MR-guidad Rubbning av blod-hjärnbarriären med hjälp Transkraniell fokuserat ultraljud i en råttmodell

Summary

Mikrobubbelfria medierad fokuserat ultraljud störning av blod-hjärnbarriären (BBB) ​​är en lovande metod för icke-invasiv riktad läkemedelsavgivning i hjärnan

Abstract

Fokuserat ultraljud (FUS) sönderdelning av blod-hjärnbarriären (BBB) ​​är en alltmer undersöktes teknik för att kringgå blod-hjärnbarriären ^1-5. BBB är ett betydande hinder för läkemedel mot sjukdomar i hjärnan, eftersom det begränsar passage av molekyler från kärlsystemet i hjärnvävnaden till molekyler mindre än cirka 500 Da i storlek ^6. FUS inducerad BBB störningar (BBBD) är tillfällig och reversibel ⁴ och har en fördel jämfört med kemiska medel att förmå BBBD genom att vara mycket lokal. FUS inducerad BBBD tillhandahåller ett medel för att undersöka effekterna av en lång rad av terapeutiska ämnen på hjärnan, som annars inte skulle kunna levereras till vävnaden i tillräcklig koncentration. Medan ett brett utbud av ultraljud parametrar har visat sig framgångsrika på att störa BBB ^2,5,7, finns det flera viktiga steg i den experimentella förfarande för att garantera framgång störningar med korrekt inriktning. Detta protokollol konturer hur man kan uppnå MRI-guidade FUS inducerade BBBD i en råtta modell, med fokus på kritiska djuret preparatet och mikrobubblor stegen hantering av experimentet.

Protocol

1. Ultraljud och MRT Setup

En MRI-kompatibel treaxlig fokuserat ultraljud system användes i denna studie (FUS Instruments, Inc., Toronto, Ontario, Kanada). Två olika ultraljudstransduktorer användes: en in-house konstruerad 551,5 kHz sfäriskt fokuserad givaren (krökningsradie = 60 mm, yttre diameter = 75 mm, inre diameter = 20 mm), och en 1,503 MHz, 8-sektorn array med integrerad PZT hydrofon (Imasonic Inc., Voray sur L'Orgnon, Frankrike) som drivs som ett enda element inriktas sfäriskt omvandlare (FN = 0.8, bländare = 10 cm). En MR-kompatibel PVDF mottagaren ⁸ användes för att spela in akustiska emissioner när 551,5 kHz givaren användes. Om annan utrustning används, är följande förslag:

1. Välj ett lämpligt kalibrerad ultraljud givare med en mittfrekvens i intervallet 0,25 MHz -1,5 MHz och en f-nummer (krökningsradie / bländare) på 1 eller mindre.
2. Placera en fi vattenbadlled med varm, avgasad, avjoniserat vatten på bädden av en 1,5 T eller 3 T MRI. Vattenbadet bör ha en topp-platta som kan hålla djuren. Montera ultraljud givaren i tanken på en MR-kompatibel treaxlig positionering steg eller system ^9, mot vattenytan.
3. Kör givarkabeln till ultraljud körning utrustning genom en penetration panel.
4. Generera signalen givaren körning använder en funktion generator och effektförstärkare. Använda en extern anpassningskrets för att minimera den reflekterade elektrisk effekt.
5. Att veta givaren brännvidd, placera givaren fokus på vattenytan och sonikera vattenytan för att generera en synlig fontän. Steg 1,6 och 1,7 beskriver hur man registrerar fokus med den genererade fontän. En mer exakt metod för att lokalisera fokus, vilket innebär sonikering en värmeabsorberande gel och avbildning av den resulterande temperaturhöjningen i fokus med MRI, kan hittas i ^{9 <}/ Sup>.
6. Markera platsen för fokus med en markör som kommer att vara synliga på MR-bilder. Detta kan göras med användning av en platta med ett centrumhål som kan fyllas med vatten när den placeras över centrum. Det vattenfyllda hål kommer att vara synliga på MRI och kommer att tillhandahålla fokala koordinater i två plan, medan det koordinatsystem i den axiella riktningen hos omvandlaren kan bestämmas från vattenytan.
7. Med hjälp av en 3-plan localizer sekvens, bild fokus markören och registrera placeringen av fokus i MRI koordinatsystem.
8. För att övervaka akustiska utsläpp, montera en MR-kompatibel hydrofon ⁸ som används som en passiv kavitation detektor (PCD) i vattenbad riktas mot givaren fokus eller använda en givare med integrerad hydrofon.
9. Kör PCD kablar till en räckvidd kort som är tillräckligt snabb för att fånga skurar av upp till 10 ms vid PRFs upp till 2 Hz (t.ex. ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Quebec, Kanada). Kablar måste jordas till penetration panel eller RF sköld för att minimera buller.

2. Djur Framställning

1. Bedöva djur med isofluoran gas. Eftersom isofluoran har en effekt på BBB störningar ^10, bör djuren tas bort gas 10 minuter före starten av experimentet. Placera okulär smörjmedel salva i varje öga i början av anestesi för att skydda hornhinnan från uttorkning eller annan skada.
2. Använda en elektrisk rakapparat rakar pälsen från toppen av djurets huvud och hals, ta sedan bort återstående pälsen med hjälp av en hårborttagningskräm (t.ex. Nair, Church & Dwight Co, Princeton, NJ, USA) och skölj hårbotten med mild tvål och vatten.
3. Förbered svansen med en betadin huden scrub följt av en bridine tvätt. Utföra en slutlig wipedown med alkohol för att visualisera i svansvenen.
4. Sätt en 22 gauge kateter med 3-vägs avstängningskranen i svansvenen och i jämnhöjd med en heparin / saltlösning blandning (33 U / ml) för att förhindra koagelbildningi katetern.
5. Leverera injicerbara anestetika (40-50 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin) via intramuskulär injektion och ta bort djuret från isofluoran.
6. Placera sövd djuret liggande på ultraljud positioneringssystemet med toppen av huvudet kontakt med vattenbadet genom ett hål i övre plattan (Fig. 1). En liten mängd ultraljudsgel kanske appliceras på toppen av djurets huvud för att minimera risken för instängda luftbubblor.
7. Tejp benen att positioneringssystemet. Huvudet kan hållas på plats med hjälp av antingen en bit bar, om sådan finns, eller tejp placeras stadigt över hakan.
8. Täck djuret med en handduk och cirkulerande vatten filt för att hålla det varmt.

3. Mål Val

1. Skaffa baslinje axiell T _2-viktade och T _1-viktade MR bilder av hjärnan. Om du använder en 1,5 T MR och engagerade huvud-storlek RF-emot ytspolen, lämplig SCen parametrar kan vara:
   
   T ₂ vägd: FSE, TE = 60 ms, TR = 2000 ms
   T ₁ vägd: FSE, TE = 10 ms, TR = 500 ms

2. Välj målet från T _2-viktade skanningar, undvika kamrarna och hjärnans mittlinjen och välja en mid-hjärna djup.
3. Flytta omvandlaren fokus till målplatsen.

4. Mikrobubbla Framställning

Definity mikrobubblor (Lantheus Medical Imaging, MA, USA) används av flera grupper för mikrobubblor medierade FUS inducerade BBBD ^2,5,7. Lämpliga doser för andra mikrobubblor typer kan hittas i litteraturen ^11,12.

1. Aktivera de Definity mikrobubblorna och långsamt upprätta en liten volym i en 1 ml spruta med användning av en 18-gauge nål.
2. Avlägsna innesluten luft från sprutan genom att försiktigt förflytta kolven fram och tillbaka. Klicka inte på sprutan eftersom detta kan bryta bubblor.
3. Späda ut Definity i normal saltlösning i ett förhållande av 10:1 saltlösning till Definty genom att långsamt injicering av den önskade volymen av Definity i en spruta av saltlösning. Om en infusion leverans används kan Definity spädas ytterligare till 50:1 eller 100:1.
4. Försiktigt invertera sprutan för att grundligt blanda Definity och saltlösning tills en jämnt utseende uppnås. Försiktig inversion av sprutan omedelbart före injektion kan också vara nödvändigt om bubblorna har börjat flyta ut ur suspensionen.
5. Beräkna den erforderliga dosen volym baserat på 0,02 ml / kg av Definity eller 0,2 ml / kg av lösningen (vid 10:01 utspädning).

5. Ultraljud Delivery

1. Ställ sonikering parametrarna med hjälp av låga spricker cykel, inte kontinuerlig drift sonications. Lämpliga sonikering parametrar vid 0,5 MHz är 0,23 MPa in situ tryck, 10 ms skurar vid 1 Hz PRF, 2 min. totala sonikeringstid. Vid 1,5 MHz lämplig plats trycket faller omkring 0,45-0,5 MPa.

_content "kan> Lämpliga tryck vid olika frekvenser beräknas med hjälp av en mekanisk index på 0,46 ^13.

2. Kontrollera att djurets huvud fortfarande är kopplad till vattnet.
3. Injicera mikrobubblorna långsamt i svansvenen katetern och i jämnhöjd med 0,5 ml normal saltlösning. Börja sonikering samtidigt med igångsättningen av injektionen.

6. MRI Utvärdering av behandling Utfall

1. Efter sonikering, injicera en MRI-kontrastmedel (t.ex. 0,2 ml / kg Omniscan, GE Healthcare) via svansvenen katetern följt av en 0,5 ml saltlösning spolning.
2. Utför T _1-viktade bilder tills kontrasten toppen har passerat. Sonikering webbplatser som framgångsrikt har störda kommer visa större förbättring än den omgivande vävnaden.
3. Utför T _2-viktade bilder för att kontrollera ödem. Hög signal vid sonikering ställen är indikativt för ödem.

7. RepresentativResultaten

MRI kontrastmedel kan med framgång levereras via BBB med fokuserat ultraljud och cirkulerande mikrobubblor. Figur 2 visar typiska före och efter FUS T _1-w-bilder. Figur 2B visar en kontrastförstärkt (CE) T _1-w bild med olika fokala öppningar i fyra sonikerade platser. Sonikering platserna 1 och 2 visar en ljus tillbehör. I fig. 3 platser 1 och 2 kan också ses att motsvara T _2-w-signal med hög, vilket indikerar ödem.

Omfattningen av T _2-w ödem kan ibland vara lätt visualiseras på sagittala snitt. Figur 4 visar CE-T _1-W och T _2-w sagittal skivor genom sonikering platserna 1 och 3. Ödem är synlig på plats 1, men inte plats 3.

Spektralanalys av infångade akustiska utsläppsdata (fig. 5) kan visa harmoniska utsläpp och / eller sub / ultra övertonsutsläpp När stabil kavitation sker. Harmonics kan också uppstå genom vävnaden icke-linjäriteter, medan sub-och ultraharmonic utsläpp kan endast inträffa som ett resultat av bubblan aktivitet ^14. Vid högre tryck bredbandiga utsläpp som indikerar tröghets kavitation kan också detekteras. Men dessa har förknippats med större mängder av röda extravasation blodkroppar och mikroskada än sonications utan tröga kavitation ^11.

Användningen av högre frekvenser sonikering resulterar i mer lokaliserade öppningar på grund av den mindre fokalpunkten storlek. Figur 6 visar att högre frekvenser kan användas för att skapa mindre regioner av öppningen. Detta gör undersökningar av effekter mitten av hjärnan med färre nära skalle effekter.

Figur 1. Experiment.

Figur 2. Pre (vänster) och efter (höger) behandling T _1-w bilder av en råtthjärna visar förstärkning på fyra sonikering platser.

Figur 3. Pre (vänster) och efter (höger) behandling T _2-w bilder av en råtta hjärnan (samma djur som Fig.2) visar T _2-w ödem sonikering platserna 1 och 2.

Figur 4. Efterbehandling sagittal T _1-w (vänster) och T _2-w (höger) bilder från samma råtthjärna figurerna som. 2 och 3. Öppningen vid position 1 (vänster) korrelerar med _T2-w ödem (höger). Plats 3 visar öppningen (till vänster) men ingen T _2-w ödem.
Figur 5. Frekvensspektrum från data tagna under en enda 10 ms brister vid 551,5 kHz. Den grundläggande frekvens (f ₀₎ samt övertoner (2 f ₀₎ och sub / ultraharmonics (0,5 f _0, 1,5 f ₀₎ är synliga.

Figur 6. Efterbehandling CE-T _1-w axiellt (vänster) och sagittala (höger) bilder från en råtthjärna ultraljudsbehandlades på fyra platser på 1,503 MHz. BBB öppningar vid denna frekvens verkar vara mer lokaliserad.

Discussion

Förberedelse av djuren och mikrobubblor är de mest kritiska aspekterna av detta förfarande. Pälsen på djurets huvud får helt bort för att undvika att dämpa ultraljudet strålen. BBB kan störas i isofluoran narkos, men blir det svårare att uppnå enhetlig öppning.

Mikrobubblorna alltid ska hanteras varsamt och små mätare, måste stora diameter nålar användas vid utformningen av, för att undvika att bryta dem. På samma sätt bör den minsta mätaren kateter som rimligen kan användas i svansvenen användas (22-gauge rekommenderas). Om en mindre kateter krävs för att uppnå korrekt placering i venen så extra försiktighet måste tas under mikrobubblor injektionen. De mikrobubblor injektioner bör alltid göras långsamt.

Burst mode sonications bör alltid användas. Om kontinuerlig drift sonications används mikrobubblorna inte fylla i kärlen vid givaren fokus och BBBD inte kommer att uppnås. Om CE-T _1-w bilder efter behandling inte visar störningar kan behandlingen upprepas kontrollerar att vattennivån fylls på så att djuren huvudet i vattnet och att det inte finns några luftbubblor fastnat på hudytan .

Högre frekvenser ger bättre lokalisering i små djurmodeller men kräver högre situ tryck att inducera öppning. Det är också viktigt att beakta att förluster på grund av skallen är högre vid högre tryck och skall redovisas vid uppskattningen in situ tryck. Vid 0,5 MHz överföring genom råttan skallen är ca 73% ^8, men sjunker till cirka 50% ¹⁵ vid 1,5 MHz. Dämpning kan antas vara 5 Np m ^-1 MHz ^-1 i hjärnvävnad ^4. Högre frekvenser är bättre lämpade för arbete i små djurmodeller men är mindre kliniskt relevant.

tält "> Denna MRI-guidade metod ger fördelar jämfört med ultraljud-styrda tekniker genom att mycket exakt inriktning samt behandling effektvariabeln direkt efter behandlingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Animal Focused Ultrasound System	FUS Instruments, Inc.	RK-100
Definity	Lantheus Medical Imaging
Omniscan	GE Healthcare