Photoacoustic Flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리

Summary

우리는 전이성 질환의 조기 지표로 흑색증 세포 순환 감지하는 레이저 유도 초음파를 사용하여 플로우 cytometer을 개발했습니다.

Abstract

순환 종양 세포 (CTCs)는 매크로 종양에서 분리하고 종자 보조 종양 ^1,2,3로 혈액과 림프 시스템을 통해 확산이있는 세포입니다. CTCs는 전이성 질환과 혈액 샘플에서 검출의 지표가 암을 진단하고 치료에 대한 환자의 반응을 모니터하는 데 사용할 수 있습니다되었습니다. CTCs가 희귀하기 때문에, 하나 종양의 첨단 암 환자에서 정상 혈액 세포 수십억 사이 세포들이 감지 및 열거에 대해 구성된 것은 어려운 작업입니다. 우리는 photoacoustic 생성하는 대부분의 흑색증 세포에서 색소의 존재를 이용하거나, 레이저 순환 흑색증 세포 (CMCs) ^4,5의 검출에 대한 사용자 지정 흐름 cytometer에 초음파를 유도. 이 과정은 원심 분리를 사용하여 백혈구 층을 얻기 전체 혈액 샘플을 분리 알아볼 수 있습니다. 전체 혈액에 존재하는 경우 CMCs 비슷한 밀도로 인해 백혈구로 구분됩니다. 이러한 세포에 resuspended 아르인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼와 유량계에 도입했다. 오히려 혈액 세포 현탁액의 지속적인 흐름보다, 우리는 더 나은 연구를 위해서 이러한 세포를 캡처하기 위해서는 두 단계 흐름을 유도. 2 상류에서 microfluidic 시스템에서 두 혼합할 액체는 액체 ^6,7의 총이 번갈아 가며 교차점과 양식에서 만나십시오. PBS는 순차적으로 레이저 빛이 조사 아르 백혈구 및 공기 양식 microliter의 총이 정지. 액상에 대한 계면 활성제의 또한 균일한 슬러그 형성이 가능하고 사용자는 두 단계의 흐름 속도를 변경하여 다른 크기의 굼벵이를 만들 수 있습니다. 백혈구와 공기와 PBS의 굼벵이의 총이 더 밝은 absorbers을 포함하지 않으며 따라서, photoacoustic 파도를 생성하지 않습니다. 그러나, 심지어 하나의 CMCs를 포함하는 백혈구의 슬러그 레이저 빛을 흡수하고 고주파 음향 파를 생성합니다. photoacoustic 파도를 생성하는이 굼벵이는 verific에 대한 압수 및 cytochemical 얼룩을 위해 수집됩니다CMCs의 ation.

Protocol

1. 혈액 샘플 준비

1. 이 5 ML vacutainers로 무대 IV의 암 환자에서 전체 혈액의 약 10 ML을 그립니다.
2. 분당 3,000 회전 (RPM) 10 분 동안 원심 튜브.
3. 혈액 샘플은 세 가지 다른 레이어로 분리됩니다 아래 계층은 또한 버피 코트라는 적혈구, 중간 계층, 구성되어 leukocytes와 흑색증 세포를 포함하고, 상위 레이어는 플라즈마와 혈소판이 포함되어 있습니다. 버피 코트를 방해하지 않고 가능한 한 많은 플라즈마로 제거합니다.
4. 이 한 ML의 Wintrobe 튜브에 Histopaque 1077의 장소 250 μL.
5. 9 "파스퇴르 피펫을 사용하여 <500 μL를 수집해야하고, 나머지 플라즈마, 전체 버피 코트, 심지어 적혈구의 상단 레이어를 추출합니다.
6. Histopaque 레이어 위에 솔루션을 놓고 3,000 rpm으로 10 분 15 ML 원뿔 튜브에 Wintrobe 튜브를 원심 분리기.
7. 피가 다시 것입니다별도의지만이 시간은 적혈구가 버피 코트 쉽게 추출 수있게 Histopaque로 구분됩니다. 전체 버피 코트를 구하여 2 ML eppendorf 튜브에 배치 9 "파스퇴르 피펫을 사용합니다.
8. 2퍼센트 V / V 십대 초반에 20 PBS의 1.5 ML에서 버피 코트를 일시 중지합니다.

2. 흐름 상공 회의소 건설

1. 아크릴 실린더, 20mm 외경, 17mm 내경 및 높이 8mm를 구합니다. 서로 90도 각도에서 실린더의 측면을 통해 세 5mm 직경의 구멍을 드릴. 폴리머 튜브의 세 가지 (1.6 mm 내경, 외경 5mm)를 잘라 및 뚫고 구멍에 그들을 놓습니다.
2. 물이 꽉 도장을 만들기 위해 아크릴 반지의 맨 아래에 Parafilm을 부풀. parafilm은 아크릴 반지 얕은 그릇을 형성하고 흐름 챔버를 형성됩니다 아크릴 아미드 솔루션을 개최합니다.
3. 맞은편에 아르 튜브의 조각을 통해 1.6 mm 직경의 와이어를 일시 중지혼자 와이어 반지의 중간으로 볼 수 있는지 서로하고. 1.6 mm 직경의 와이어와 위치 떨어져 정지 와이어에서 튜브 1mm로 튜브의 세 번째 부분을 입력합니다. 이 전선은 튜브 입력에서 아크릴 아미드되지 않습니다. 아크릴 아미드가 굳은 후 와이어가 광섬유를 위치로 원통형 흐름 경로와 장소를 떠나, 추출됩니다 유동 경로에 초점을 맞추고 있습니다.
4. 준비 아크릴 아미드의 5 ML 추가 [20g의 아크릴 아미드 (시그마 알드리치), 0.7 g의 bisacrylamide (시그마 알드리치), 증류수 100 ML] 작은 비커 수 있습니다. 암모늄 persulfate (시그마)의 0.02 g을 측정하여 비커에 추가합니다. 3 분 저어 막대와 함께 섞는다. 비커 20 μL tetramethylethylenediamene (피셔 과학)를 추가합니다. 빨리 가기 작성, 아크릴 반지에 혼합물을 따라줘. 몇 초 후, 솔루션 젤, 흐름 챔버 금형을 만드는 것입니다. 조심스럽게 아크릴 아미드 젤을 방해하지 않도록하고, 전선을 빼낸다. 흐름 chamBER은 이제 사용할 준비가되었습니다.

3. Photoacoustic flowmetry 설정

1. 아쿠 스틱으로 몇 직접 유동 경로 위에 초음파 젤을 사용하여 흐름 챔버에 polyvinylidene 불소 압전 음향 변환기 (Panametrics).
2. 총검 닐 - Concelman (BNC) 케이블을 사용하여 RITEC 광대역 수신기 - 640A의 입력 (아웃, highpass 필터 : 1 MHz 이상, imput 임피던스 : 50 Ohms, 증폭 : 35dB 로우 패스 필터)로 변환기를 연결합니다. 오실로 스코프 (텍트로닉스 TDS 2024B)로 필터의 출력을 연결합니다. 오실로 스코프를 트리거하려면, photodiode (Thorlabs)은 변환기 근처에 설치되고 BNC 케이블을 사용하여 오실로 스코프에 연결됩니다.
3. T - 커넥터 (소형 부품)은 흐름 챔버의 팔 하나에 첨부되어 있습니다. 두 개의 주사기 펌프 (Braintree 과학)은 커넥터의 다른 지점으로 연결됩니다. 다른 부분은 1에서 준비한 세포 현탁액을 포함하면서 하나의 주사기, 공기가 포함되어 있습니다. 에 흐름 속도를 설정100 μL / 분.
4. 공기 형태의 작은 포켓까지 흐름 챔버의 작은 튜브를 추출, 그 슬롯에 0.37 수치 조리개와 1mm 직경 코어 광섬유를 삽입합니다. 인터페이스 신호를 줄이고 유동 경로에 적용되는 레이저 빛의 양을 증가 물로 주머니를 채우십시오. 광섬유와 흐름 경로로 짧은 거리의 수치 조리개로 인해, 레이저는 직접 레이저의 앞에 샘플 photoacoustic 신호를 만드는 동일한 예제입니다 있도록, 주어진 시간에 샘플 중 하나 탄환을 비추다 것입니다. 레이저 에너지는 7mm ² 스폿 크기가 약 28 MJ / cm ^{2되어야합니다.}
5. 양쪽 주사기 펌프를 켜십시오. 두 혼합할 유체의 T - 접합에 도달했을 때 그들은 균질 슬러그와 변환기 과거 흐름으로 분할됩니다.
6. nanosecond가 흑색증 세포에서 photoacoustic 파도를 생성하는 레이저를 펄스로 흐르는 샘플을 비추다. 멜라닌은 broadb이므로그리고 흡수 광, 가시적인 레이저 파장을 사용하실 수 있습니다.
7. 탄환이 변환기 위에 때 신호가 오실로 스코프에 나타나는 경우, 총알은 흑색증가 포함되어 있으며, 수집 약병에 낙하 때까지 시스템을 통해 추적한다.

4. Immunocytochemistry

1. 유리 슬라이드에 문제를 해결하기 위해 Cytospin 4 원심 분리기 (써모 과학)로 캡처한 총이 가져가라. 장소 유리 Cytofunnels로 슬라이드 (브라운 필터 카드 써모 과학로 Shandon EZ 싱글 Cytofunnel)하고 Cytospin 4 원심 분리기로 그들을로드합니다. 각 깔때기에 PBS에 (시그마) 1퍼센트 소 혈청 알부민의 100 μL를 넣고 다음 캡처한 세포가 유리 슬라이드에 충실 도와 삼분 600 rpm으로 원심 분리기.
2. 원심 분리 후, Cytofunnels에 세포 샘플을 추가하고 다음 3 분 600 rpm으로 원심 분리기. 그렇다면 에탄올 기반 정착액으로 슬라이드를 스프레이.
3. 두 번 10 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오.
4. 부화 후, 실온에서 humidified 챔버 1 시간 동안 기본 항체 솔루션 슬라이드와 부화를 가만히 따르다. 각 슬라이드는 1 %의 토끼에서 제기된 마트 - 1 항체, 1 % 마우스에서 제기된 CD - 45 항체, 10 % 염소 혈청과 89% PBS를 포함해야합니다.
5. 부화 후 10 분 세 번이나 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오.
6. 슬라이드는 다음 형광단 항체에 바인딩된있는 차 항체 용액에 incubated 수 있습니다. 혼합물은 안티 - 토끼 항체 0.05 % 염소, 0.05 %의 염소 안티 - 마우스 항체, 0.1 %의 염소 혈청과 99% PBS가 포함되어 있습니다. 슬라이드는 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 incubated 수 있습니다.
7. 부화 후, 슬라이드 5 분 세 번위한 PBS로 세척 가만히 따르다.
8. 핵에 대한 얼룩, DAPI의 0.1 μg / ML (Invitrogen)에있는 세포를 품어일분. 다음 슬라이드를 가만히 따르다하고 PBS로 세척.
9. 슬라이드 당 수지 기반 설치 미디어를 20 μL를 사용하여 세포 샘플을 통해 coverslip를 탑재합니다. 슬라이드를 보존하기 위해 투명 매니큐어로 coverslip을 봉쇄해. 이제 슬라이드는 형광 현미경으로 몇 군데 준비하고 있습니다.

5. 대표 결과 :

그림 1. 백혈구 및 흑색증 세포에서 photoacoustic 파형이 여기에 표시됩니다. 백혈구는 아무 고유의 착색 필요 없다, 전자 노이즈의 평평한 라인 (왼쪽)와 같은 더 photoacoustic 파도와 매니 페스트를 생성하지 않습니다. 색소 흑색증 세포는 강력한 photoacoustic 웨이브 (오른쪽) 생산하고 있습니다.

그림 2. immunocytochemical 얼룩 후, 교양 흑색증 전지는 BL에 DAPI 신호를 표시UE 동안 MART1는 녹색으로 강조 표시됩니다.

그림 3. leukocytes의 지표로서 CD45와 그림 2에서, DAPI와 MART1에 대한 이미지를 오버레이,이 수치는 여러 가지 백혈구 사이 흑색증 세포를 보여줍니다.

Discussion

CTCs을 감지하면 드문 종양 세포를 분리의 어려운 문제로 인해 거의 임상 응용 프로그램과 함께 여전히 연구 집약적인 분야입니다. 많은 다른 기술은 RT - PCR, microfluidic 세포 캡처, immunomagnetic 캡처 및 기타 방법 ^8-12 포함하여 CTC 탐지에 대한 평가되고있다. 그것은 무료 레이블이고 작은 빛을 흡수 입자를 포착하는 신속하고 정확한 방법을 제공하는 그러나, CMCs 쇼 photoacoustic 감지 약속 해요.

프로토콜 백혈구를 분리하기 위해 설명하는 것은 매우 효율적이며, 아직 적혈구의 낮은 숫자가 샘플에 존재한다. 이 루즈 오염 세포는 레이저 빛을 흡수하지만 크게 감소 수준. 적혈구 우리 흑색증 탐지 시스템을 방해하지 않도록하기 위해 다섯 건강한 환자 샘플은 시스템을 통해 소개되었으며 아무도 적혈구가 낮은 정도의 농도에서 존재하는 나타내는 신호를 준 없습니다무시됩니다.

집중 연구의 일련 교양 흑색증 세포를 사용하고 photoacoustic 흐름 시스템이 민감한 아래 1 셀 / μL (게시되지 않은 데이터)에 입증되었습니다 실시되었습니다. 이러한 연구는 가고있다 곧 암 환자 샘플을 사용하여 시험이 포함됩니다.

이 photoacoustic 기술은 또한 외인성 chromophores을 첨부하여 유방암과 전립선 암 등 비 색소 CTCs에 사용하기 위해 평가되고 있습니다. 우리는 암 cells13에 금 nanoparticles를 사용하여 예비 작업을 수행했습니다. 이 테스트는 nanoparticles가 photoacoustic 파도를 생성하는 데 필요한 광학 흡수를 제공할 수 것으로 나타났습니다. 나머지 기술 과제는 선택적으로 암세포에 이러한 입자를 첨부하는 것입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234