depilatório (por exemplo, Nair, Church & Dwight Co., Princeton, NJ, EUA) e lavar o couro cabeludo com sabão neutro e água.
3. Preparar a cauda com um esfrega pele betadine seguido por uma lavagem bridine. Executar um wipedown final com álcool, a fim de visualizar a veia da cauda.
4. Inserir um cateter de calibre 22 com 3-forma torneira na veia da cauda e lavar com uma mistura de heparina / solução salina (33 U / mL) para evitar a formação de coágulosno cateter.
5. Entregar anestésicos injectáveis ​​(40-50 mg de cetamina / kg, 10 mg / kg de xilazina), através de injecção intramuscular, e remover o animal a partir do isofluorano.
6. Coloque a supina animal anestesiado sobre o sistema de posicionamento de ultra-som com a parte superior da cabeça contactando o banho de água através de um furo no topo da placa-(Fig.1). Uma pequena quantidade de ultra-som gel talvez aplicado ao topo da cabeça do animal para minimizar a possibilidade de airbubbles aprisionados.
7. Tape as pernas para o sistema de posicionamento. A cabeça pode ser mantida no lugar usando uma barra de mordida, se disponível, ou fita colocada firmemente em todo o queixo.
8. Cobrir o animal com uma toalha e cobertor circulação de água, a fim de mantê-lo aquecido.

3. Target Selection

1. Adquirir base axial T _2-T imagens ponderadas e _1-RM ponderada do cérebro. Se estiver usando ressonância magnética de 1,5 T e dedicado a cabeça do tamanho de bobina de superfície RF-receber, adequado scum parâmetros podem ser:
   
   T ₂ ponderada: FSE, TE = 60 ms, TR = 2000 ms
   T ₁ ponderada: FSE, TE = 10 ms, TR = 500 ms

2. Selecione o destino a partir do T _2-ponderadas varreduras, evitando os ventrículos ea linha média do cérebro, e selecionando uma profundidade média do cérebro.
3. Mova o foco do transdutor para o local de destino.

4. Preparação de microbolhas

Microbolhas Definity (Lantheus Medical Imaging, MA, EUA) são utilizados por vários grupos de FUS mediadas microbolhas induzidas BBBD ^2,5,7. Dosagens adequadas para outros tipos de microbolhas pode ser encontrada na literatura ^11,12.

1. Activar as microbolhas Definity e lentamente elaborar um pequeno volume para uma seringa de 1 mL utilizando uma agulha de 18 gauge.
2. Remover ar preso da seringa delicadamente movendo o êmbolo para trás e para frente. Não toque na seringa, pois isso pode romper as bolhas.
3. Diluir o Definity em condições normais solução salina numa proporção de 10:01 de solução salina para Definty injetando-se lentamente o volume necessário de Definity para uma seringa de soro fisiológico. Se uma entrega de infusão é usado, o Definity pode ser ainda mais diluída, a 50:1 ou 100:1.
4. Inverta suavemente a seringa para misturar completamente o Definity e solução salina até uma aparência mesmo seja alcançado. Inversão suave da seringa imediatamente antes da injecção pode também ser necessário se as bolhas começaram a flutuar para fora da suspensão.
5. Calcular o volume da dose requerida com base em 0,02 mL / kg de Definity, ou 0,2 ml / kg da solução (menos 10:1 de diluição).

5. Entrega de ultra-som

1. Defina os parâmetros ultra-som, usando rajadas de direito baixos do ciclo, não sonicações onda contínua. Parâmetros de sonicação adequadas a 0,5 MHz são 0,23 MPa de pressão situ, 10 rajadas ms a 1 Hz PRF, 2 min. tempo de sonicação total. Em 1,5 MHz adequado das pressões in situ cair em torno de 0,45-0,5 MPa.

_content "> pressões adequadas em diferentes freqüências pode ser estimada utilizando um índice de mecânica de 0,46 ^13.

2. Verificar que a cabeça do animal é ainda acoplado à água.
3. Injectar as microbolhas lentamente o cateter da veia da cauda e lave com 0,5 mL de solução salina normal. Começar a sonicação em simultâneo com o início da injecção.

6. Avaliação da ressonância magnética Resultado de Tratamento

1. Após a sonicação, injectar um agente de contraste para IRM (por exemplo, 0,2 ml / kg Omniscan, a GE Healthcare) através do cateter da veia da cauda seguido por uma lavagem de 0,5 ml de solução salina.
2. Realizar T de imagem _1-ponderada até que o pico de contraste tenha passado. Sítios sonicação que tenham sido rompidos com sucesso vai mostrar maior reforço do que o tecido circundante.
3. Execute T imagens _2-ponderada para verificar se há edema. Sinal de alta nos locais de sonicação é indicativo de edema.

7. RepresentanteResultados

Agentes de contraste para IRM pode ser entregue com êxito através do BBB com ultra-som focalizado e circulando microbolhas. A Figura 2 mostra pré e pós-típico FUS T _1-w imagens. A Figura 2B mostra um contraste maior (CE) T _1-w imagem com distintas aberturas focais em quatro locais sonicados. Sonicação locais 1 e 2 mostram uma intensificação particularmente brilhante. Na Fig.3 locais 1 e 2 também pode ser visto para corresponder com T _2-w sinal elevada, indicando edema.

A extensão de T _2-w edema pode por vezes ser mais facilmente visualizada em fatias sagital. A Figura 4 mostra CE-T _1-w e T _2-w fatias sagital através de sonicação locais 1 e 3. Edema é visível na posição 1, mas não a localização 3.

A análise espectral dos capturados dados acústicos de emissões (Fig. 5) pode mostrar emissões harmônicas e / ou sub / ultra emissões harmônicas quando cavitação estável está ocorrendo. Harmonics também pode surgir a partir de tecido não-linearidades, enquanto que as emissões sub e ultraharmonic só pode ocorrer como um resultado da actividade de bolha ^14. A pressões mais elevadas emissões de banda larga, indicando cavitação inercial pode também ser detectado. No entanto, estes têm sido associados com maiores quantidades de extravasamento dos glóbulos vermelhos e microdanos do que sonicações sem cavitação inercial ^11.

A utilização de frequências mais elevadas sonicação resulta em aberturas mais localizadas, devido ao tamanho mais pequeno ponto focal. A Figura 6 mostra que as frequências mais altas podem ser utilizadas para criar regiões mais pequenas de abertura. Isso permite que a investigação de efeitos meados do cérebro com menos perto do crânio efeitos.

Figura 1. Configuração experimental.

Figura 2. Pre (à esquerda) e pós (à direita) tratamento T _1-w imagens de um cérebro de rato mostrando aumento em quatro locais de sonicação.

Figura 3. Pré (à esquerda) e pós (à direita) tratamento T _2-w imagens de um cérebro de rato (mesmo animal como Fig.2) mostrando T _2-w edema em locais de sonicação 1 e 2.

Figura 4. Pós-tratamento sagital T _1-w (esquerda) e T _2-w (direita) a partir de imagens do cérebro de rato mesma Figs. 2 e 3. A abertura no local 1 (esquerda) correlaciona-se com T _2-w edema (direita). Localização 3 mostra edema abertura (à esquerda), mas não T _2-w.
Figura 5. Espectro de freqüência a partir de dados capturados durante uma única explosão de 10 ms a 551,5 kHz. A frequência fundamental (f _0), bem como harmónicas (2 f ₀₎ e sub / ultraharmonics (0,5 f _0, 1,5 f ₀₎ são visíveis.

Figura 6. Pós-tratamento CE-T _1-w axial (à esquerda) e sagital (direita) imagens de um cérebro de rato sonicado em quatro locais em 1,503 MHz. Aberturas BBB neste frequência são vistos como sendo mais localizada.

Discussion

Preparação dos animais e microbolhas são os aspectos mais críticos deste procedimento. O cabelo na cabeça do animal deve ser completamente removido para evitar atenuante do feixe de ultra-som. O BBB pode ser interrompido sob isofluorano anestésico, no entanto, torna-se mais difícil de obter uma abertura consistente.

As microbolhas devem sempre ser manuseados com cuidado e uma bitola de pequeno, as agulhas de grande diâmetro deve ser usado quando a elaboração, a fim de evitar a quebra-los. Do mesmo modo, o cateter menor bitola que pode ser razoavelmente utilizado na veia da cauda deve ser empregada (22 gauge é recomendada). Se um menor do cateter é necessária para conseguir a colocação correcta na veia então cuidado extra deve ser tomado durante a injecção de microbolhas. As injeções de microbolhas deve sempre ser feito lentamente.

Sonicações Modo de Burst deve sempre ser empregada. Se sonicações ondas contínuas são utilizadas as microbolhas não vai reconstituir para os vasos no foco do transdutor e BBBD não será alcançado. Se CE-T _1-W imagens pós-tratamento não mostram ruptura, o tratamento pode ser repetido verificação de que o nível de água é encimado acima de modo que a cabeça de animais está na água e que não existem bolhas de ar retidas na superfície da pele .

Freqüências mais altas proporcionar uma melhor localização em modelos animais pequenos, mas exigem maior das pressões in situ para induzir a abertura. Também é importante considerar que as perdas decorrentes do crânio são mais elevadas em maior pressão e deve ser contabilizado na estimativa das pressões in situ. Na transmissão 0,5 MHz através do crânio no rato é de aproximadamente 73% ^8, mas cai para cerca de 50% ¹⁵ a 1,5 MHz. A atenuação pode ser assumido como 5 Np m ^-1 MHz ^-1 no tecido cerebral ^4. Freqüências mais altas são mais adequados para o trabalho em modelos animais pequenos, mas são menos clinicamente relevante.

tenda "> Esta abordagem guiada por MRI oferece vantagens sobre guiadas por ultra-técnicas, permitindo que muito mira de precisão, bem como avaliação de resultado imediato do tratamento pós-tratamento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Animal Focused Ultrasound System	FUS Instruments, Inc.	RK-100
Definity	Lantheus Medical Imaging
Omniscan	GE Healthcare