Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

Summary

Wir haben ein Durchflusszytometer mit laserinduzierten Ultraschall zu erkennen zirkulierenden Melanomzellen als Frühindikator von Metastasen entwickelt.

Abstract

Zirkulierender Tumorzellen (CTC) sind jene Zellen, die aus einer makroskopischen Tumor getrennt haben und die Verbreitung durch die Blut-und Lymphsystem, Saatgut Zweittumoren ^1,2,3. CTC sind Indikatoren für metastasierte Erkrankung und deren Nachweis in Blutproben verwendet werden, um Krebs zu diagnostizieren und zu überwachen das Ansprechen eines Patienten auf die Therapie sein. Da CTC selten sind, bestehend aus etwa einer Tumorzelle unter Milliarden von normalen Blutzellen in fortgeschrittenen Krebspatienten, deren Nachweis und die Zählung ist eine schwierige Aufgabe. Wir nutzen die Anwesenheit von Pigment in den meisten Melanomzellen zu generieren photoakustische oder laserinduzierten Ultraschallwellen in einem benutzerdefinierten Durchflusszytometer für den Nachweis von zirkulierenden Melanomzellen (CMC) ^4,5. Dieser Prozess beinhaltet die Trennung einer Vollblut-Probe durch Zentrifugation und Gewinnung der weißen Blutkörperchen Schicht. Wenn im Vollblut, wird CMC mit der weißen Blutkörperchen aufgrund ähnlicher Dichte zu trennen. Diese Zellen sind in resuspendiertPhosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und in die Durchflussmesser. Anstatt einen kontinuierlichen Fluss des Blutes Zellsuspension induzierten wir Zweiphasenströmung, um diese Zellen für eine weitere Studie zu erfassen. In zwei Phase-flow, zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten in einem mikrofluidischen System an einer Kreuzung und bilden abwechselnd Schnecken von flüssigem ^6,7 entsprechen. PBS suspendiert weißen Blutkörperchen und Luft bilden Mikroliter Schnecken, die nacheinander mit Laserlicht bestrahlt werden. Die Zugabe eines Tensids in die flüssige Phase ermöglicht eine einheitliche slug Bildung und der Anwender kann in verschiedenen Größen Schnecken durch die Veränderung der Volumenströme der beiden Phasen zu schaffen. Slugs von Luft und Schnecken von PBS mit weißen Blutkörperchen enthalten keine Licht-Absorber und damit nicht produzieren photoakustische Wellen. Allerdings absorbieren Nacktschnecken der weißen Blutkörperchen, die sogar einzelne CMCs enthalten Laserlicht und produzieren hochfrequente Schallwellen. Diese Schnecken, die photoakustische Wellen erzeugen werden abgetrennt und gesammelt für cytochemische Färbung für EichATION von CMC.

Protocol

1. Blut Probenvorbereitung

1. Zeichnen Sie ca. 10 ml Vollblut aus einer Stage IV Cancer Patient in zwei 5 ml Vacutainer.
2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 10 Minuten bei 3.000 Umdrehungen pro Minute (rpm).
3. Die Blutprobe wird in drei verschiedenen Schichten zu trennen: die unterste Schicht besteht aus den Erythrozyten, die mittlere Schicht, auch genannt der Buffy-Coat, enthält Leukozyten und Melanom-Zellen, und die oberste Schicht enthält Plasma und Thrombozyten. Entfernen Sie so viel Plasma wie möglich, ohne den Buffy-Coat.
4. Legen Sie 250 ul Histopaque 1077 in zwei 1 mL Wintrobe Röhren.
5. Mit einem 9 "Pasteur Pipette, extrahieren Sie die verbleibende Plasma, das gesamte Buffy-Coat, und sogar die oberste Schicht der Erythrozyten, achten Sie darauf, <500 ul zu sammeln.
6. Legen Sie die Lösung der Spitze der Histopaque Schicht und zentrifugieren Wintrobe Röhren in 15 ml konische Röhrchen für 10 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute.
7. Das Blut wird wiedertrennen, aber dieses Mal den Erythrozyten wird durch die Histopaque getrennt werden, erlaubt eine einfache Extraktion der Buffy-Coat. Verwenden Sie eine 9 "Pasteur Pipette auf die gesamte Buffy-Coat erhalten und legen Sie es in ein 2 ml-Eppendorf-Röhrchen.
8. Suspend der Buffy-Coat in 1,5 ml PBS mit 2% v / v Tween 20.

2. Flusskammer Construction

1. Erhalten Sie Acryl-Zylinder, 20 mm Außendurchmesser, 17 mm Innendurchmesser und 8 mm hoch. Bohren Sie drei 5 mm Durchmesser Löcher durch die Seite des Zylinders bei 90 Grad-Winkel voneinander ab. Cut drei Stücke von Polymer-Schlauch (1,6 mm Innendurchmesser, 5 mm Außendurchmesser), und legen Sie sie in die gebohrten Löcher.
2. Stretch Parafilm über den unteren Rand der Acryl-Ring, um eine wasserdichte Abdichtung zu machen. Der Parafilm bildet eine flache Schüssel mit der Acryl-Ring und die Acrylamid-Lösung, die eine Strömungskammer Form halten wird.
3. Suspend einem 1,6 mm Durchmesser Draht durch die Schlauchstücke, dass gegenüber sindeinander, um sicherzustellen, dass der Draht allein sichtbar durch die Mitte des Rings. Füllen Sie das dritte Stück Schlauch mit einem 1,6 mm Draht mit einem Durchmesser und Position der Röhre 1 mm von der abgehängten Draht. Diese Drähte zu verhindern Acrylamid vom Betreten des Schlauch. Nach dem Acrylamid erstarrt, die Drähte werden extrahiert werden, wobei ein zylindrischer Strömungsweg und einen Ort, eine optische Faser Position konzentriert sich auf den Strömungsweg.
4. 5 ml vorbereitet Acrylamid [20 g Acrylamid (Sigma Aldrich), 0,7 g Bisacrylamid (Sigma Aldrich), 100 ml destilliertem Wasser], um einen kleinen Becher. Messen Sie 0,02 g Ammoniumpersulfat (Sigma) und fügen Sie ihn in das Becherglas. Mix mit einem Rührstab für 3 Minuten. Add 20 uL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) in das Becherglas. Schnell gießen Sie die Mischung in die Acryl-, Befüllen an die Spitze. Nach ein paar Sekunden, wird die Lösung Gel, wodurch eine Strömungskammer Form. Ziehen Sie das Kabel aus, was sicher nicht auf die Acrylamid-Gel zu stören. Der Fluss Chamber ist nun einsatzbereit.

3. Photoakustische Flowmetrie Set-up

1. Akustisch Paar eine Polyvinylidenfluorid piezoelektrischen Wandler (Panametrics), um eine Flusskammer mit Ultraschall-Gel direkt über dem Strömungsweg.
2. Mit einem Bajonett Neill-Concelman (BNC)-Kabel, schließen Sie den Sensor an den Eingang eines RITEC Broadband Receiver-640A (Tiefpassfilter: out, Hochpassfilter: 1 MHz, Eingangsimpedanz: 50 Ohm, Verstärkung: 35 dB). Verbinden Sie den Ausgang des Filters mit dem Oszilloskop (Tektronix TDS 2024B). Zum Auslösen des Oszilloskops ist eine Photodiode (Thorlabs) in der Nähe des Wandlers eingestellt und wird in das Oszilloskop mit einem BNC-Kabel eingesteckt.
3. Ein T-Stecker (Small Parts) ist es, einen Arm des Flusses Kammer befestigt. Zwei Spritzenpumpen (Braintree Scientific) auf die anderen Zweige der Stecker angeschlossen. Eine Spritze enthält Luft, während die andere die Zellsuspension in Teil 1 hergestellt enthalten wird. Stellen Sie den Durchfluss zu100 ul / Minute.
4. Extrahieren Sie die kleinen Schlauch der Flusskammer, bis eine kleine Luftblase bildet, und legen Sie eine 1 mm Kerndurchmesser optische Faser mit einem 0,37 numerischer Apertur in diesem Slot. Füllen Sie die Tasche mit Wasser-Schnittstelle Signale zu reduzieren und erhöhen die Menge des Laserlichts angewendet, um den Fluss Weg. Aufgrund der numerischen Apertur der optischen Faser und kurze Entfernung zu den Strömungsweg, wird der Laser nur bestrahlen ein Schluck Probe jederzeit sichergestellt, dass die Probe direkt vor der Laser die gleiche Probe zu schaffen photoakustischen Signale. Die Laserenergie sollte ca. 28 mJ / cm ² mit einem Spot-Größe von 7 mm ^2.
5. Drehen Sie die beiden Spritzenpumpen auf. Wenn die beiden nicht mischbaren Flüssigkeiten der T-Kreuzung erreichen sie in homogene Schnecken und Strom an den Wandler partitioniert werden.
6. Bestrahlen die fließende Probe mit einem Nanosekunden gepulsten Laser zu photoakustische Wellen in der Melanom-Zellen zu erzeugen. Da Melanin ist ein broadbund optische Absorber können alle sichtbaren Laser-Wellenlänge verwendet werden.
7. Wenn ein Signal auf dem Oszilloskop, wenn eine Schnecke befindet sich auf dem Wandler enthält die slug Melanom, und sollte durch das System bis zum Ablegen in eine Sammlung Fläschchen verfolgt werden.

4. Immunzytochemie

1. Nehmen Sie die gefangenen Schnecken zu einem Cytospin 4 Zentrifuge (Thermo Scientific), um sie zu Glasträger zu fixieren. Legen Sie Glasträger in Cytofunnels (Shandon EZ Einzelzimmer Cytofunnel mit Brown Filter Karte Thermo Scientific) und laden Sie sie in die Cytospin 4 Zentrifuge. Legen Sie 100 ul 1% Rinderserumalbumin (Sigma) in PBS in jedes Trichter und dann Zentrifuge bei 600 rpm für 3 Minuten, um die aufgenommenen Zellen Stick an die Glasträger.
2. Nach Zentrifugation, fügen Sie die Zellproben, die Cytofunnels und dann Zentrifuge bei 600 rpm für 3 Minuten. Dann sprühen die Folien mit einem Ethanol-Fixiermittel.
3. Waschen Sie die Folien in PBS für 10 Minuten zweimal.
4. Nach der Inkubation, dekantieren die Folien und inkubieren mit dem Primärantikörper-Lösung für 1 Stunde in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Jede Folie sollte 1% MART-1-Antikörper in Kaninchen angehoben, 1% CD-45 Antikörper in der Maus erhöht, 10% Ziegenserum und 89% PBS.
5. Nach der Inkubation der Objektträger in PBS für 10 Minuten dreimal.
6. Die Folien werden dann in einem zweiten Antikörper-Lösung, die Fluorophor an die Antikörper gebunden hat inkubiert. Die Mischung enthält 0,05% Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, 0,05% Ziege-anti-Maus-Antikörper, 0,1% Ziegenserum und 99% PBS. Die Folien sind in der Dunkelheit für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
7. Nach der Inkubation, dekantieren Waschen der Objektträger in PBS für 5 Minuten dreimal.
8. Um Flecken für einen Kern, inkubieren Sie die Zellen mit 0,1 ug / ml DAPI (Invitrogen) für1 Minute. Dann abgießen die Folien und waschen in PBS.
9. Montieren Sie ein Deckglas über die Zelle Probe mit 20 mL einer Harz-Basis Eindeckmittel pro Folie. Deckglasränder mit klarem Nagellack, um die Folie zu erhalten. Jetzt die Folien sind bereit, mit einem Fluoreszenz-Mikroskop abgebildet werden.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. Die photoakustische Wellenformen von weißen Blutkörperchen und Melanomzellen werden hier gezeigt. Die weißen Blutkörperchen, die keine inhärente Pigmentierung, erzeugen keine photoakustische Wellen und manifestieren sich als eine flache Linie von elektronischem Rauschen (links). Die pigmentierten Melanomzellen produziert einen robusten photoakustischen Welle (rechts).

Abbildung 2. Nach immunzytochemische Färbung zeigen kultivierten Melanomzellen DAPI Signale in blue während MART1 ist grün markiert.

Abbildung 3. Überlagerung Bilder für DAPI und MART1, wie in Abbildung 2, mit CD45 als ein Indikator für Leukozyten, zeigt diese Figur Melanomzellen unter mehreren weißen Blutkörperchen.

Discussion

Erkennen CTC ist immer noch eine forschungsintensive Bereich mit sehr wenigen klinischen Anwendungen durch das schwierige Problem der Isolierung der seltenen Tumorzellen. Viele andere Techniken werden für CTC Nachweis, einschließlich der RT-PCR, mikrofluidische Zelle zu erfassen, immunomagnetische zu erfassen, und andere Methoden ^8-12 bewertet. Allerdings versprechen photoakustischen Detektion von CMC zeigt, wie es Etikett ist kostenlos und bietet eine schnelle und genaue Möglichkeit, um kleine, Licht absorbierenden Partikeln zu erfassen.

Das Protokoll beschriebenen weißen Blutkörperchen zu isolieren ist hoch effizient, noch eine geringe Anzahl von roten Blutkörperchen in der Probe vorhanden sind. Diese rouge kontaminierenden Zellen absorbieren auch Laserlicht, aber mit einer deutlich verringerten Niveau. Um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen nicht mit unseren Melanom Detection System stören, wurden fünf gesunde Patientenproben durch das System eingeführt und keiner gab ein Signal, was darauf hinweist, dass rote Blutkörperchen vorhanden sind, bei ausreichend niedrigen Konzentrationen zuwerden nicht berücksichtigt.

Eine Reihe von Konzentration Studien wurden durchgeführt unter Verwendung von kultivierten Melanomzellen und die photoakustische Flow System empfindlich auf 1 Zelle / ul (unveröffentlichte Daten) bewährt. Diese Studien sind im Gange und wird bald auch Studien mit Krebspatienten Proben.

Diese photoakustischen Technik wird auch für den Einsatz in nicht-pigmentierten CTC, wie Brust-und Prostatakrebs durch das Anbringen exogene Chromophore ausgewertet. Wir haben Vorarbeiten mit Gold-Nanopartikeln auf Krebs cells13 durchgeführt. Diese Tests haben gezeigt, dass Nanopartikel können die notwendigen optischen Absorption liefern, um photoakustische Wellen erzeugen. Die übrigen technischen Herausforderung besteht darin, solche Partikel, um Krebszellen gezielt an.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234