Summary
Микропузырьков опосредованного сфокусированного ультразвука нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) является перспективной техникой для неинвазивного целевой доставки лекарств в мозг
Abstract
Сфокусированного ультразвука (ФУЗ) разрушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) становится все более исследовал метод обхода BBB 1-5. BBB является существенным препятствием для фармацевтического лечения мозговых нарушений, поскольку он ограничивает переход молекул из сосудистую в ткани головного мозга к молекулам менее 500 Da в размере 6. FUS индуцированные нарушения BBB (BBBD) является временным и обратимым 4 и имеет преимущество по сравнению с химическими средствами вызывать BBBD, будучи сильно локализованы. FUS индуцированной BBBD предоставляет средства для исследования воздействия широкого спектра лекарственных препаратов на головной мозг, которые иначе не могли бы быть доставке к тканям в достаточной концентрации. В то время как широкий спектр ультразвуковых показателей оказались успешными на нарушение BBB 2,5,7, есть несколько важных шагов в опытном порядке для обеспечения успешного нарушение точной адресности. Это protocол очертания, как достичь МРТ наведением FUS индуцированных BBBD в крысиной модели, с акцентом на критическое подготовки животных и микропузырьков шагов обработки эксперимента.
Protocol
1. УЗИ и МРТ установки
МРТ-совместимых три оси сфокусированного ультразвука система была использована в данном исследовании (FUS Instruments, Inc, Торонто, Онтарио, Канада). Два различных преобразователей ультразвуковых были использованы: в доме, построенном 551,5 кГц сферически ориентированных преобразователей (радиус кривизны = 60 мм, внешний диаметр = 75 мм, внутренний диаметр = 20 мм) и 1,503 МГц, 8-сектор массив с интегрированным ЦТС гидрофон (Imasonic Inc, Voray-сюр-L'Orgnon, Франция) приводится как один элемент сферической сосредоточены преобразователя (НФ = 0,8, диафрагма = 10 см). МРТ-совместимый приемник PVDF 8 был использован для записи акустической эмиссии при 551,5 кГц преобразователь был использован. Если различного оборудования используется следующее предлагается:
- Выберите подходящий, калиброванный ультразвуковой датчик с центральной частотой в 0.25 МГц -1,5 МГц и F-число (радиус кривизны / диафрагмы) 1 или меньше.
- Поместите фантастические водяной банеlled теплой, дегазированной, де-ионизированной воды по дну 1,5 т и 3 т МРТ. Водяная баня должна иметь верхнюю пластину, которая может держать животных. Установите ультразвуковой датчик в баке на МРТ совместимый трехосный этап позиционирования или системы 9, с видом на водную поверхность.
- Запуск кабеля датчика к оборудованию вождения ультразвук через проникновение панели.
- Генерация сигнала датчика вождения с помощью генератора функции и усилителя мощности. Использование внешнего соответствия схеме, чтобы минимизировать отражение электроэнергии.
- Зная преобразователь фокусного расстояния, поместите датчик в центре внимания на поверхности воды и разрушать ультразвуком поверхности воды, чтобы создать видимый фонтан воды. Шаги 1.6 и 1.7 описывают, как зарегистрироваться в центре используя созданный фонтан воды. Более точный метод для размещения в центре, который включает в себя sonicating тепло поглощает гель и изображения в результате повышения температуры в очаге с МРТ, можно найти в 9 </ Sup>.
- Отметьте расположение в центре внимания с помощью маркера, которые будут видны на МРТ. Это можно сделать с помощью пластины с отверстием по центру, который будет заполняться водой при размещении в фокусе. Заполненные водой отверстие будет видно на МРТ и обеспечит фокальные координаты в двух плоскостях, в то время как координаты в направлении оси преобразователя может быть определена с поверхности воды.
- Использование 3-плоскость локализатор последовательность изображений в центре маркера и записывать расположение в центре внимания в МРТ системе координат.
- Для контроля акустической эмиссии, установить MR-совместимый гидрофон 8, который используется в качестве пассивных детекторов кавитации (PCD) на водяной бане, направленных на датчик фокусировки, или использовать преобразователь со встроенным гидрофона.
- Запустите PCD кабели область карты, которые достаточно быстро, чтобы захватить всплески до 10 мс при PRFs до 2 Гц (например, ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Квебек, Канада). Кабель должен быть заземлен на проникновениеконцентрация панели или щита России, чтобы минимизировать уровень шума.
2. Подготовка животных
- Обезболивания животных с использованием isofluorane газа. С isofluorane влияет на нарушение BBB 10, животные должны быть сняты с газом за 10 минут до начала эксперимента. Место глазной мази смазки в каждый глаз в начале анестезии, чтобы защитить роговицу от высыхания или других травм.
- Использование электрической бритвой брить шерсть на верхней части головы животного и шеи, затем удалите остатки меха помощью депиляции кремом (например, Наир, Церковь и Дуайт Co, Принстон, штат Нью-Джерси, США) и промойте кожу головы с мылом воды.
- Подготовьте хвост скраб бетадин кожи следует bridine стирки. Выполните окончательное wipedown с алкоголем, с тем чтобы представить себе хвостовую вену.
- Вставьте катетер 22 калибра с 3-х ходовой кран в хвостовую вену и промойте гепарин / солевой смеси (33 Ед / мл), чтобы предотвратить образование сгустковВ катетер.
- Доставка инъекционных анестетиков (40-50 мг / кг кетамина, 10 мг / кг ксилазина) с помощью внутримышечных инъекций, и удалить животное из isofluorane.
- Положите под наркозом спине животного в системе позиционирования ультразвука с верхней части головы связаться водяной бане через отверстие в верхней пластине (рис. 1). Небольшое количество ультразвука гель может применяться в верхней части головы животного, чтобы минимизировать вероятность захваченных воздушных пузырьков.
- Лента ноги к системе позиционирования. Руководитель может быть привлечен на место либо с помощью укуса бар, если таковые имеются, или лента занимает прочное место по подбородку.
- Накройте животное полотенцем и оборотной воды одеяло для того, чтобы сохранить его теплым.
3. Выбор целевой
Получить базовые осевой T2-взвешенная и Т 1-взвешенной МРТ изображений головного мозга. При использовании 1,5 Тл МРТ головы и выделенные размера RF-получать поверхности катушки, подходящий SCПараметры могут быть:
Т 2 взвешенном: FSE, TE = 60 мс, TR = 2000 мс
T 1 взвешенный: FSE, TE = 10 мс, TR = 500 мсек- Выберите цель из T 2-взвешенный сканирования, что позволяет избежать желудочки мозга и средней линии, и выбор среднего мозга глубину.
- Переместить фокус датчик в целевое расположение.
4. Подготовка микропузырьков
Definity микропузырьков (Lantheus Medical Imaging, Массачусетс, США) используются несколько групп для микропузырьков FUS опосредованное индуцированных BBBD 2,5,7. Соответствующие дозы для других микропузырьков типа можно найти в литературе 11,12.
- Активировать Definity микропузырьков и медленно составить небольшой объем в 1 мл шприц использованием 18-иглы.
- Удалить пузырьки воздуха из шприца, аккуратно перемещая поршень назад и вперед. Не нажимайте шприц, так как это может нарушить пузыри.
- Развести Definity в нормальном физиологический раствор в соотношении 10:1 физиологическим раствором для Definty Медленно инъекционных необходимый объем Definity в шприц физиологического раствора. Если настой доставки используется Definity могут быть дополнительно разбавленные, до 50:1 или 100:1.
- Аккуратно переверните шприц тщательно перемешать и Definity солевой до даже внешний вид достигается. Нежная инверсия шприц непосредственно перед инъекцией может быть необходимо, если пузыри начали всплывать из подвески.
- Рассчитать необходимый объем дозы на основе 0,02 мл / кг Definity, или 0,2 мл / кг раствора (разведение в 10:01).
5. Ультразвуковое доставки
- Установите параметры ультразвука, используя низкий рабочий цикл всплески, а не непрерывный sonications волны. Соответствующие параметры ультразвука 0,5 МГц 0,23 МПа в местах давления, 10 мс всплески с частотой 1 Гц PRF, 2 мин. Общее время обработки ультразвуком. На 1,5 МГц соответствующего на месте падения давления по 0.45-0.5 МПа.
- Убедитесь, что голова животного по-прежнему связаны с водой.
- Вводите медленно микропузырьков в хвостовую вену катетер и на одном уровне с 0,5 мл физиологического раствора. Начало ультразвука одновременно с началом инъекций.
6. МРТ оценки результатов лечения
- После обработки ультразвуком, вводить МРТ контрастного вещества (например, 0,2 мл / кг OmniScan, GE Healthcare) через хвостовую вену катетер затем 0,5 мл солевого флеш.
- Выполните T 1-взвешенных изображений до отличие пик прошел. Ультразвуком сайтов, которые были успешно нарушены покажет больше, чем повышение в окружающие ткани.
- Выполните T 2-взвешенными изображениями для проверки отек. Высокий сигнал на обработку ультразвуком сайтов свидетельствует о отеки.
7. ПредставительРезультаты
MRI контрастных средств может быть успешно доставлено через ГЭБ использованием фокусированного ультразвука и оборотных микропузырьков. На рисунке 2 показаны типичные до и после ФУЗ T 1-белых изображений. Рисунок 2B показывает отличие расширения (CE) T 1-белого изображения с отдельных направлений отверстия в четырех местах ультразвуком. Ультразвуком места 1 и 2 особенно яркий аксессуар. На рис.3 места 1 и 2 можно также рассматривать в соответствие с T 2-W высокий сигнал, указывающий отек.
Степень T 2-W отек иногда может быть более легко визуализировать на сагиттальных. На рисунке 4 показана CE-T 1-W и T 2-W сагиттальных через ультразвука места 1 и 3. Отек видна на место 1, но не место 3.
Спектральный анализ захваченных акустических данных о выбросах (рис. 5) может показать гармонических выбросов и / или суб / ультра гармонических выбросов при стабильной кавитации происходит. Хармонмикросхемы могут возникать также из ткани нелинейности, а к югу и ultraharmonic выбросов может произойти только в результате деятельности пузырь 14. При более высоких давлениях широкополосного выбросов указывает инерциальной кавитация может также быть обнаружены. Однако это было связано с большим количеством красных кровяных телец кровоизлияний и микроповреждений, чем sonications без инерциальной кавитации 11.
Использование более высоких частот ультразвука приводит к более локализованным отверстия в связи с меньшим размером фокусного пятна. Рисунок 6 показывает, что более высокие частоты могут быть использованы для создания меньших регионов открытия. Это позволяет исследовать эффекты среднего мозга с меньшим количеством почти черепа эффектов.
Рисунок 1. Схема экспериментальной установки.
Рисунок 2. Pre (слева) и после (справа) лечение T 1-белых изображений в мозге крыс показывает улучшение в четырех местах ультразвуком.
Рисунок 3. Pre (слева) и после (справа) лечение T 2-белых изображений из мозга крысы (то же самое животное рис. 2) показывает T 2-W отек в местах ультразвука 1 и 2.
Рисунок 4. После лечения сагиттальной T 1-ю (слева) и T 2-ю (справа) изображений из одного мозга крыс, как на рис. 2 и 3. Открытие на место 1 (слева) коррелирует с T 2-W отек (справа). Расположение 3 показывает открытия (слева), но не T 2-W отек. 
Рисунок 5. Частотный спектр от данных, полученных в течение одного 10 мс взрыв на 551,5 кГц. Основная частота (F 0), а также гармоники (2 Ф 0) и суб / ultraharmonics (0,5 F 0, 1.5 F 0) видны.
Рисунок 6. После лечения CE-T 1-W осевой (слева) и сагиттальной (справа) изображений мозга крыс ультразвуком в четырех местах на 1,503 МГц. BBB отверстия на этой частоте, рассматриваются как более локальный характер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подготовка животных и микропузырьков наиболее важные аспекты этой процедуры. Волосы на голове животного должны быть полностью убраны, чтобы избежать ослабления ультразвукового луча. BBB может быть нарушена под isofluorane анестезии, однако, становится все труднее добиться последовательного открытия.
Микропузырьков всегда следует использовать с осторожностью и небольшой датчик, большой диаметр иглы должен быть использован при составлении, чтобы не нарушать их. Точно так же, самый маленький калибровочных катетер, который может быть разумно использован в хвостовую вену следует применять (22 калибра рекомендуется). Если меньше катетер, необходимых для достижения правильного размещения в вену, то дополнительно необходимо соблюдать осторожность во время инъекции микропузырьков. Микропузырьков инъекции всегда следует делать медленно.
Sonications Режим серийной съемки всегда должен быть использован. Если непрерывный sonications волны используются микропузырьков не будет пополняться в сосуды в фокусе датчика и BBBD не будут достигнуты. Если CE-T 1-белых изображений после лечения не показывают нарушений, лечение можно повторить проверку того, что уровень воды превысил так, чтобы животные головой в воду, и нет пузырьков воздуха удерживается на поверхности кожи .
Более высокие частоты обеспечивают лучшую локализацию в небольших моделях на животных, но требуют более высокого давления на месте, чтобы вызвать открытие. Важно также учитывать, что потери в связи с черепом выше при более высоком давлении и должны учитываться при оценке в местах давления. На 0,5 МГц передача через крысы черепа составляет приблизительно 73% 8, но снижается до 50% 15 на 1,5 МГц. Затухание можно считать равным 5 Np м -1 МГц -1 в мозговой ткани 4. Более высокие частоты лучше подходят для работы в небольших моделях на животных, но менее клинически значимым.
палатка "> Это МРТ наведением подход дает преимущества по сравнению с ультразвуковым наведением методы, позволяя очень точный таргетинг, а также оценки результатов лечения сразу после лечения.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
К. Hynynen и Р. Чопра являются соучредителями инструменты FUS, Inc Р. Чопра, А. и К. Waspe Hynynen являются акционерами в FUS Instruments, Inc К. Hynynen получает поддержку научных исследований с FUS инструментов, Inc
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Шона Rideout-Грос и Александра Гарсес за помощь в уходе за животными, и Wu Ping для ее технической помощи. Поддержка эта работа была представлена в Национальном институте здоровья в рамках гранта нет. EB003268 и Канады исследований кафедр программы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Animal Focused Ultrasound System | FUS Instruments, Inc. | RK-100 | |
| Definity | Lantheus Medical Imaging | ||
| Omniscan | GE Healthcare |
References
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11719-11723 (2006).
- Jordão, J. F., Ayala-Grosso, C. A., Markham, K., Huang, Y., Chopra, R., McLaurin, J., Hynynen, K., Aubert, I. Antibodies targeted to the brain with image-guided focused ultrasound reduces amyloid-beta plaque load in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 5 (5), e10549-e10549 (2010).
- Liu, H. -L., Hua, M. -Y., Chen, P. -Y., Chu, P. -C., Pan, C. -H., Yang, H. -W., Huang, C. -Y., Wang, J. -J., Yen, T. -C., Wei, K. -C. Blood-brain barrier disruption with focused ultrasound enhances delivery of chemotherapeutic drugs for glioblastoma treatment. Radiology. 255, 415-425 (2010).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Choi, J. J., Wang, S., Tung, Y. -S., Morrison, B., Konofagou, E. E. Molecules of various pharmacologically-relevant sizes can cross the ultrasound-induced blood-brain barrier opening in vivo. Ultrasound Med. Biol. 36, 58-67 (2010).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound Med. Biol. 35, 1298-1308 (2009).
- O'Reilly, M. A., Hynynen, K. A PVDF receiver for ultrasound monitoring of transcranial focused ultrasound therapy. IEEE Trans. Biomed. Eng. 57, 2286-2294 (2010).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Med. Phys. 36, 1867-1874 (2009).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-Brain Barrier Disruption and Vascular Damage Induced by Ultrasound Bursts Combined with Microbubbles can be Influenced by Choice of Anesthesia Protocol. Ultrasound Med. Biol. , (2011).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Yang, F. -Y., Liu, S. -H., Ho, F. -M., Chang, C. -H. Effect of ultrasound contrast agent dose on the duration of focused-ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. J. Acoust. Soc. Am. 126, 3344-3349 (2009).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound Med. Biol. 34, 834-840 (2008).
- Neppiras, E. A. Acoustic Cavitation. Physics Reports (Review Section of Physics Letters). 61, 159-251 (1980).
- O'Reilly, M. A., Huang, Y., Hynynen, K. The impact of standing wave effects on transcranial focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier in a rat model. Phys. Med. Biol. 55, 5251-5267 (2010).
